本發明涉及一種精氨酸利用能力提高的解淀粉芽孢桿菌及其應用，屬于食品微生物技術領域。

背景技術：

氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate,EC)是一種致癌物質，被人體持續過量攝入可能會引發肺癌、肝癌等嚴重腫瘤疾病，并且對人體的免疫系統造成傷害。

醬油是食品工業廣泛使用的一種發酵調味品，是具有獨特色、香、味的營養豐富的功能性食品，在中國已有2500年的生產歷史。近年的研究結果表明，潛在的致癌物質氨基甲酸乙酯(EC)，在醬油中尤其是日式工藝所生產的醬油中廣泛存在，這嚴重的影響了醬油的食品安全性。

釀造醬油中氨基甲酸乙酯的主要前體物質是瓜氨酸與乙醇。因此降低醬油中瓜氨酸的含量是我們降低醬油中氨基甲酸乙酯有效措施之一。在醬油生產前期，原料水解出大量精氨酸，這些精氨酸在一大類厭氧或兼性厭氧的乳酸菌的作用下，被轉化為瓜氨酸。如果這些精氨酸被一些具有完整精氨酸脫亞氨基途徑的菌株利用，將精氨酸轉化成鳥氨酸，就能降低醬油中的瓜氨酸積累。因此，篩選一株能夠耐受高鹽，并且能夠高效利用精氨酸且不積累瓜氨酸的菌株，對于降低醬油中精氨酸含量，從而降低氨基甲酸乙酯的含量有重要應用價值。

技術實現要素：

本發明的第一個目的是提供一種可高效利用精氨酸和瓜氨酸的解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)JY06-A8，已于2016年10月20日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:M 2016580，保藏地址為中國武漢武漢大學。

本發明的第二個目的是提供所述解淀粉芽孢桿菌JY06-A8的培養方法，是將所述的解淀粉芽孢桿菌接種至培養基中，在37℃下培養24～48h。

在本發明的一種實施方式中，所述培養基為含NaCl的LB培養基，其中NaCl含量為80～180g/L。

在本發明的一種實施方式中，所述培養基含有酵母膏5g/L，牛肉膏5g/L，胰蛋白胨5g/L，NaCl 180g/L，葡萄糖0.5g/L，Tween-801g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2g/L，MnSO₄·H₂O 0.05g/L，FeSO₄0.4g/L，檸檬酸三胺2g/L，CaCO₃0.1g/L，吡哆醛-5-磷酸0.05g/L，K₂HPO₄2g/L，精氨酸5g/L，pH 6.0。

在本發明的一種實施方式中，所述解淀粉芽孢桿菌JY06-A8培養條件為：將保藏的誘變菌株在含100g/L NaCl的LB固體培養基上劃線，于37℃靜置培養2d，挑取單菌落接入含100g/LNaCl的LB液體培養基，37℃靜置培養36h，離心1min(8000rpm，4℃)后去上清，所獲得菌體的用磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.0)重懸浮。

本發明的第三個目的是提供一種降低精氨酸含量的方法，是將所述的解淀粉芽孢桿菌JY06-A8接種至含精氨酸的液體、半固體或固體中，30～37℃培養至少24h。

本發明的第四個目的是提供所述解淀粉芽孢桿菌JY06-A8在降低食品中精氨酸含量方面的應用。

本發明還提供所述解淀粉芽孢桿菌JY06-A8在制備發酵食品、調味品、保健品中的應用。

有益效果：本發明的解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)JY06-A8能夠在高鹽條件下高效利用精氨酸和瓜氨酸，其對精氨酸的利用率達到了96％，且不積累瓜氨酸，該菌株傳代200代后精氨酸利用能力仍高于初始菌株2.01倍，具備良好的傳代穩定性。

生物材料保藏

解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)JY06-A8，已于2016年10月20日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:M 2016580，保藏地址為中國武漢，武漢大學。

附圖說明

圖1為菌株馴化流程圖；

圖2為解淀粉芽孢桿菌遺傳穩定性比較；JY06，解淀粉芽孢桿菌JY06；A8，解淀粉芽孢桿菌JY06-A8。

具體實施方式

氨基酸檢測培養基：酵母膏5g/L，牛肉膏5g/L，胰蛋白胨5g/L，NaCl 180g/L，葡萄糖0.5g/L，Tween-801g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2g/L，MnSO₄·H₂O 0.05g/L，FeSO₄0.4g/L，檸檬酸三胺2g/L，CaCO₃0.1g/L，吡哆醛-5-磷酸0.05g/L，K₂HPO₄2g/L，pH 6.0。用于檢測特定氨基酸時，添加氨基酸6g/L。

解淀粉芽孢桿菌JY06-A8培養方法：將保藏的誘變菌株在含100g/LNaCl的LB固體培養基上劃線，于30℃靜置培養2d，挑取單菌落接入含100g/LNaCl的LB液體培養基，30℃靜置培養36h，離心1min(8000rpm，4℃)后去上清，所獲得菌體的用磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.0)重懸浮。

實施例1解淀粉芽孢桿菌的篩選

根據如下步驟進行篩選：將解淀粉芽孢桿菌JY06接種至LB液體培養基，37℃，220rpm/min搖床培養至對數生長期(10～12h)。

(2)取2mL活化好的JY06菌液接種至含有不同濃度精氨酸(10～100g/L)的馴化培養基中，在37℃，220rpm/min的條件下搖床培養。

(3)馴化培養要達到200～300代，如圖1所示：

(4)將活化菌液稀釋至10^-4～10^-6三個濃度，取稀釋液涂布于篩選培養基中，置于37℃恒溫培養箱中培養24～36h，每個處理重復三次。

(5)挑取菌落進行高通量復篩

移取50μL滿足初篩條件的菌株所對應的上清液于1.5mL的離心管中，然后再分別向離心管中加入40g/LNaOH溶液、80g/L甲萘酚正丙醇溶液和0.5mL/L雙乙酰正丙醇溶液各1mL，震蕩搖勻后，放入30℃水浴鍋中顯色15min。取出冷卻一段時間后，在分光光度計上測吸光值OD₅₄₀，以未接種的培養基作為對照。吸光值OD₅₄₀較小的菌株即為高效利用精氨酸的菌株。

實施例2解淀粉芽孢桿菌JY06-A8利用精氨酸能力分析

分別挑取平板上活化好的原始菌株解淀粉芽孢桿菌JY06和經馴化的菌株解淀粉芽孢桿菌JY06-A8的單菌落接種于100g/LNaCl的LB液體培養基中，37℃靜置培養36小時，取5mL菌液離心1min(8000rpm，4℃)棄上清，所獲菌體加入1mL磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.0)重懸浮。

向5mL離心管中加入4mL含10g/L的精氨酸的氨基酸檢測培養基，接種500μL的懸浮菌液，接種后OD₆₀₀為7.8。30℃靜置培養3天后用HPLC的方法檢測培養基中精氨酸和瓜氨酸以及鳥氨酸含量

表1精氨酸代謝相關氨基酸含量

注：ΔArg(g/L)：精氨酸的消耗量；ΔCit(g/L)：瓜氨酸的生成量；ΔOrn(g/L)：鳥氨酸的生成量

由表1可知，經馴化的JY06-A8代謝精氨酸的能力與對照相比提高了18.4％，并且精氨酸向鳥氨酸的轉化率也提高了53.8％。

實施例3：解淀粉芽孢桿菌JY06-A8傳代穩定性

分別將解淀粉芽孢桿菌JY06和經馴化的JY06-A8接種至LB液體培養基培養，37℃，220rmp/min培養，每隔24h轉接至新的LB液體培養基中，培養20d后，取4mL菌液離心去上清，用無菌水清洗菌體兩遍，加入等體積的精氨酸利用培養基，30℃靜置培養3～5d。

取1mL樣品，離心后取上清。用5％的三氯乙酸將上清液稀釋20倍后，經孔徑為0.22μm的濾膜過濾。用高效液相色譜法測定樣品中精氨酸含量。如圖1所示，JY06-A8對精氨酸利用情況的遺傳穩定性良好。傳代200代后，JY06-A8代謝精氨酸并轉化成鳥氨酸的能力依然高于原始菌株(JY06)2.01倍。

雖然本發明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發明的精神和范圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發明的保護范圍應該以權利要求書所界定的為準。