本發(fā)明屬于植物種質資源評價技術領域，具體涉及一種基于SSR分子標記構建甘薯核心種質資源庫的方法。

背景技術：

豐富的遺傳資源是新品種選育等各項研究工作的基礎。但是，由于實際工作中真正利用的資源數量有限，而資源數量太大不利于對種質資源進行全面的保存與利用。為此，Frankle于1984年提出了核心種質的概念，即通過科學的方法，從整個種質資源中選出能以最小的資源數量和遺傳重復最大限度保留整個資源遺傳多樣性的那部分資源，以此來深入評價和有效保護利用整體種質資源，并與Brown將其進一步發(fā)展，而原種質中除核心種質外的資源稱為保留種質，被用作核心種質的候補資源。

核心種質的構建有利于對種質資源進行有效的研究、評價、利用與保護，被許多國際育種工作者所關注。到目前為止，國內外己對50多個物種進行了核心種質的構建。中國在核心種質構建方面的研究起步較晚，但已在如綠豆、苜蓿、大豆、小麥、水稻、板栗、野生板栗、野蘋果、葡萄、李、桃、梨、果梅、普通杏、柚類、核桃、桃、柿、石榴和棗樹等作物上進行了研究。目前，關于甘薯核心種質的構建僅有少量報道，且是基于表型性狀數據研究構建方法。然而，甘薯農藝性狀多為數量性狀，其表現型值易于受環(huán)境條件影響而導致測量數據不準確，進而會影響核心種質構建結果的有效性。

簡單重復序列(Simple Sequence Repeat，SSR)，是一種基于PCR技術的分子標記，它能在分子水平上檢測個體的核苷酸差異，其具有多個優(yōu)點：

(1)在真核生物基因組中分布廣、多態(tài)性高；

(2)SSR產物進行凝膠電泳分離時堿基分辨率高、共顯性標記遺傳信息量大；

(3)呈孟德爾式遺傳，穩(wěn)定性好，技術要求低，成本低廉，可重復性高。

基于上述優(yōu)點，采用SSR標記構建甘薯核心種質，可克服田間農藝性狀多態(tài)性低和易受環(huán)境影響的缺點。

截止目前，尚未見有基于SSR分子標記的甘薯核心種質構建方法的相關報道。

技術實現要素：

本發(fā)明目的是提供一種基于SSR分子標記的甘薯核心種質資源庫的構建以及結合表型性狀進行評價的方法，該方法能夠高效、可靠的建立52份甘薯種質資源的核心種質，對甘薯種質資源的保存、評價及創(chuàng)新利用均具有重要意義。

為解決上述技術問題，本發(fā)明采用以下技術方案：

一種基于SSR分子標記構建甘薯核心種質資源庫的方法，包括如下步驟：

(1)采用備份保存方式進行甘薯種質資源的繁育和保存；

(2)采用植物基因組試劑盒進行甘薯種質資源DNA的提取，和瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量，并利用微量核酸蛋白檢測儀檢測DNA濃度；

(3)甘薯SSR引物的合成及多態(tài)性引物的篩選，得到14對多態(tài)性好的甘薯SSR引物；

(4)甘薯每份種質資源的PCR擴增及帶型記錄；

(5)依據SSR標記的帶型數據，采用兩種取樣方法和三種遺傳距離構建核心種質；

(6)采用多態(tài)性位點數(NPL)、多態(tài)性位點百分率(PPB)、觀測等位基因數(Na)、有效等位基因數(Ne)、Nei’s基因多樣性指數(H)和香農信息指數(I)來評價原種質、核心種質和保留種質的遺傳多樣性，分別對核心種質與原種質及保留種質的各指標進行t檢驗，來評價核心種質的代表性；

(7)利用表型數據采用主坐標分析法以及均值差異百分率(MD)、方差差異百分率(VD)、極差符合率(CR)和變異系數變化率(VR)對構建的甘薯核心種質進行進一步的驗證。

作為優(yōu)選，步驟(3)中所述的14對多態(tài)性好的甘薯SSR引物分別為引物對CB283-F和CB283-R、引物對CB223-F和CB223-R、引物對CB200-F和CB200-R、引物對CB144-F和CB144-R、引物對CB141-F和CB141-R、引物對CB940-F和CB940-R、引物對IB3-F和IB3-R、引物對IB8-F和IB8-R、引物對IB10-F和IB10-R、引物對IB12-F和IB12-R、引物對IB13-F和IB13-R、引物對IB16-F和IB16-R、引物對IB19-F和IB19-R、引物對IB21-F和IB21-R，其分別具有如SEQ ID No.1至SEQ ID No.28所示的序列。

作為優(yōu)選，步驟(4)中PCR擴增的反應體系為10uL，其中：2×Es Taq MasterMix(Dye)為5uL，引物5‘10uM和引物3‘10uM分別為0.4uL，模板DNA 100ng/uL為0.2uL，ddH₂O補足至10uL。

作為優(yōu)選，所述的2×Es Taq MasterMix(Dye)的終濃度為1×，所述的引物5‘10uM和引物3‘10uM的終濃度均為0.4uM，所述的模板DNA 100ng/uL是終濃度為20ng。

作為優(yōu)選，步驟(4)中PCR擴增的反應程序為：94℃預變性5min；94℃變性45s，45-62℃退火30s，72℃延伸45s，35個循環(huán)；72℃終延伸10min。

與現有技術相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

(1)本發(fā)明首次公開了一種基于SSR分子標記的甘薯核心種質資源庫的構建及評價方法。首先從保存的甘薯種質資源頂端嫩葉中提取DNA，然后通過篩選出的多態(tài)性SSR引物進行PCR擴增，根據擴增結果記錄各個種質資源的帶型數據。對獲得的SSR標記“0”、“1”數據進行分析，依據整體聚類取樣各組種質均能進入核心種質的原則，采用位點優(yōu)先取樣法結合Jaccard遺傳距離構建甘薯核心種質，同時利用表型數據進行評價確認。

(2)本發(fā)明的方法中SSR標記擴增帶型清晰穩(wěn)定，重復性好。同時，與基于農藝性狀表型數據構建核心種質比較而言，基于分子標記數據構建甘薯核心種質，具有省時省力、穩(wěn)定性好等特點。

(3)本發(fā)明的方法采用位點優(yōu)先取樣策略和Jaccard遺傳距離構建的52份核心種質，能夠以最小的資源份數最大限度地代表原種質的遺傳多樣性，代表性強，對甘薯核心種質資源的保存、評價與創(chuàng)新利用都具有重要意義。

附圖說明

圖1為不同取樣條件下2種取樣策略和3種遺傳距離保留的多態(tài)性位點數；

其中：SM-SM遺傳距離；J-Jaccard遺傳距離；N-Nei&Li遺傳距離；P-位點優(yōu)先取樣法；R-隨機取樣法。

圖2為位點優(yōu)先取樣策略構建的核心種質與原種質的主坐標圖；

其中，1-原種質，2-核心種質。

具體實施方式

下面結合具體實施例，對本發(fā)明作進一步詳細的闡述，但本發(fā)明的實施方式并不局限于實施例表示的范圍。這些實施例僅用于說明本發(fā)明，而非用于限制本發(fā)明的范圍。此外，在閱讀本發(fā)明的內容后，本領域的技術人員可以對本發(fā)明作各種修改，這些等價變化同樣落于本發(fā)明所附權利要求書所限定的范圍。

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實施例1：

1.材料與方法

1.1材料

378份甘薯種質資源分別來自于國內外甘薯種植區(qū)，分為4組，其中Ⅰ組來源于國內南方薯區(qū)(297份)，Ⅱ組來源于國內長江中下游薯區(qū)(51份)，Ⅲ組來源于國內北方薯區(qū)(23份)，Ⅳ組來源于國外(7份)，以上材料均種植于廣西農業(yè)科學院明陽基地甘薯種質資源圃中。

1.2方法

1.2.1材料的繁育和保存

甘薯種質資源均通過大田和溫室大棚兩種方式雙份保存于資源圃中。

1.2.2甘薯種質資源基因組DNA提取

在廣西農業(yè)科學院明陽基地甘薯種質資源圃中，選取378份甘薯種質資源(表1)植株的頂部嫩葉，利用康為世紀的新型植物基因組DNA提取試劑盒提取DNA。提取后的DNA通過瓊脂糖凝膠電泳檢測質量后，利用Nanodrop ND-2000超微量核酸蛋白測定儀檢測DNA濃度，并稀釋到所需濃度。

1.2.3 SSR引物的合成及多態(tài)性引物的篩選

通過查閱文獻找尋甘薯相關SSR引物序列，共查找到目標SSR引物72對，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。利用表型性狀差異明顯的兩份種質資源對72份引物進行篩查，篩選出多態(tài)性好的14對引物用于所有種質資源材料的PCR擴增，多態(tài)性引物見(表3)。

1.2.4甘薯每份種質資源的PCR擴增及帶型記錄

SSR-PCR反應采用康為世紀的2×Es Taq MasterMix(Dye)試劑進行PCR反應，擴增在BIO-RAD S 1000PCR儀上進行，擴增產物采用8％聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，采用硝酸銀進行銀染，并記錄帶型數據。具體PCR反應體系見表2和表3：

表1 SSR-PCR反應體系

表2 PCR反應程序

1.2.5依據SSR標記的帶型數據，構建核心種質并進行構建方法篩選和評價

1.2.5.1遺傳距離

采用NTSYSpc version 2.10e軟件使用UPGMA聚類法分別對SM遺傳距離、Jaccard遺傳距離和Nei&Li遺傳距離進行聚類。

1.2.5.2取樣策略

采用位點優(yōu)先取樣策略和隨機取樣策略對比構建核心種質。位點優(yōu)先取樣策略是指在聚類圖中，最先聚在一起的各組株系中，優(yōu)先選擇具有等位基因數最多的株系，若各組的兩個株系稀有等位基因數目相等，則優(yōu)先選擇具有最小等位基因頻率值的株系，若此數值仍然相同，那么進行隨機選擇，被選擇的株系再次進行聚類取樣；隨機取樣策略是指在聚類圖中，最先聚在一起的各組株系中，隨機保留某個株系，若某個組內只有一個株系，則直接被保留，被保留的株系再次進行聚類取樣。

1.2.5.3取樣原則

在進行整體聚類抽樣時應保證每個采樣點都有種質被抽取，如此進行逐步聚類直到其中某一組中再次聚類時無種質被抽取。

1.2.5.4核心種質的評價

原種質、核心種質和保留種質的遺傳多樣性采用多態(tài)性位點數(NPL)、多態(tài)性位點百分率(PPB)、觀測等位基因數(Na)、有效等位基因數(Ne)、Nei’s基因多樣性指數(H)和香農信息指數(I)來評價，以上參數采用POPGENE version 1.32軟件進行計算，利用DPS 14.50軟件分別對核心種質與原種質及保留種質的各指標進行t檢驗，來評價核心種質的代表性。

1.2.5.5核心種質的確認

核心種質的確認是利用表型數據及采用NTSYSpc version 2.10e軟件通過主坐標軸分析法來實現的，對核心種質與原種質間表型性狀的均值和方差分別進行F檢驗和t檢驗，用均值差異百分率(MD)、方差差異百分率(VD)、極差符合率(CR)和變異系數變化率(VR)來評價核心種質的代表性。

MD＝(St/n)×100％

其中n為性狀總數，St為原種質與核心種質進行t測驗時在0.05水平上均值差異顯著的性狀個數；

VD＝(SF/n)×100％

其中n為性狀總數，SF為原種質與核心種質進行F測驗時得到在0.05水平上方差差異顯著的性狀個數；

其中N為性狀總數，R_I(i)為原種質第i個性狀的極差，R_C(i)為核心種質第i個性狀的極差；

其中n為性狀總數，CV_I(i)是原種質第i個性狀的變異系數，CV_C(i)為核心種質第i個性狀的變異系數；

2.結果與分析

2.1 14對SSR引物的遺傳多樣性分析

表3 14對SSR引物的多態(tài)性分析

從表3可知，14對SSR引物擴增的條代數為12-32條，遺傳多樣性指數變化范圍在0.2580-0.4164之間，香農信息指數變化范圍在0.4075-0.6027之間。

2.2取樣方法比較及候選核心種質的確認

從圖1可以看出，與采用隨機取樣法相比較，隨著整體聚類取樣次數的增加，采用位點優(yōu)先取樣方法所構建的核心種質其多態(tài)性位點數減少的較少。

表4第5次取樣后甘薯種質資源的遺傳多樣性比較

結合圖1和表4的數據分析來看，SM遺傳距離、Jaccard遺傳距離和Nei&Li遺傳距離的有效等位基因數、Nei’s基因多樣性指數和香農信息指數均為位點優(yōu)先取樣策略高于隨機取樣策略。所以，位點優(yōu)先取樣策略要優(yōu)于隨機取樣策略。同時考慮到各組取樣數的問題，根據整體聚類取樣原則，在第六次取樣時，第Ⅳ組的甘薯種質未能進入核心種質，因此選取位點優(yōu)先取樣策略第五次取樣后的3個種質作為候選核心種質進行進一步的比較。

2.3候選核心種質的評價

表5原種質與3個候選核心種質t檢驗結果

三個候選核心種質SM-P、J-P和N-P的取樣數分別為52份、52份和53份。從表5遺傳多樣性各指標與原種質t檢驗結果可知，三個候選核心種質在觀測等位基因數、有效等位基因數、Nei’s基因多樣性指數和香農信息指數與原種質均無顯著差異。但J-P核心種質的有效等位基因數、Nei’s基因多樣性指數和香農信息指數與原種質的差值均數最大。

由此可見，采用位點優(yōu)先取樣策略和Jaccard遺傳距離選取52份種質時，構建的核心種質遺傳多樣性最豐富，能夠以最小的資源份數最大限度地代表原種質的遺傳多樣性，初步確定為甘薯種質構建核心種質的最優(yōu)取樣方法和取樣量。

表6原種質、核心種質(J-P)和保留種質遺傳多樣性對比

從表6可知，核心種質保留了原種質13.76的種質，保留種質保留了原種質86.24％的種質，核心種質的觀測等位基因數、多態(tài)性位點數、多態(tài)性位點百分率的保留率分別與保留種質持平，但核心種質的有效等位基因數、基因多樣性指數、香農信息指數的保留率分別高于保留種質，可見核心種質能很好的代表原種質。

表7核心種質(J-P)與保留種質t檢驗結果

同時，對核心種質和保留種質的觀測等位基因數、有效等位基因數、Nei’s基因多樣性指數和香農信息指數分別作t測驗發(fā)現(表7)，核心種質與保留種質的差異均不顯著，而有效等位基因數、Nei’s基因多樣性指數和香農信息指數均略大于保留種質，所以應優(yōu)先考慮核心種質。

2.4利用7對表型性狀數據對核心種質進行確認

采用主坐標和7個表型性狀對位點優(yōu)先取樣策略和Jaccard遺傳距離構建的核心種質的代表性進行確認(圖2)，核心種質遍布于整個主坐標圖，說明了核心種質的代表性。對核心種質和原種質的各表型性狀指標分別作t測驗(表8)，除葉片寬外，核心種質其余各性狀指標與原種質均無顯著差異。從表9可以看出，核心種質的均值差異百分率小于1％，極差符合率和變異系數變化率分別為89.69％和100.08％，均大于80％，所以所選核心種質能夠代表原種質的遺傳多樣性。研究結果從表型水平上進一步證明了位點優(yōu)先取樣策略和Jaccard遺傳距離是一種較適宜的甘薯核心種質構建方法。

表8原種質與核心種質表型性狀的遺傳變異

注：t0.05＝1.9600，t0.01＝2.5758；F0.05＝2.5700，F0.01＝3.9400

表9原種質與核心種質性狀差異百分率

3.結論

本發(fā)明首次將SSR分子標記技術用于甘薯核心種質的構建與評價。

表10 52份甘薯核心種質資源

結果如表10所示，采用位點優(yōu)先取樣策略和Jaccard遺傳距離構建的52份核心種質，能夠以最小的資源份數最大限度地代表原種質的遺傳多樣性，代表性強，對甘薯核心種質資源的保存、評價與創(chuàng)新利用都具有重要意義。

SEQUENCE LISTING

<110> 廣西壯族自治區(qū)農業(yè)科學院玉米研究所

<120> 一種基于SSR分子標記構建甘薯核心種質資源庫的方法

<130> ZYWS

<160> 28

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ccaattatag gcttcactcc ag 22

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ttaatgcagg caagcacgc 19

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

caatgctgag gctcctctga atc 23

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aggaagttcc cacagttctg acc 23

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aatccaaaga gaaaatggcg 20

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gcagatcaga gatgaccgaa g 21

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cgtcctgaat aaattgatcg 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

agcgagaggt ggttcttctg 20

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

agaagtgaag gaaagggc 18

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gttgctgttc attgttgttc 20

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

atccctattt cagctcac 18

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

agaccttcac tgcctttcc 19

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gtagagttga agagcgagca 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ccatagaccc attgatgaag 20

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ggcgacacct tagagtat 18

<210> 16

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

caccccctat tcacaa 16

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

ctacgatctc tcggtgacg 19

<210> 18

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

cagcttctcc actccctac 19

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

gatcgaggag aagctccaca 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

gccggcaaat taagtccatc 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

gtaccgagcc agacaggatg 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

cctttgggat tggaacacac 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

gacttccttg gtgtagttgc 20

<210> 24

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

agggttaagc gggagact 18

<210> 25

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

ggctagtgga gaaggtcaa 19

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

agaagtagaa ctccgtcacc 20

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

gacagtctcc ttctcccata 20

<210> 28

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

ctgaagctcg tcgtcaac 18