本發(fā)明屬于生物科學(xué)領(lǐng)域，涉及microRNA的檢測。
背景技術(shù)：
：MicroRNA是長度為22～25個核苷酸的單鏈小RNA，其不編碼蛋白，但可以通過抑制同源mRNA的表達(dá)或誘導(dǎo)其降解而對mRNA進(jìn)行調(diào)控，從而影響相關(guān)蛋白的生成。MicroRNA種類很多，表達(dá)位置和用途各不相同。其中，microRNA-34a在腦、心肌、肺、肝臟、前列腺、神經(jīng)組織中有廣泛表達(dá)，能夠與多種基因的mRNA非特異性結(jié)合，常被用于研究在腫瘤發(fā)生中以及各系統(tǒng)疾病的病理生理過程中所起的作用。例如，肝細(xì)胞癌(HCC)是一種惡性程度極高的癌癥，在全球的發(fā)病率和病死率均非常高。對于該病的研究持續(xù)多年，目前的治療方法也多種多樣，但總體的預(yù)后依然很差，這是由于肝細(xì)胞癌的早期診斷方法以及結(jié)果敏感性有局限。基于前人的研究成果，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了HCC組織中microRNA-34a的表達(dá)水平明顯低于正常組織和癌旁組織，在轉(zhuǎn)移性癌組織中microRNA-34a的表達(dá)水平明顯低于非轉(zhuǎn)移性癌組織；它在HCC組織中的表達(dá)與腫瘤惡性程度、腫瘤個數(shù)、腫瘤體積、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度、TNM分期密切相關(guān)，與其它因素，如患者年齡、性別、肝功能、腫瘤部位等無相關(guān)性。同時，還發(fā)現(xiàn)microRNA-34a與其靶標(biāo)Notch1在HCC及癌旁組織中均負(fù)相關(guān)(MicroRNA-34a、Notch1在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)以及臨床意義，于泳等，世界華人消化雜志，2014年第22卷第14期)。在上述的肝細(xì)胞癌中，microRNA-34a在病灶區(qū)和癌旁區(qū)的表達(dá)量會有所不同；而在另一些情況下，外周血中的microRNA-34a的表達(dá)量與一些疾病的發(fā)生有相關(guān)性。例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肺癌、阿爾茨海默癥中，外周血的microRNA-34a的表達(dá)量發(fā)生變化。現(xiàn)有技術(shù)對于microRNA-34a的研究已經(jīng)取得了很多有價值的結(jié)論，針對它的研究依然繼續(xù)。本領(lǐng)域中依然有能夠精確檢測microRNA-34a的表達(dá)量的需要。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明針對microRNA-34a的PCR檢測，提供一種能夠有效擴(kuò)增microRNA-34a的體系和方法。在第一個方面，本發(fā)明的microRNA-34a的檢測體系包括逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系和PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系，其中，所述逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系包括逆轉(zhuǎn)錄引物，所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系包括PCR正向引物和PCR反向引物；其中，逆轉(zhuǎn)錄引物的序列為：GAGTTGACTGTCCTGGACTGGTGGTACGTCAACTCACAACCAGC(SEQIDNO:1)；PCR正向引物的序列為：CTGGTCCTGGCAGTGTCTTG(SEQIDNO:2)；PCR反向引物的序列為：ACTGTCCTGGACTGGTGG(SEQIDNO:3)。優(yōu)選地，所述逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系還包括逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTP、逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、MgCl2、RNA酶抑制劑、無RNA酶水。優(yōu)選地，所述PCR反應(yīng)體系還包括DNA聚合酶、PCR緩沖液、dNTP。進(jìn)一步地，在第二個方面，本發(fā)明提供一種microRNA-34a的檢測試劑盒，包括逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中使用的逆轉(zhuǎn)錄引物和PCR擴(kuò)增反應(yīng)中使用的PCR正向引物和PCR反向引物；逆轉(zhuǎn)錄引物的序列如SEQIDNO:1所示，PCR正向引物的序列如SEQIDNO:2所示，PCR反向引物的序列如SEQIDNO:3所示。優(yōu)選地，所述檢測試劑盒還包括逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR擴(kuò)增反應(yīng)中所使用的其它試劑，如逆轉(zhuǎn)錄酶、逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、MgCl2、RNA酶抑制劑、無RNA酶水、DNA聚合酶、PCR緩沖液和dNTP。在第三個方面，本發(fā)明提供檢測microRNA-34a的方法，包括逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增兩個步驟，其中，所述逆轉(zhuǎn)錄步驟使用的逆轉(zhuǎn)錄引物的序列如SEQIDNO:1所示，PCR擴(kuò)增步驟使用的PCR正向引物的序列如SEQIDNO:2所示，所使用的PCR反向引物的序列如SEQIDNO:3所示。優(yōu)選地，所述逆轉(zhuǎn)錄步驟的反應(yīng)條件為25℃5min，42℃60min，60℃15min；所述PCR步驟的反應(yīng)條件為95℃1min，40個循環(huán)的95℃15s、58℃40s、72℃30s，72℃1min。本發(fā)明提供的逆轉(zhuǎn)錄引物、PCR正向引物和PCR反向引物能夠有效結(jié)合和擴(kuò)增microRNA-34a，檢測多種組織或血液中microRNA-34a的量。相比于常規(guī)指導(dǎo)設(shè)計的引物，其擴(kuò)增效率更高、更靈敏，特別適合microRNA-34a表達(dá)量低的情況的檢測。附圖說明圖1：使用本發(fā)明的檢測體系對正常肝細(xì)胞和肝細(xì)胞癌細(xì)胞的檢測結(jié)果，其中1為正常肝細(xì)胞檢測結(jié)果，2為肝細(xì)胞癌細(xì)胞的檢測結(jié)果；圖2：本發(fā)明的檢測體系與常規(guī)檢測體系的擴(kuò)增結(jié)果比較，其中1為本發(fā)明的結(jié)果，2為常規(guī)檢測體系的結(jié)果。具體實(shí)施方式下面將結(jié)合具體實(shí)施方式說明本發(fā)明，但本發(fā)明的內(nèi)容不限于此。以下實(shí)施例中，如未明確說明，則所使用的方法均為本領(lǐng)域常規(guī)的方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)完全可以知道如何實(shí)施所述方法并獲得相應(yīng)結(jié)果，所使用的試劑和儀器均為本領(lǐng)域常規(guī)試劑和儀器，可以通過常規(guī)的商業(yè)途徑獲得。根據(jù)NCBI查詢的結(jié)果，人microRNA-34a的成熟體序列為uggcagugucuugcugguugu。實(shí)施例1：microRNA-34a的擴(kuò)增1、miRNA的提取取正常肝細(xì)胞和肝細(xì)胞癌細(xì)胞(這兩種細(xì)胞獲取自本醫(yī)院的患者，患者知情同意做科學(xué)研究)的組織勻漿液，采用天根生物科技有限公司的miRNA提取試劑盒，按照說明書要求提取樣本中的miRNA：200μL樣本加入等體積的裂解液震蕩后靜置5min，然后加入5μL外源性參照cel-mir-39，按照說明書進(jìn)行操作，最后用30μL的去核酸水溶解miRNA。測定miRNA的濃度和純度，以A260/A280在1.6～2.2之間，濃度為2～20ng/μL的miRNA為模板做逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)，備用。2、逆轉(zhuǎn)錄將逆轉(zhuǎn)錄體系的各種試劑在室溫下溶解，震蕩混勻后置于冰上，并按照表1配制反應(yīng)液。表1：逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系組分每管體積(μL)miRNA模板2MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶(200單位/μL)(promega公司)0.4MMLV10倍逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液(promega公司)4dNTP混合物(10mmol)1.6RNA酶抑制劑(40單位/μL)0.4MicroRNA-34a逆轉(zhuǎn)錄引物(SEQIDNO:1)(1μmol)1cel-mir-39逆轉(zhuǎn)錄引物(1μmol)1無核酸水補(bǔ)充到40其中，cel-mir-39逆轉(zhuǎn)錄引物序列為：GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGATACGACCTGTTTCCT。兩管的模板分別為正常肝細(xì)胞和肝細(xì)胞癌細(xì)胞的miRNA。將配好的反應(yīng)體系充分混勻并將液體輕離心至反應(yīng)管底部，置于PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的條件為：25℃5min，42℃60min，60℃15min。反應(yīng)結(jié)束后置于冰上。3、PCR擴(kuò)增反應(yīng)按照下表2配制PCR擴(kuò)增體系：表2：PCR擴(kuò)增體系其中，cel-mir-39的探針為JUP-TGCACTGGATACGACCAAGCT-JUP，正向引物為CAGAGTCACCGGGTGTAAAT，反向引物為CAGTGCGTGTCGTGGAGT；microRNA-34a的探針為MAR-TGCACTGGATACGACGCTGGT-MAR。將反應(yīng)物混勻，在以下條件下進(jìn)行反應(yīng)：95℃1min，(95℃15s，58℃40s，72℃30s)40個循環(huán)，72℃1min。在AppliedBiosystems的實(shí)時熒光定量PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)。對正常組織中獲得的PCR結(jié)果進(jìn)行測序。測序結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致。由圖1的結(jié)果可見，本發(fā)明的檢測體系能夠擴(kuò)增出microRNA-34a，在正常組織中的表達(dá)量高于肝細(xì)胞癌中的表達(dá)量，這與之前的研究結(jié)果一致，可見本發(fā)明的檢測體系能夠有效地反應(yīng)出檢測樣本中的microRNA-34a的量。實(shí)施例2：不同擴(kuò)增引物的檢測結(jié)果本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，PCR反應(yīng)擴(kuò)增的關(guān)鍵因素包括引物與模板的匹配度、引物的擴(kuò)增效率、Taq酶的效率、緩沖液的質(zhì)量等，其中引物與模板的匹配度和引物的擴(kuò)增效率是設(shè)計引物時需要仔細(xì)分析、比較的方面，也是引物設(shè)計中最不容易預(yù)測效果的因素。通過軟件，如Primer等設(shè)計的高得分引物序列并不一定比低得分的引物序列具有更好的效果。因此，引物設(shè)計包括很強(qiáng)的創(chuàng)造性工作。關(guān)于miRNA的反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增，本領(lǐng)域已經(jīng)給出了很多引物設(shè)計思路，最常規(guī)的是使用莖環(huán)結(jié)構(gòu)引物，但針對不同模板，莖環(huán)結(jié)構(gòu)的序列以及與模板匹配的引物序列都會對擴(kuò)增結(jié)果產(chǎn)生影響。取正常肝細(xì)胞，以本發(fā)明的檢測體系和對照檢測體系進(jìn)行對比。其中，對照檢測體系的microRNA-34a的逆轉(zhuǎn)錄引物和PCR正向及反向引物均根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的指導(dǎo)進(jìn)行設(shè)計，具體為：逆轉(zhuǎn)錄引物：CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACAACCAG；PCR正向引物：ACACTCCAGCTGGGTGGCAGTGTCTTGC；PCR反向引物：TGGTGTCGTGGAGTCG；探針為：MAR-TGCACTGGATACGACGTCTTG-MAR。以與實(shí)施例1相同的方法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。由結(jié)果可見，本發(fā)明的擴(kuò)增體系能夠更有效地擴(kuò)增microRNA-34a，比對照檢測體系更敏感，擴(kuò)增效率更高，說明本發(fā)明的引物與模板的結(jié)合性更高，擴(kuò)增能力更強(qiáng)，適用于microRNA-34a表達(dá)量減少，比如患有癌癥的情況，從而可以更靈敏地檢測出microRNA-34a的表達(dá)量是否發(fā)生變化。實(shí)施例3：外周血單個核細(xì)胞中micro-34a的檢測取類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的外周血單個核細(xì)胞樣品20份(以下稱實(shí)驗(yàn)組)，健康對照人群的外周血單個核細(xì)胞樣品10份(以下稱對照組)，利用TRIzol法提取樣品中的總RNA，按照表3分別配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系。表3：逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系將配好的反應(yīng)體系充分混勻并將液體輕離心至反應(yīng)管底部，置于PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的條件為：25℃5min，42℃60min，60℃15min。反應(yīng)結(jié)束后置于冰上。以該反應(yīng)產(chǎn)物為模板，按照下表4配制PCR擴(kuò)增體系：表4：PCR擴(kuò)增體系組分體積(μL)dNTP混合液(10mmol)2MgCl2(25mmol)210倍Taq緩沖液(無Mg離子，TAKARA)2Taq(5單位/μL，TAKARA)0.2正向引物(SEQIDNO:2)(10μmol)0.4反向引物(SEQIDNO:3)(10μmol)0.4去核酸酶水補(bǔ)充到20將反應(yīng)物混勻，在以下條件下進(jìn)行反應(yīng)：95℃1min，(95℃15s，58℃40s，72℃30s)40個循環(huán)，72℃1min。將得到的產(chǎn)物進(jìn)行定量分析(以對照組中表達(dá)量最低的一個樣品測量值為基準(zhǔn)，對其它樣品的測量值進(jìn)行統(tǒng)一化表示)。對照組的結(jié)果分別為：1.00、1.22、1.07、1.46、1.23、1.52、1.18、1.05、1.33、1.29；實(shí)驗(yàn)組的結(jié)果分別為：5.32、1.87、6.09、3.26、3.85、2.74、1.96、4.26、2.48、6.65、4.37、3.80、4.48、1.44、2.51、2.24、5.08、4.68、3.97、3.53。由結(jié)果可以看出，對照的健康人群組中，microRNA-34a的表達(dá)量個體間差異不大，數(shù)值較低。而實(shí)驗(yàn)組中，個體間的表達(dá)量差異很大，有2個樣品的檢測值與對照組相差不大。將這些結(jié)果與已確定的診斷結(jié)果相對照，microRNA-34a的表達(dá)量與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的病程相符性達(dá)到75％。進(jìn)一步說明本發(fā)明的引物和檢測體系能夠有效擴(kuò)增microRNA-34a，對組織樣品和外周血樣品均有效。上述實(shí)施例僅用于表明本發(fā)明的引物和方法能夠靈敏、高效地檢測microRNA-34a，并不代表可以通過本發(fā)明的檢測microRNA-34a的方法來判斷疾病的存在或進(jìn)程。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，疾病是通過一些標(biāo)準(zhǔn)指標(biāo)表征的；而microRNA-34a在組織或血液中的變化僅是疾病的一個現(xiàn)象，不能作為診斷標(biāo)準(zhǔn)。序列表<110>中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院<120>MicroRNA-34a的檢測體系和方法<130>Y161264-OI<160>3<170>PatentInversion3.5<210>1<211>44<212>DNA<213>人工序列<220><223>microRNA-34a逆轉(zhuǎn)錄引物<400>1gagttgactgtcctggactggtggtacgtcaactcacaaccagc44<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>mircroRNA-34aPCR正向引物<400>2ctggtcctggcagtgtcttg20<210>3<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>microRNA-34aPCR反向引物<400>3actgtcctggactggtgg18當(dāng)前第1頁1 2 3