本發(fā)明涉及制取降血脂肽方法
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種用水蛭制取降血脂肽的方法。
背景技術(shù)：
：本部分中的陳述僅僅提供了與本發(fā)明公開的內(nèi)容有關(guān)的背景信息，且可能不構(gòu)成現(xiàn)有技術(shù)。食源性蛋白經(jīng)酶解得到的水解產(chǎn)物大部分是幾個氨基酸殘基組成的短肽，這些短肽以完整的形式被吸收進入循環(huán)系統(tǒng)而被組織利用，具有許多生理活性：抗氧化，提高免疫力，抗菌消炎,降血脂,促進微量元素的被動轉(zhuǎn)運過程及在體內(nèi)儲存、抗高血壓活性等。HMG-Co還原酶是體內(nèi)催化3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A(HMG-CoA)生成二羥甲基戊酸(MVA)的關(guān)鍵酶，這一步是體內(nèi)合成膽固醇的限速步驟，也是目前最主要的高血脂癥臨床藥物的靶點。HMG-CoA還原酶抑制劑是降血脂功效成分和藥物篩選主要手段之一。從蛋白質(zhì)經(jīng)酶解產(chǎn)生的降血脂肽具有食用安全性高、無副作用、療效好的優(yōu)點，近年來受到廣泛關(guān)注。目前人們已經(jīng)成功的從大豆、大米、土豆、蕎麥、鱈魚、大西洋鮭、鰱魚、蠶蛹、乳清蛋白中獲得了HMG-CoA還原酶抑制肽。但上述研究分離方法成本高，規(guī)模化生產(chǎn)的成本也較高，并且原料多為人們的生活食物。九十年代后期，國內(nèi)外關(guān)于蛋白酶解肽的研究主要圍繞在蛋白質(zhì)的水解度、分子量大小、游離氨基酸含量、生物酶重復(fù)利用以及對苦味的控制和去除等。目前，市場上使用的降脂藥物大都為化學(xué)合成的他汀類藥物，雖然其對改善由高血脂引起的心腦血管疾病有很好的療效，但長期使用會有帶來一系列的不良反應(yīng)和副作用。水蛭作為一味傳統(tǒng)中藥，歷史悠久，中醫(yī)認為水蛭有破血、逐淤、通經(jīng)等功效。自從二十世紀五十年代從醫(yī)用水蛭中分離出具有抗凝作用的物質(zhì)一水蛭素后，國內(nèi)外已對其進行了廣泛而深入的藥理學(xué)研究。但現(xiàn)有技術(shù)尚未涉及從水蛭中提取降血脂肽的方法。傳統(tǒng)中藥的服用也是用水煮分解并提取(干品)水蛭中的多肽物質(zhì)，只是用水煮方式得到的水蛭多肽物質(zhì)非常有限。故現(xiàn)有技術(shù)有待改進和發(fā)展。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種分離方法成本低的用水蛭制取降血脂肽的方法。本發(fā)明的技術(shù)解決方案是：一種用水蛭制取降血脂肽的方法，包括將天然水蛭凈化、磨漿、酶解、滅酶、離心分離、超濾和冷凍干燥，最終得到的水蛭制取降血脂肽。S1：水蛭的耐饑餓能力較強，一次吸飽血后能夠多天甚至數(shù)月不進食，而食物殘留會影響到最終的酶解產(chǎn)物。動物在缺氧條件下會發(fā)生嘔吐，這樣可除去水蛭體內(nèi)未消化的食物。將洗凈的水蛭放入壓力為90-95kPa的減壓容器中放置3-5h后，清洗瀝干；S2：在S1得到的水蛭中加入上述水蛭重量3-5倍,濃度在3mg/L～6mg/L臭氧水中維持5min～10min，以殺滅水蛭表面微生物再調(diào)節(jié)pH值為6.8～7.2。S3：S2后在勻漿機中攪拌3-6min后，靜置3-5h，得勻漿液；S4：升溫至85℃～95℃并保溫8min～12min后自然冷卻至45℃～50℃；再加入中性蛋白酶進行酶解反應(yīng)，將酶解反應(yīng)所得產(chǎn)物升溫至95℃～105℃并保持此溫度10min～15min，再自然冷卻至室溫以終止酶解反應(yīng)；離心，得酶解液；S5：將步驟S4得到的酶解液加入轉(zhuǎn)速為9000-10000rpm的離心機中離心8-12min，留上清液，再采用超濾膜進行超濾處理，截留分子量8k的超濾膜，得超濾酶解液；在溫度為-60℃～-70℃，真空度為15-20pa條件下冷凍2-4h，然后在溫度為40-50℃干燥10-12h，即得水蛭降血脂肽。天然水蛭凈化步驟是在缺氧條件下進行的。S4中的酶解反應(yīng)中每克蛋白質(zhì)加入2000～4000u且酶解3-6小時。S5中采用超濾膜進行超濾處理其工作條件是0.1～0.2Mpa的工作壓力和0～45℃的工作溫度。本發(fā)明的有益效果：用水蛭制取降血脂肽的方法，包括將天然水蛭凈化、磨漿、酶解、滅酶、離心分離、超濾和冷凍干燥，最終得到的水蛭制取降血脂肽，該方法分離方法成本低，規(guī)模化生產(chǎn)的成本也較低，并且水蛭作為傳統(tǒng)中藥具有破血、逐淤、通經(jīng)等功效。具體實施方式實施例：一種用水蛭制取降血脂肽的方法，包括將天然水蛭凈化、磨漿、酶解、滅酶、離心分離、超濾和冷凍干燥，最終得到的水蛭制取降血脂肽。具體步驟如下：S1：將洗凈的水蛭放入壓力為90-95kPa的減壓容器中放置3-5h后，清洗瀝干；S2：在S1得到的水蛭中加入上述水蛭重量3-5倍,濃度在3mg/L～6mg/L臭氧水中維持5min～10min，以殺滅水蛭表面微生物。S3：S2后在均質(zhì)機中攪拌3-6min后，再調(diào)節(jié)pH值為6.8～7.2，靜置3-5h，得勻漿液；S4：升溫至85～95℃并保溫8～12min后自然冷卻至45℃～50℃；再加入中性蛋白酶進行酶解反應(yīng)，將酶解反應(yīng)所得產(chǎn)物升溫至95～105℃并保持此溫度10～15min，再自然冷卻至室溫以終止酶解反應(yīng)；在步驟S1中減壓與未減壓的對照數(shù)據(jù)如下表:未減壓處理前(瀝干)減壓處理清洗后(瀝干)27.4kg26.1kg酶解液實驗對照數(shù)據(jù):如下S5：將步驟S4得到的酶解液加入轉(zhuǎn)速為9000-10000rpm的離心機中離心8-12min，留上清液，再采用超濾膜進行超濾處理，截留分子量8k的超濾膜，得超濾酶解液；在溫度為-60℃～-70℃，真空度為15-20Mpa條件下冷凍2-4h，然后在溫度為40-50℃干燥10-12h，即得水蛭降血脂肽。按照已經(jīng)公開發(fā)表的專利號為201110073398.8的《一種檢測HMG-CoA還原酶活性的改良分光光度法》進行檢測，測得其IC50為0.96mg/ml。作為優(yōu)選，天然水蛭凈化步驟是在缺氧條件下進行的。進一步，S4中的酶解反應(yīng)中每克蛋白質(zhì)加入2000～4000u且酶解3-6小時。更為進一步的是，S5中采用超濾膜進行超濾處理其工作條件是0.1～0.2Mpa的工作壓力和0～45℃的工作溫度。用水蛭制取降血脂肽樣品于GEL-HPLC中進樣以后，用液相數(shù)據(jù)處理軟件將水蛭降血脂肽的凝膠色譜數(shù)據(jù)代入校正曲線方程中進行計算，得到樣品的肽的相對分子質(zhì)量及其分布范圍。分子量1000Da以下組分中的二肽、三肽的在人體內(nèi)的吸收利用率極高，具有比游離氨基酸更高的營養(yǎng)價值，但不分子量卻有不同生理功能。用同樣方法測得天然水蛭素是由65～66氨基酸組成的低分子多肽，其分子量僅為7000道爾頓。天然水蛭素是迄今為止世界上所發(fā)現(xiàn)的最強的天然抗凝血酶物質(zhì)，對人類心腦血管疾病尤其是腦血栓等血栓性疾病有特效，其防治效果是任何物質(zhì)所不能比擬的。本發(fā)明以功能肽的分子量7000Da作為分子量范圍界值，用峰面積歸一化法計算了用水蛭制取降血脂肽的相對分子質(zhì)量分布范圍，由分子量分布結(jié)果可以看出，分子量小于7000Da的組分總共占93.05％。將按照已經(jīng)公開發(fā)表的專利號為201110073398.8的《一種檢測HMG-CoA還原酶活性的改良分光光度法》進行檢測，測得其IC50為0.63mg/ml。用管式離心機將酶解液離心，轉(zhuǎn)速14000r/min，分離出清液和渣料，留用離心清液。將上述清液用孔徑0.06μm的微濾和超濾設(shè)備進行過濾，條件為壓力0.3MPa，溫度55℃，制得澄清的用水蛭制取降血脂肽透過液。酶解液加入轉(zhuǎn)速為9000-10000rpm的離心機中離心8-12min，留上清液，再采用超濾膜進行超濾處理，截留分子量8k的超濾膜，得超濾酶解液；在溫度為-60℃～-70℃，真空度為15-20Mpa條件下冷凍2-4h，然后在溫度為40-50℃干燥10-12h，即得水蛭降血脂肽。將本發(fā)明所制得水蛭降血脂肽用《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》(2003年版)進行動物實驗，并與孔徑不同截留分子量的膜過濾物進對照實驗，其結(jié)果如下：由此可判斷，唯有本發(fā)明分子量段的樣品有降血脂功能在本說明書的描述中，術(shù)語“一個實施例”等的描述意指結(jié)合該實施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或特點包含于本發(fā)明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術(shù)語的示意性表述不一定指的是相同的實施例或?qū)嵗６遥枋龅木唧w特征、結(jié)構(gòu)、材料或特點可以在任何的一個或多個實施例或示例中以合適的方式結(jié)合。以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。當前第1頁1 2 3