本發(fā)明屬于微生物及生物能源技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于滸苔發(fā)酵制備沼氣的耐鹽微生物菌群獲得方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
滸苔（Enteromorpha）是綠藻綱、石莼科的一種大型綠藻，常見種類包括腸滸苔、扁滸苔、緣管滸苔、條滸苔等。滸苔具有頑強(qiáng)的生命力、較高的環(huán)境適應(yīng)性、較快的繁殖速度，因此，它的大量滋生會(huì)對(duì)同海域中其它藻類的生長造成很強(qiáng)的抑制作用。近年來，由于海洋環(huán)境污染加劇、海水的富營養(yǎng)化，導(dǎo)致了滸苔的惡性繁殖。同時(shí)，滸苔漂浮至海岸腐爛發(fā)臭不僅對(duì)環(huán)境造成了極大危害，而且威脅了沿海漁業(yè)及旅游業(yè)的發(fā)展。綠藻滸苔的爆發(fā)引起了社會(huì)的廣泛關(guān)注，但綠藻滸苔約含蛋白質(zhì)9%-24%，脂肪0.9%-2%，粗纖維8%-18%，可以作為生產(chǎn)沼氣的原料。
沼氣屬于二次能源，是可再生能源的一種，是有機(jī)質(zhì)經(jīng)過微生物厭氧發(fā)酵后產(chǎn)生的可燃性的混合氣體。沼氣的主要成分是甲烷（45~70%）和二氧化碳（25~55%），也含有一些少量的其它氣體，如一氧化碳、硫化氫、氫氣、氮?dú)獾?。沼氣發(fā)酵能降低原料中有機(jī)物的含量，降低環(huán)境污染。發(fā)酵結(jié)束后的沼渣可再次循環(huán)用于生產(chǎn)有機(jī)飼料及肥料。沼氣的低熱值為20-25MJ/m3，每立方米沼氣完全燃燒后可以產(chǎn)生0.7千克無煙煤的熱量。目前，世界各國已經(jīng)開始將沼氣用作燃料和用于照明，用沼氣代替汽油、柴油發(fā)動(dòng)機(jī)器的效果也很好。
在現(xiàn)有技術(shù)中，不乏使用微生物發(fā)酵滸苔生產(chǎn)沼氣的報(bào)道。如《不同預(yù)處理和發(fā)酵條件對(duì)滸苔沼氣產(chǎn)率的影響》、《顆粒大小和幾種預(yù)處理方法對(duì)滸苔厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣的影響》等文章對(duì)滸苔厭氧發(fā)酵生產(chǎn)沼氣做了報(bào)道，結(jié)果表明滸苔有良好的產(chǎn)氣潛力。專利CN 101418315A、CN 102876727A、CN 104642530A提供了多種以滸苔為原料生產(chǎn)沼氣的方法，但這些方法需要使用清水脫去滸苔中的鹽分或者以淡水配制發(fā)酵液，這是由于滸苔屬于海洋中的藻類，收獲后的滸苔攜帶大量海鹽，而以往的技術(shù)中使用的發(fā)酵菌群則通常是從湖泊污泥、溫泉淤泥、動(dòng)物糞便中富集獲得，對(duì)海鹽耐受能力不足，導(dǎo)致了利用滸苔發(fā)酵生產(chǎn)沼氣難以實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。可見，為解決目前滸苔發(fā)酵生產(chǎn)沼氣的工藝無法達(dá)到理想效果的問題，其亟待解決的問題是如何獲得一個(gè)具有耐鹽、高效的滸苔降解菌群。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種高效、耐鹽的微生物菌群的獲得方法，并通過該菌群實(shí)現(xiàn)高效、穩(wěn)定的滸苔降解與沼氣生產(chǎn)。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
一種用于滸苔發(fā)酵制備沼氣的微生物菌群獲得方法，包括以下步驟：
（1）收集潮間帶灘涂地表深度5-10 cm處的黑色泥沙及海水；
（2）將收集的泥沙及海水按質(zhì)量體積比1-5 g/100 mL加入?yún)捬醢l(fā)酵罐中，加入未清洗鹽分的滸苔，滸苔加入量為0.5-2 g/100 mL，然后調(diào)節(jié)體系pH值為7.0-7.5、鹽度為10‰-20‰，密封后于25~40℃下發(fā)酵15-30天進(jìn)行菌群馴化，發(fā)酵結(jié)束后使用2-4層無菌紗布過濾，分離發(fā)酵液及沼渣；
（3）將未清洗鹽分的滸苔加入所得發(fā)酵液中，使發(fā)酵罐中總固形物含量為0.5-5%，并按沼渣與發(fā)酵液的質(zhì)量體積比為1-3 g/100 mL加入所得沼渣，調(diào)節(jié)體系pH值為6.8-7.8、鹽度為10-20‰，于25~40℃下發(fā)酵15-30天，發(fā)酵結(jié)束后使用2-4層無菌紗布過濾，再次分離發(fā)酵液及沼渣；
（4）重復(fù)步驟（3）3-5次后，所得濾液即為含耐鹽微生物菌群ST.EP的菌液。
對(duì)所得菌群ST.EP中的古菌進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明，其包括如下主要微生物：產(chǎn)甲烷袋菌屬（Methanofollis），鬃毛甲烷菌屬（Methanosaeta），甲烷盤菌屬（Methanoplanus），甲烷囊菌屬（Methanoculleus），甲烷八疊球菌屬（Methanosarcina），甲烷螺菌屬（Methanospirillum），甲烷裂葉菌屬（Methanolacinia），甲烷繩菌屬（Methanolinea），熱裸單胞菌屬（Thermogymnomonas），甲烷食甲基菌屬（Methanomethylovorans），甲烷熱桿菌屬（Methanothermobacter），產(chǎn)甲烷菌屬（Methanogenium），甲烷微菌屬（Methanosphaerula）；
對(duì)所得菌群ST.EP中的細(xì)菌進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明，其包括如下主要微生物：熱球菌屬（Thermococcoides），海洋袍菌屬（Oceanotoga），螺旋菌屬（Sphaerochaeta），Kosmotoga屬，氨基桿菌屬（Aminobacterium），氨基單胞菌屬（Aminomonas），互營單胞菌屬（Syntrophomonas），糖發(fā)酵菌屬（Saccharofermentans），厭氧棒菌屬（Anaerobaculum），梭菌屬（Clostridium sensu strict），脫硫弧菌屬（Desulfovibrio），紅樹林桿菌屬（Mangroviflexus）以及擬桿菌門未分類細(xì)菌（Bacteroidetes）。
所得微生物菌群可用于滸苔發(fā)酵制備沼氣；其操作步驟為：將所得菌液加入發(fā)酵罐中，其加入量為發(fā)酵罐體積的40-80%，然后向發(fā)酵罐中加入未清洗鹽分的滸苔，其加入量為1-10g/100mL，同時(shí)調(diào)節(jié)體系鹽度在10-35‰之間，體系初始pH值在6.8-7.8之間；將發(fā)酵罐中的空氣排出進(jìn)行厭氧發(fā)酵，發(fā)酵溫度為25-40℃，批式發(fā)酵時(shí)間為15-30天，連續(xù)式發(fā)酵應(yīng)在日產(chǎn)氣量低于日均產(chǎn)氣量的20%時(shí)重新加料；發(fā)酵過程中維持pH值在6.5-8.0之間。
所述滸苔包括新鮮滸苔以及干燥滸苔，品種包含腸滸苔（Enteromorpha intestinalis），扁滸苔（E. compressa），緣管滸苔（E. linza），條滸苔（E. clathrat）中的一種或幾種；使用前將滸苔用閘刀、粉碎機(jī)等進(jìn)行組織破碎后更有利于發(fā)酵的進(jìn)行。
本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)在于：
（1）本發(fā)明所得菌群的耐鹽性高，可簡化滸苔發(fā)酵的前處理步驟，能達(dá)到節(jié)水節(jié)能的效果；
（2）本發(fā)明菌群獲得方法簡單，經(jīng)馴化后的耐鹽菌群穩(wěn)定性及降解效率高；
（3）經(jīng)長期應(yīng)用實(shí)踐結(jié)果表明，利用本發(fā)明菌群降解滸苔，其平均降解率大于75%，15d的積累產(chǎn)沼氣量達(dá)250-300 mL/g，甲烷濃度可達(dá)55-65%。
具體實(shí)施方式
為了使本發(fā)明所述的內(nèi)容更加便于理解，下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明所述的技術(shù)方案做進(jìn)一步的說明，但是本發(fā)明不僅限于此。
一種用于滸苔發(fā)酵制備沼氣的微生物菌群獲得方法，包括以下步驟：
（1）收集福建省平潭縣龍鳳頭海濱浴場潮間帶（119.80°E，25.50°N）灘涂地表深度5-10 cm處的黑色泥沙及海水；
（2）將收集的泥沙及海水按質(zhì)量體積比1-5:100（g/mL）加入?yún)捬醢l(fā)酵罐中，并加入未清洗鹽分的滸苔作為基質(zhì)，滸苔加入量為0.5-2 g/100 mL；然后調(diào)節(jié)體系pH值為7.0-7.5、鹽度為10‰-20‰，密封后于25~40℃下發(fā)酵15-30天進(jìn)行菌群馴化，發(fā)酵結(jié)束后使用2-4層無菌紗布過濾得發(fā)酵液及沼渣；
（3）將未清洗鹽分的滸苔加入所得發(fā)酵液中，使發(fā)酵罐中總固形物含量為0.5-5%，并按沼渣與發(fā)酵液的質(zhì)量體積比為1-3:100（g/mL）加入所得沼渣，調(diào)節(jié)體系pH值為6.8-7.8、鹽度為10-20‰，于25~40℃下發(fā)酵15-30天，發(fā)酵結(jié)束后使用2-4層無菌紗布過濾，再次分離發(fā)酵液及沼渣；
（4）重復(fù)步驟（3）3-5次后，所得濾液即為菌群ST.EP的菌液。
對(duì)所得菌群ST.EP中的古菌進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明，其包含的主要微生物及豐度如下：產(chǎn)甲烷袋菌屬（Methanofollis）（50.15%），鬃毛甲烷菌屬（Methanosaeta）（24.58%），甲烷盤菌屬（Methanoplanus）（17.59%），甲烷囊菌屬（Methanoculleus）（2.19%），甲烷八疊球菌屬（Methanosarcina）（1.35%），甲烷螺菌屬（Methanospirillum）（1.14%），甲烷裂葉菌屬（Methanolacinia）（0.55%），甲烷繩菌屬（Methanolinea）（0.44%），熱裸單胞菌屬（Thermogymnomonas）（0.42%），甲烷食甲基菌屬（Methanomethylovorans）（0.24%），甲烷熱桿菌屬（Methanothermobacter）（0.07%），產(chǎn)甲烷菌屬（Methanogenium）（0.03%），甲烷微菌屬（Methanosphaerula）（0.01%）以及1.23%的未分類古菌；
對(duì)所得菌群ST.EP中的細(xì)菌進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明，其包含的主要微生物及豐度如下：熱球菌屬（Thermococcoides）（9.59%），海洋袍菌屬（Oceanotoga）（8.42%），螺旋菌屬（Sphaerochaeta）（5.85%），Kosmotoga屬（4.43%），氨基桿菌屬（Aminobacterium）（3.49%），氨基單胞菌屬（Aminomonas）（3.12%），互營單胞菌屬（Syntrophomonas）（3.01%），糖發(fā)酵菌屬（Saccharofermentans）（2.35%），厭氧棒菌屬（Anaerobaculum）（2.31%），梭菌屬（Clostridium sensu strict）（2.08%），脫硫弧菌屬（Desulfovibrio）（1.79%），紅樹林桿菌屬（Mangroviflexus）（1.43%）以及32.91%的未分類細(xì)菌，這些未分類細(xì)菌屬于擬桿菌門（Bacteroidetes）。
所述滸苔包括新鮮滸苔以及干燥滸苔，品種包含腸滸苔（E. intestinalis），扁滸苔（E. compressa），緣管滸苔（E. linza），條滸苔（E. clathrat）中的一種或幾種；使用前將滸苔用閘刀、粉碎機(jī)等進(jìn)行組織破碎后更有利于發(fā)酵的進(jìn)行。
上述步驟中，調(diào)節(jié)pH值的試劑包括鹽酸、氫氧化鈣、氫氧化鈉、碳酸氫鈉、碳酸鈉中的一種或幾種，檢測儀器使用酸度計(jì)。
上述步驟中，調(diào)節(jié)鹽度的試劑包括淡水、海水、氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂、硫酸鎂、硫酸銨、碳酸氫鈉、氯化鈣、氯化鉀、磷酸二氫鉀、溴化鈉、氯化鍶、檸檬酸鐵銨中的一種或幾種，檢測儀器使用鹽度計(jì)。
實(shí)施例1
將所得菌液加入發(fā)酵罐中，其加入量為發(fā)酵罐體積的40%，然后向發(fā)酵罐中加入未清洗鹽分的滸苔，其加入量為1g/100mL，同時(shí)調(diào)節(jié)體系鹽度為10‰，體系初始pH值在6.8；將發(fā)酵罐中的空氣排出進(jìn)行厭氧發(fā)酵，發(fā)酵溫度為25℃，批式發(fā)酵30天，發(fā)酵過程中維持pH值在6.5-7.0之間。發(fā)酵結(jié)束后，滸苔的降解率為79%，產(chǎn)氣量為263mL/g，甲烷濃度為59%。
實(shí)施例2
將所得菌液加入發(fā)酵罐中，其加入量為發(fā)酵罐體積的80%，然后向發(fā)酵罐中加入未清洗鹽分的滸苔，其加入量為10g/100mL，同時(shí)調(diào)節(jié)體系鹽度為35‰，體系初始pH值在7.8；將發(fā)酵罐中的空氣排出進(jìn)行厭氧發(fā)酵，發(fā)酵溫度為40℃，批式發(fā)酵15天，發(fā)酵過程中維持pH值在7.5-8.0之間。發(fā)酵結(jié)束后，滸苔的降解率為75%，產(chǎn)氣量為258 mL/g，甲烷濃度為56.5%。
實(shí)施例3
將所得菌液加入發(fā)酵罐中，其加入量為發(fā)酵罐體積的60%，然后向發(fā)酵罐中加入未清洗鹽分的滸苔，其加入量為5g/100mL，同時(shí)調(diào)節(jié)體系鹽度為20‰，體系初始pH值在7.2；將發(fā)酵罐中的空氣排出進(jìn)行厭氧發(fā)酵，發(fā)酵溫度為30℃，連續(xù)式發(fā)酵應(yīng)在日產(chǎn)氣量低于日均產(chǎn)氣量的20%時(shí)重新加料；發(fā)酵過程中維持pH值在6.8-7.5之間。發(fā)酵結(jié)束后，滸苔的降解率為78%，產(chǎn)氣量為277 mL/g，甲烷濃度為62.5%。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。