本發明涉及熒光探針及納米粒，特別涉及一種具有水溶性以及具有聚集誘導發射效應的熒光探針或納米粒，及它們的制備方法，特別還涉及熒光探針納米粒在肝素的檢測方面的應用，屬于化學分析、分析檢測技術領域。

背景技術：

熒光有機納米粒(FONs)，通常由單分散態的低聚物或者是共軛結構的熒光團經過自組裝形成。其與無機納米粒相比具有靈活的合成方法，生物降解性，低毒性以及在水溶液中的穩定性等優點，目前已廣泛應用于化學傳感、光學材料、涂料、細胞成像、生物監測、生物體內成像及光動力治療等領域(X.Zhang,X.Y.Zhang,L.Tao,Z.G.Chi,J.R.Xu,and Y.Wei.J.Mater.Chem.B.,2014,2,4398-4414.)。但是傳統的熒光團在水溶液中通過自組裝發生聚集時熒光將發生淬滅，這一缺陷將限制其在有機發光材料和生物成像等方面的應用。與傳統的熒光團相比具有聚集誘導發射或聚集誘導發射增強的熒光團，在聚集態和固態條件下具有很強的熒光。聚集誘導發光分子的獨特行為，引起了科學家的極大關注，成為了多功能光學材料研究領域的熱點。聚集誘導發光型的納米粒，由于其良好的生物相容性和高的熒光強度，在生物傳感和生物成像領域具有極大的應用價值(R.T.K.Kwok,C.W.T.Leung,J.W.Y.Lam,and B.Z.Tang,Chem.Soc.Rev.,2014,13,4228–4238.)。

肝素(heparin)是一種直線、沒有分枝的硫酸化的糖胺聚糖，主要由三硫酸化的二糖重復單元構成。肝素在調控生物體內各種生理過程起著關鍵的作用，例如，細胞生長、細胞分化、炎癥、免疫防御、脂質轉運等。肝素作為一種高效的抗凝劑，廣泛地運用于臨床上妊娠病人的抗凝血治療以及外科預防血栓的形成，對于急性心肌梗死的患者，肝素還可以預防病人發生靜脈栓塞。肝素的另一重要的臨床運用是在心臟手術、腎臟透析的過程中維持病人血液體外循環的暢通。此外，肝素還可以用于治療各種原因引起的彌散性血管內凝血(DIC)、類風濕性關節炎、腎小球腎炎、腎病綜合征等。肝素的抗凝血作用主要是通過它和凝血酶蛋白抑制劑(抗凝血酶III)之間的相互作用來實現的。臨床要求的肝素用于心血管外科手術和術后長期護理的劑量分別是2–8U mL^-1(17–67μM)和0.2–1.2U mL^-1(1.7–10μM)，因此臨床使用肝素要嚴格控制其用量。肝素用量過多會引起自發性出血，臨床表現為各種粘膜出血、關節腔積血、傷口出血等。肝素誘導的血小板減少癥，是一種由藥物誘導引發的血小板減少癥，是肝素治療中一重嚴重的并發癥。鑒于過量的肝素可能引起的嚴重副作用，迫切需要發展一種高靈敏度和選擇性的檢測肝素含量的方法。

目前為止有許多用來檢測肝素的方法。臨床常用活化部分凝血活酶時間(Activated Partial Phromboplastin Time，APPT)。方法是在血漿中加入鈣離子、腦磷脂和其他激活物質如白陶土，這些物質激活內源性凝血級聯系統，促進血漿凝固，而活化部分凝血活酶時間(APTT)就是血漿凝固所需的時間。肝素的用量可以根據APTT時間的長短來進行監測，從而找到最佳劑量范圍。雖然APTT法操作簡單、便宜，但是它是一種間接的檢測方法、而且不能原位直接的檢測病人血漿中肝素的含量，此外這種活化部分凝血活酶時間(APTT)的方法只能用于普通肝素檢測，不能用于低分子肝素的檢測。因此，非常期望開發一種高準確度并且可靠的監測肝素的新方法。最近幾年由于熒光檢測分析法的簡單、快速、靈敏度高不需要昂貴的儀器等特點受到了極大的關注。許多基于有機小分子、聚合物、生物大分子檢測肝素的熒光探針被報道。由于肝素本身具有豐富的負電荷，因此設計探針本身具有正電荷通過靜電吸引的作用來檢測肝素。這種策略經常用來設計熒光探針用于檢測肝素。Cong Yu等人報道了一個多聚陽離子誘導的苯并[g,h,i]芘的熒光探針檢測肝素，通過帶負電荷的熒光團與多聚陽離子之間的靜電作用力使熒光團發生聚集，加入高負電荷的肝素時，會與熒光團競爭性的結合多聚陽離子，通過熒光團的聚集狀態的改變來比率型檢測肝素(M.D.Yang,J.Chen,H.P.Zhou,W.Y.Li,Y.Wang,J.M.Li,C.Y.Zhang,C.B.Zhou and C.Yu,Biosens Bioelectron.,2016,75,404–410.)。雖然這一探針能夠靈敏性的檢測肝素，但是其需要額外加入多聚陽離子(PDA)，通過兩步反應來檢測肝素，血清中的帶負電荷的生物大分子也能夠競爭性的與PDA結合，對肝素的檢測帶來很大的干擾。此外,已報道的肝素的熒光探針其發射波長較短(小于600nm)，血液中帶熒光的生物大分子也會對其熒光定量會產生影響。

技術實現要素：

針對現有檢測肝素的熒光探針的性能存在的不足，本發明的第一個目的是在于提供一種水溶性好，且同時具有聚集誘導效應的熒光探針。

本發明的第二個目的是在于提供一種具有聚集誘導效應的熒光探針納米粒。

本發明的第三個目的是在于提供一種操作簡單、原料易得的制備所述熒光探針的方法。

本發明的第四個目的是在于提供一種操作簡單、條件溫和的制備所述熒光探針的方法。

本發明的第五個目的是在于提供一種所述熒光探針納米粒在檢測肝素中的應用，利用其具有的水溶性及聚集誘導效應，通過肝素與其靜電相互作用力，使熒光探針聚集形成聚集態而發射熒光來實現對肝素的檢測，表現出靈敏、選擇性高的特點。

為了實現上述技術目的，本發明提供了一種具有水溶性及聚集誘導發射效應的熒光探針，具有式1結構：

其中，

X^-選自I^-、ClO₄^-、Br^-或PF₆^-；

R₁、R₂和R₃獨立選自氫、鹵素、烷基、羥基、烷氧基、硝基、羧基或胺基。

優選的方案，式1中R₂和R₃均選自氫、氟、氯、溴、碘、甲基、羥基、甲氧基、硝基、羧基或二甲胺基。

優選的方案，式1中R₁選自氫、氟、氯、溴、碘、甲基、羥基、甲氧基、硝基、羧基或二甲胺基。

本發明還提供了一種熒光探針納米粒，是由所述熒光探針聚集構成的納米粒。

本發明還提供了一種制備所述的具有水溶性及聚集誘導發射效應的熒光探針的方法，該方法包括以下步驟：

1)2-甲基苯并噻唑與碘甲烷進行N取代反應，得到式2中間體；

2)對苯二甲醛、式3苯胺類化合物和式4苯偶酰類化合物在醋酸/醋酸銨體系中進行環化反應，得到式5中間體；

3)式2中間體與式5中間體在哌啶作用下進行縮合反應，得到式6目標產物，或者將式6目標產物與高氯酸鹽、溴鹽或六氟磷酸鹽進行離子交換，得到含高氯酸根離子、溴離子或六氟磷酸根離子的目標產物；

其中，

R₁、R₂和R₃獨立選自氫、鹵素、烷基、羥基、烷氧基、硝基、羧基或胺基。

優選的方案，1)中的反應條件為：采用無水乙醇作為溶劑，在80～95℃反應4～8h。

優選的方案，2)中的反應過程為：將對苯二甲醛和所述苯胺類化合物在冰醋酸溶劑中攪拌0.5～1.5h，再加入所述苯偶酰類化合物和醋酸銨，在110～130℃溫度下反應8～16h。

優選的方案，3)中的反應條件為：采用無水乙醇作為溶劑，哌啶作為催化劑，在80～95℃反應6～10小時。

本發明還提供了一種制備所述的熒光探針納米粒的方法，將所述的熒光探針溶于有機溶劑后，加入到水溶液中，超聲處理，即得熒光探針納米粒。

優選的方案，有機溶劑選自甲醇、乙醇、二甲基甲酰胺、二甲亞砜、四氫呋喃、乙腈中的至少一種。

優選的方案，水溶液選自純水、生理鹽水、磷酸緩沖溶液、4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖溶液或三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽緩沖溶液。

本發明還提供了所述熒光探針納米粒的應用，將其應用于肝素的檢測。

優選的方案將熒光探針納米粒應用于化學溶液體系、生物體液或生物組織中肝素的熒光定量分析檢測。

本發明的熒光探針具有咪唑環及四級銨鹽結構，季銨鹽帶有正電荷，且在水中以分散的狀態，而整個分子沒有熒光，與肝素識別之后，由于肝素本身的高負電荷的特性，在分子間的靜電作用力的誘導下熒光探針發生聚集從而發射出強的紅色熒光。其檢測原理圖1。

本發明的具有水溶及聚集誘導效應熒光探針制備路線如下(以R₁、R₂和R₃為氫為例進行具體說明)：

本發明的具有水溶及聚集誘導效應的熒光探針的具體制備方法通過如下步驟實現：

a、2-甲基苯并噻唑溶于無水乙醇中，加入碘甲烷90℃加熱回流，體系減壓蒸餾出溶劑，乙醚重結晶，得到化合物1；

b、將對苯二甲醛和苯胺溶解于冰醋酸中，常溫攪拌1小時，然后依次加入苯偶酰和醋酸銨混合均勻，繼續加熱120℃回流反應過夜，TLC檢測反應完全后用氫氧化鈉溶液調pH至近中性有沉淀產生，減壓過濾得濾餅，干燥，柱色譜分離純化得到化合物2。

c、將化合物2溶解于無水乙醇中，依次加入化合物1和哌啶體系混合均勻后，90℃加熱回流，反應結束后，減壓蒸餾除掉溶劑，柱色譜分離純化得到化合物3；

d、將化合物3溶解在丙酮中常溫攪拌，加入高氯酸鈉或六氟磷酸鉀的飽和水溶液，體系繼續攪拌30min，過濾得濾餅，用蒸餾水洗滌，干燥得到對應的陰離子交換產物化合物4或5。

本發明的熒光探針納米粒的制備方法通過如下步驟實現：

將化合物3、4或5充分溶解于有機溶劑中制備成母液，然后用移液槍吸取母液，在超聲條件下加入到一定量的水溶液中，體系常溫攪拌30min后即得檢測肝素用的有機納米粒。利用動態光散射(DLS)和掃描電鏡(SEM)來觀察形成納米粒的粒徑和形貌。

本發明的檢測肝素的方法是充分利用了本發明提供的熒光探針在水溶液中具有分散性，且分散狀態沒有熒光，而在肝素存在時，通過肝素的靜電相互作用力，使熒光探針聚集形成聚集態而發射熒光且發射波長大于600nm，本發明正是基于此而建立檢測肝素的方法，該方法抗干擾強、靈敏度高，可以廣泛推廣應用。

本發明的熒光探針納米粒能夠用于化學模擬生物體系中肝素的檢測；也可用于臨床上檢測血液中肝素的濃度，臨床醫學上血液、血清或組織中肝素的檢測。

相對現有技術，本發明的技術方案帶來的有益技術效果：

1)本發明的熒光探針及納米粒具有水溶性好、可以在水中分散的特點，且其具有聚集誘導發射效應，在聚集態時發射波長大于600nm的熒光，特別適用于熒光檢測。

2)本發明的熒光探針及納米粒的制備方法簡單、成本低，有利于大規模生產。

3)本發明的熒光探針納米粒用于檢測血液中的肝素，該探針對肝素具有很好的選擇性，人血清白蛋白，透明質酸，硫酸軟骨素，ATP，氨基酸等對檢測沒有干擾，該納米探針溶液的熒光強度與肝素的濃度在一定的濃度范圍內(肝素的濃度范圍0～1.2UmL^-1)具有良好的線性關系，顯示出定量檢測特性，完全可以滿足臨床上對術后長期護理中肝素濃度的檢測的要求。

4)本發明的熒光納米探針對肝素的響應時間短，測定的靈敏度高，發射波長位于紅光區域血液中生物大分子對其干擾小，使得其適合推廣運用。

附圖說明

【圖1】本發明實施例1中制備的熒光探針納米粒的動態光散射圖；

【圖2】本發明實施例1中制備的熒光探針納米粒的掃描電鏡圖；

【圖3】本發明實施例1中熒光探針納米粒的熒光強度與肝素濃度的線性關系，橫坐標為肝素濃度，縱坐標為熒光強度；

【圖4】本發明實施例1中熒光探針納米粒對肝素的選擇性；

【圖5】為熒光探針納米粒用于肝素檢測的原理圖。

具體實施方式

以下實施方式旨在進一步闡釋說明本發明內容，而不是對本發明權利要求保護范圍的限定。

實施例1

本發明的聚集誘導熒光發射增強的化合物3(實例中R₁、R₂和R₃＝H，X＝I)的合成，合成路線如下：

化合物1的合成：稱取2-甲基苯并噻唑(298mg，2mmol)溶解于10mL乙腈中，體系中加入碘甲烷(572mg，4mmol)，反應混合體系90℃回流6小時，TLC板監測反應完全后，減壓蒸餾除掉溶劑，用乙醚重結晶，過濾，用30mL乙

醚洗滌三次，干燥得化合1，無需進一步的純化直接進行下一步反應。

化合物2的合成：分別稱去對苯二甲醛(1.34g,10mmol)和苯胺(930mg，10mmol)溶解在100mL冰醋酸當中，室溫攪拌一小時。苯偶酰(2.1g，10mmol)和醋酸銨(5.4g，70mmol)順序加入到反應體系中，化合物在120℃條件下反應過夜，反應結束后反應體系倒入到300mL冰水中，用0.1mmol/L的氫氧化鈉溶液調解體系pH至中性，混合物過濾用水洗三遍，真空干燥后硅膠柱層析分離純化得到產物。產率為40％。核磁共振分析結果為：¹H NMR(500MHz，CDCl₃，ppm)δ＝9.98(s,1H)，7.76-7.78(d,2H)，7.62-7.65(m,4H)，7.36–7.23(m，9H)，7.16(m，2H)，7.09–7.11(d，2H).¹³C NMR(125MHz，CDCl₃，ppm)δ＝191.70,145.34,135.47,130.23,129.39,128.78,128.37,128.26,126.91.

化合物3的合成：稱取化合物2(200mg，0.5mmol)和化合物(220.5mg，0.5mmol)溶解在10mL無水乙醇中，加入1滴哌啶，室溫充分攪拌，反應體系在90℃充分回流8小時，TLC板監測反應完全后，減壓蒸餾除去溶劑，硅膠柱層析分離得到產物3。產率為51％。核磁共振分析結果為：¹HNMR(500MHz,DMSO-D6):δ＝8.44-8.46(d,1H，J＝7.7Hz)，8.28-8.26(d,1H,J＝8.7Hz)，8.20-8.16(d,1H,J＝15.7Hz)，8.06-8.02(d,1H,J＝15.7Hz)，8.00-7.98(d,2H,J＝8.4Hz)，7.92-7.88(t,1H)，7.83-7.79(t，1H)，7.55-7.52(m，4H),7.41-7.27(d，13H)，4.35(s，3H).¹³C NMR(125MHz,DMSO-D₆):δ＝172.13,147.73,145.27,142.54,130.01,128.91,124.79,117.43,115.01,55.39,40.38,36.93,31.17,29.84,27.01,22.68.HRMS(m/z):計算值C₃₇H₂₈IN₃S,673.1049；發現[M-I]⁺,546.2007.

實施例2

水溶性有熒光有機納米粒的制備：

用移液槍取20μL化合物3(1mM)的乙腈溶液，超聲條下中加入到2mL的磷酸緩沖溶液(10mM，pH＝7.4)中使化合物3的最終濃度為10μM。室溫條件下攪拌30min體系有乳光產生，為了驗證其納米聚集行為，動態光散射實驗測定其平均粒徑為101nm，如附圖1所示。

實施例3

制備的熒光有機納米粒的掃描電子顯微鏡(SEM)測試：

吸取一滴實施例2中所制備的溶液，滴于銅網上，用濾吸干水分，自然晾干，置于掃描電鏡中進行觀察。掃描電鏡圖片如附圖2所示。

實施例4

熒光納米探針的熒光強度與肝素濃度的線性關系：

向實施例2中所制備的體系中分別加入10μL的肝素鈉注射液，使肝素的最終濃度分別達到，0.05UmL^-1、0.1UmL^-1、0.15UmL^-1、0UmL^-1.2UmL^-1、0.3UmL^-1、0.4UmL^-1、0.5UmL^-1、0.6UmL^-1、0.7UmL^-1、0.8UmL^-1、0.9UmL^-1、1.0UmL^-1、1.2UmL^-1、1.4UmL^-1、1.6UmL^-1、1.8UmL^-1、2.0UmL^-1。所有測試溶液配制完成后，利用渦旋儀使其混合均勻。室溫孵育10min后測量其在650nm處的熒光發射強度。所得結果如附圖3所示，體系中650nm的熒光強度與肝素的濃度在0–1.2UmL^-1之間有很好的線性關系。

實施例5

熒光有機納米對肝素檢測的選擇性：

使用實施例2中所制備的溶液作為熒光納米探針，并評價該探針對肝素的選擇性，該納米探針的激發波長為380nm。該體系中化合3的濃度為10μM，分別向該體系加入肝素使其濃度為2.0UmL^-1，以及5倍摩爾單量的磷酸根、三磷酸腺苷、硫酸根醋酸根、透明質酸、谷氨酸、半胱氨酸，混合充分后，室溫孵育10min后，測其熒光發射光譜并記錄650nm處熒光發射的強度。結果如附圖5所示，只有加入肝素的體系中產生強的紅色熒光，而加入其它物種的溶液中幾乎觀察不到紅色熒光。上述結果表明，該熒光有機納米粒檢測肝素具有良好的選擇性和實際應用性。

最后，特別需要說明的是，以上舉例僅是本發明的若干具體實施例。本發明顯然不限于以上實例，本領域的相關技術人員能從本發明公開的內容直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護范圍。