本發(fā)明屬于聚合物改性領(lǐng)域，具體涉及一種葡聚糖-co-聚乙二醇納米粒的制備方法。
背景技術(shù)：
納米粒是一種由天然或合成高分子材料制成的、粒徑在納米（nm）級(jí)別的、具有特殊的理化性質(zhì)和生理性質(zhì)的固態(tài)膠體顆粒。由于納米粒具有物理穩(wěn)定性好、比表面積大、靶向性等優(yōu)點(diǎn)越來(lái)越受到人們的關(guān)注。特別是在藥物傳遞領(lǐng)域，納米?？梢詫⑺幬锇裨趦?nèi)部，避免藥物被生物體內(nèi)的酸或酶降解；通過控制納米粒的原材料或制備條件可以制備出不同粒徑的納米粒，而不同粒徑的納米粒對(duì)生物體不同的器官具有靶向性，如：小于150 nm的納米粒靶向骨髓，小于250 nm的納米粒靶向體循環(huán)，大于250 nm的納米粒靶向脾等；納米粒還可以改變藥物對(duì)生物膜的通透性，利于藥物被生物體吸收等。因此，納米粒具有良好的開發(fā)及應(yīng)用前景。
葡聚糖又稱右旋糖酐，是一種天然多糖，存在于某些微生物在生長(zhǎng)過程中分泌的粘液中。葡聚糖具有較高的分子量，一般由腸膜明串珠菌發(fā)酵制備，可以溶于水和很多常見溶劑。葡聚糖在厭氧的革蘭氏陰性細(xì)菌的存在下可以迅速降解，這有利于設(shè)計(jì)基于葡聚糖的腸靶向載體。葡聚糖優(yōu)異的水溶性，生物安全性，降解性，抗蛋白吸附和無(wú)免疫原性等諸多特性使其有作為聚合物藥物載體的潛在可能。聚乙二醇是一個(gè)獨(dú)特的聚醚二醇，通常由水性環(huán)氧乙烷陰離子聚合而成。該聚合物屬兩性分子，既可溶于水也可溶于有機(jī)溶劑，并且無(wú)毒，可通過肝、腎功能消除。聚乙二醇在功能材料、生物、制藥等領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用，它通過對(duì)不同化合物進(jìn)行修飾，從而達(dá)到改善化合物水溶性，提高穩(wěn)定性和生物利用度的功能。
Diels-Alder反應(yīng)是一種有機(jī)環(huán)加成反應(yīng)，可以將共軛雙烯與取代烯烴反應(yīng)生成取代環(huán)己烯。利用2-富烯戊酸對(duì)葡聚糖進(jìn)行改性，并將2,3-二氯馬來(lái)酸酐接枝到聚乙二醇分子鏈中，通過Diels-Alder反應(yīng)來(lái)制備納米粒。所得納米粒呈現(xiàn)微觀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，有利于納米粒的溫定，也可增強(qiáng)納米粒負(fù)載藥物的能力。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的旨在提供一種葡聚糖-co-聚乙二醇納米粒的制備方法。本發(fā)明原材料價(jià)格低廉，納米粒制備條件溫和，無(wú)需有機(jī)溶劑，反應(yīng)時(shí)間短，且所得納米粒穩(wěn)定性高，粒徑均一、可控，可作為一種潛在的藥物載體。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
一種葡聚糖-co-聚乙二醇納米粒是是以2-富烯戊酸接枝的葡聚糖和2,3-二氯馬來(lái)酸酐改性的聚乙二醇為原料在水溶液中通過Diels Alder反應(yīng)制備而成。
制備方法為：在超聲振蕩下將0.25 g/mL 2,3-二氯馬來(lái)酸酐改性的聚乙二醇水溶液逐滴滴加到0.05 g/mL 2-富烯戊酸接枝的葡聚糖水溶液中，繼續(xù)超聲振蕩10 min，然后置于37 ℃水浴鍋中攪拌反應(yīng)6 h，即得所述葡聚糖-co-聚乙二醇納米粒。其中： 2-富烯戊酸接枝葡聚糖與2,3-二氯馬來(lái)酸酐改性的聚乙二醇的摩爾比為：1：1~3。
在上述制備方法中，2-富烯戊酸接枝的葡聚糖是將N,N-羰基二咪唑加入到0.10 g/mL 2-富烯戊酸的二甲基亞砜溶液中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)24 h。然后將0.12 g/mL葡聚糖的二甲基亞砜溶液加入上述體系，繼續(xù)室溫?cái)嚢璺磻?yīng)24 h，最后將反應(yīng)液置于透析袋透析3 d，冷凍干燥48 h制備而成。其中葡聚糖的分子量為：40000 Da；2-富烯戊酸、N,N-羰基二咪唑與葡聚糖結(jié)構(gòu)單元的摩爾比為：1:1:1；透析粗產(chǎn)物所用透析袋的截留分子量為：6000 Da。
在上述制備方法中，2,3-二氯馬來(lái)酸酐改性的聚乙二醇是將聚乙二醇與2,3-二氯馬來(lái)酸酐溶于甲苯中，在通氬氣下回流攪拌8 h，反應(yīng)完成后用乙醚沉淀，再進(jìn)行真空干燥得到的。其中：聚乙二醇的分子量為：2000 Da；聚乙二醇與2,3-二氯馬來(lái)酸酐的摩爾比為：1:4；回流溫度為120 ℃；沉淀所用乙醚體積為50倍體積的反應(yīng)混合液體積。
本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)在于：原材料生產(chǎn)工藝純熟，價(jià)格低廉，納米粒的制備條件溫和，可控性強(qiáng)，納米粒制備周期短，過程中不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，所制備的葡聚糖-co-聚乙二醇納米粒穩(wěn)定性高，負(fù)載藥物能力強(qiáng)。且本實(shí)驗(yàn)采用2,3-二氯馬來(lái)酸酐過量的方法提高2,3-二氯馬來(lái)酸酐改性的聚乙二醇的產(chǎn)量，在乙醚沉淀過程中過量的2,3-二氯馬來(lái)酸酐不會(huì)被沉降而存在于液體中被去除掉，不會(huì)產(chǎn)生雜質(zhì)。2-富烯戊酸、N,N-羰基二咪唑與葡聚糖結(jié)構(gòu)單元的摩爾比為1:1:1，更利于反應(yīng)的發(fā)生，減少雜質(zhì)的生成。本發(fā)明制備得到了穩(wěn)定性高，粒徑均一的葡聚糖-co-聚乙二醇納米粒；通過改變2-富烯戊酸接枝葡聚糖與2,3-二氯馬來(lái)酸酐改性的聚乙二醇的摩爾比（1:1，1:2，1:3），可得粒徑不同的葡聚糖-co-聚乙二醇納米粒。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明用下列實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于下列實(shí)施例。
實(shí)施例1
（1）2-富烯戊酸接枝葡聚糖的合成：將0.0012 mol 2-富烯戊酸溶解于2.00 mL二甲基亞砜，加入0.0012 mol N,N-羰基二咪唑，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)。 24 h后將溶解于4.00 mL二甲基亞砜的0.0012 mol葡聚糖（Mn = 40000）結(jié)構(gòu)單元加入上述體系，室溫反應(yīng)24 h。用透析袋（Mw = 6000 Da）透析3 d，冷凍干燥得2-富烯戊酸接枝的葡聚糖。
（2）2,3-二氯馬來(lái)酸酐改性的聚乙二醇的合成：將0.025 mol聚乙二醇（Mn = 2000）和0.1mol 2,3-二氯馬來(lái)酸酐溶解于20 mL甲苯中。在120 ℃通氬氣的條件下回流8 h，降溫后反應(yīng)液在1L乙醚中進(jìn)行沉淀分離。室溫下，真空干燥得到淡黃色固體。
（3）葡聚糖-co-聚乙二醇納米粒的制備：將5.06×10-6 mol 2-富烯戊酸接枝的葡聚糖用1.00 mL PBS配制成5.06×10-6 mol/mL的溶液，1.07×10-4 mol 2,3-二氯馬來(lái)酸酐改性的聚乙二醇用1.00 mL PBS配制成1.07×10-4 mol /mL的溶液。在超聲條件下將47.2uL 2,3-二氯馬來(lái)酸酐改性的聚乙二醇配溶液逐滴加入到1.00 mL 2-富烯戊酸接枝的葡聚糖溶液中，超聲10 min，于37 ℃條件下反應(yīng)6 h。
實(shí)施例2
（1）2-富烯戊酸接枝葡聚糖的合成：將0.0012 mol 2-富烯戊酸溶解于2.00 mL二甲基亞砜，加入0.0012 mol N,N-羰基二咪唑，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)。24 h后將溶解于4.00 mL二甲基亞砜的0.0012 mol葡聚糖（Mn = 40000）結(jié)構(gòu)單元加入上述體系，室溫反應(yīng)24 h。用透析袋（Mw = 6000 Da）透析3 d，冷凍干燥得2-富烯戊酸接枝的葡聚糖。
（2）2,3-二氯馬來(lái)酸酐改性的聚乙二醇的合成：將0.025 mol聚乙二醇（Mn = 2000）和0.1 mol 2,3-二氯馬來(lái)酸酐溶解于20 mL甲苯中。在120 ℃通氬氣的條件下回流8 h，降溫后反應(yīng)液在1 L乙醚中進(jìn)行沉淀分離。室溫下，真空干燥得到淡黃色固體。
（3）葡聚糖-co-聚乙二醇納米粒的制備：將5.06×10-6 mol 2-富烯戊酸接枝的葡聚糖用1.00 mL PBS配制成5.06×10-6 mol /mL的溶液，1.07×10-4 mol 2,3-二氯馬來(lái)酸酐改性的聚乙二醇用1.00 mL PBS配制成1.07×10-4 mol /mL的溶液。在超聲條件下將94.4uL 2,3-二氯馬來(lái)酸酐改性的聚乙二醇配溶液逐滴加入到1 mL 2-富烯戊酸接枝的葡聚糖溶液中，超聲10 min，于37 ℃條件下反應(yīng)6 h。
實(shí)施例3
（1）2-富烯戊酸接枝葡聚糖的合成：將0.0012 mol 2-富烯戊酸溶解于2.00 mL二甲基亞砜，加入0.0012 mol N,N-羰基二咪唑，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)。 24 h后將溶解于4.00 mL二甲基亞砜的0.0012 mol葡聚糖（Mn = 40000）結(jié)構(gòu)單元加入上述體系，室溫反應(yīng)24 h。用透析袋（Mw = 6000 Da）透析3 d，冷凍干燥得2-富烯戊酸接枝的葡聚糖。
（2）2,3-二氯馬來(lái)酸酐改性的聚乙二醇的合成：將0.025 mol聚乙二醇（Mn = 2000）和0.1 mol 2,3-二氯馬來(lái)酸酐溶解于20 mL甲苯中。在120 ℃通氬氣的條件下回流8 h，降溫后反應(yīng)液在1L乙醚中進(jìn)行沉淀分離。室溫下，真空干燥得到淡黃色固體。
（3）葡聚糖-co-聚乙二醇納米粒的制備：將5.06×10-6 mol 2-富烯戊酸接枝的葡聚糖用1.00 mL PBS配制成5.06×10-6 mol /mL的溶液，1.07×10-4 mol 2,3-二氯馬來(lái)酸酐改性的聚乙二醇用1.00 mL PBS配制成1.07×10-4 mol /mL的溶液。在超聲條件下將141.6 uL 2,3-二氯馬來(lái)酸酐改性的聚乙二醇配溶液逐滴加入到1.00 mL 2-富烯戊酸接枝的葡聚糖溶液中，超聲10 min，于37 ℃條件下反應(yīng)6 h。
表1葡聚糖-co-聚乙二醇納米粒的粒徑、粒徑分布及zeta電位
以上所述僅為本發(fā)明的制備方法，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。