本發明涉及生化技術領域，具體地說是水解海帶干粉得到海帶抗氧化肽粗提液,再經過離子層析柱初步分離純化，得到一種海帶抗氧化肽產品的方法。

背景技術：

海帶是一種營養價值很高的蔬菜，同時具有一定的藥用價值。含有豐富的碘等礦物質元素。海帶含熱量低、蛋白質含量中等、礦物質豐富，研究發現，海帶具有降血脂、降血糖、調節免疫、抗凝血、抗腫瘤、排鉛解毒和抗氧化等多種生物功能。研究表明其中的抗氧化功能就與其中所含的抗氧化肽有直接關系，因為抗氧化肽為胞內多肽，所以細胞破碎技術是直接影響抗氧化肽提取得率的關鍵因素之一。抗氧化肽的提取一般有超聲波、高壓均質、反復凍融、水提法、緩沖液提法等。本方案通過緩沖液法對海帶中細胞進行破碎提取抗氧化肽，確定了各條件下抗氧化肽提取的最佳條件。在抗氧化肽的分離時，主要是把抗氧化肽與提取液中其他物質分離。可利用蛋白質的鹽析和調節PH使蛋白變性等，使蛋白質從提取液中分離出來；最后，再把抗氧化肽從雜蛋白中分離出來，常用的方法有柱分離法等。

本發明的技術方案采用通過緩沖液提取法從海帶干粉得到海帶抗氧化肽粗提液,再經過離子層析柱初步分離純化，得到一種海帶抗氧化肽產品的方法。該法簡單，可操作性強，成本較低，適合大規模化生產。

技術實現要素：

本發明的目的是生產一種海帶抗氧化肽產品。

通過緩沖液提取法從海帶干粉得到海帶抗氧化肽粗提液再經過離子層析柱初步分離純化，得到一種海帶抗氧化肽產品的方法。本發明具有工藝簡單，操作安全，成本較低的特點，非常適用于規模化大生產。包括如下步驟：

（1）溶解離心：取海帶干粉，按其重量1:5-1:90（w/v）的比例量取PBS緩沖液。先用PBS緩沖液將海帶干粉溶解，攪拌2-8h，10000r/min離心5-60min，取上清液。將沉淀溶于2-10倍（w/v）蒸餾水后繼續攪拌2-8h后再次10000r/min離心5-60min，取上清液。再將沉淀溶解于2-10倍（w/v）蒸餾水進行第三次攪拌，離心后取上清液，作為上柱液。

（2）柱平衡：用pH 3.0-7.5平衡緩沖液平衡柱體，用恒流泵控制流速為100-700ml/min，平衡時間1-5小時。

（3）上樣：將上柱液加入層析柱，恒流泵控制流速為100-700ml/min。上樣結束后，用平衡緩沖液洗滌層析柱，恒流泵控制流速為200-800ml/min。

（4） 洗滌：用pH 2.0-9.0洗滌緩沖液洗滌層析柱，恒流泵控制流速為200-800ml/min。

（5）洗脫：洗滌結束后，用pH2.5±10.0洗脫液洗脫層析柱，恒流泵控制流速為300-900ml/min。洗脫的同時，使用核酸蛋白檢測儀粗略測量流出液100-640nmOD值，當OD值接近0.05-0.95時改用紫外分光光度計精密測量OD值，當流出液OD值在0.2-0.7以上，開始收集流出液，直到OD值在0.2-0.7以下，停止收集流出液。

（6）柱再生：洗脫結束后，用含0.1-1mol /L氫氧化鈉溶液的再生液洗滌層析柱，之后再用純化水洗滌層析柱，流速均用恒流泵控制在100-1000ml/min。

（7）沉淀：計量收集流出液體積，轉入不銹鋼桶內，邊攪邊加入流出液體積2-8倍量(v/v)的冷乙醇，乙醇溫度不超過-5℃，靜置沉淀12-36小時，至乙醇澄清沉淀物全部沉于不銹鋼桶底部。

（8）離心、脫水：用軟管自然虹吸上層乙醇，下層沉淀物裝入離心杯用低速大容量冷凍離心機離心，使固液分離，設定離心轉速不低于2500-5000rpm。離心結束后，棄去上層母液，收集下層固體，按固體物重量1:2-1:9（w/v）比例于離心杯內加入無水乙醇脫水1-4次，再按上述步驟離心，收集固體物干燥。

（9）真空干燥：將上述盛有離心固體物的離心杯放置于真空干燥箱，干燥10-35小時以上，干燥后即得產品。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明作進一步說明。

實施例1

（1）溶解離心：取海帶干粉，按其重量1:8（w/v）的比例量取PBS緩沖液。先用PBS緩沖液將海帶干粉溶解，溶解離心：取海帶干粉，按其重量1:5（w/v）的比例量取PBS緩沖液。先用PBS緩沖液將海帶干粉溶解，攪拌2h，10000r/min離心10min，取上清液。將沉淀溶于2倍（w/v）蒸餾水后繼續攪拌2h后再次10000r/min離心10min，取上清液。再將沉淀溶解于2倍（w/v）蒸餾水進行第三次攪拌，離心后取上清液，作為上柱液。

（2）柱平衡：用pH 3.0平衡緩沖液平衡柱體，用恒流泵控制流速為100ml/min，平衡時間1.5小時。

（3）上樣：將上柱液加入層析柱，恒流泵控制流速為150ml/min。上樣結束后，用平衡緩沖液洗滌層析柱，恒流泵控制流速為200ml/min。

（4） 洗滌：用pH 2.0洗滌緩沖液洗滌層析柱，恒流泵控制流速為200ml/min。

（5）洗脫：洗滌結束后，用pH 2.5洗脫液洗脫層析柱，恒流泵控制流速為300ml/min。洗脫的同時，使用核酸蛋白檢測儀粗略測量流出液100nmOD值，當OD值接近0.05時改用紫外分光光度計精密測量OD值，當流出液OD值在0.2以上，開始收集流出液，直到OD值在0.2以下，停止收集流出液。

（6）柱再生：洗脫結束后，用含0.1mol /L氫氧化鈉溶液的再生液洗滌層析柱，之后再用純化水洗滌層析柱，流速均用恒流泵控制在100ml/min。

（7）沉淀：計量收集流出液體積，轉入不銹鋼桶內，邊攪邊加入流出液體積2倍量(v/v)的冷乙醇，靜置沉淀12小時，至乙醇澄清沉淀物全部沉于不銹鋼桶底部。

（8）離心、脫水：用軟管自然虹吸上層乙醇，下層沉淀物裝入離心杯用低速大容量冷凍離心機離心，使固液分離，設定離心轉速不低于2500rpm。離心結束后，棄去上層母液，收集下層固體，按固體物重量1:2（w/v）比例于離心杯內加入無水乙醇脫水1次，再按上述步驟離心，收集固體物干燥。

（9）真空干燥：將上述盛有離心固體物的離心杯放置于真空干燥箱，干燥15小時以上，干燥后即得產品。

實施例2

（1）溶解離心：取海帶干粉，按其重量1:50（w/v）的比例量取PBS緩沖液。先用PBS緩沖液將海帶干粉溶解，溶解離心：取海帶干粉，按其重量1:40（w/v）的比例量取PBS緩沖液。先用PBS緩沖液將海帶干粉溶解，攪拌4h，10000r/min離心30min，取上清液。將沉淀溶于5倍（w/v）蒸餾水后繼續攪拌4h后再次10000r/min離心30min，取上清液。再將沉淀溶解于5倍（w/v）蒸餾水進行第三次攪拌，離心后取上清液，作為上柱液。

（2）柱平衡：用pH 4.0平衡緩沖液平衡柱體，用恒流泵控制流速為400 ml/min，平衡時間2.5小時。

（3）上樣：將上柱液加入層析柱，恒流泵控制流速為400ml/min。上樣結束后，用平衡緩沖液洗滌層析柱，恒流泵控制流速為500ml/min。

（4） 洗滌：用pH 5.0洗滌緩沖液洗滌層析柱，恒流泵控制流速為500ml/min。

（5）洗脫：洗滌結束后，用pH 6.0洗脫液洗脫層析柱，恒流泵控制流速為600ml/min。洗脫的同時，使用核酸蛋白檢測儀粗略測量流出液350nmOD值，當OD值接近0.65時改用紫外分光光度計精密測量OD值，當流出液OD值在0.5以上，開始收集流出液，直到OD值在0.5以下，停止收集流出液。

（6）柱再生：洗脫結束后，用含0.5mol /L氫氧化鈉溶液的再生液洗滌層析柱，之后再用純化水洗滌層析柱，流速均用恒流泵控制在500ml/min。

（7）沉淀：計量收集流出液體積，轉入不銹鋼桶內，邊攪邊加入流出液體積5倍量(v/v)的冷乙醇，靜置沉淀24小時，至乙醇澄清沉淀物全部沉于不銹鋼桶底部。

（8）離心、脫水：用軟管自然虹吸上層乙醇，下層沉淀物裝入離心杯用低速大容量冷凍離心機離心，使固液分離，設定離心轉速不低于3500rpm。離心結束后，棄去上層母液，收集下層固體，按固體物重量1:6（w/v）比例于離心杯內加入無水乙醇脫水2次，再按上述步驟離心，收集固體物干燥。

（9）真空干燥：將上述盛有離心固體物的離心杯放置于真空干燥箱，干燥20小時以上，干燥后即得產品。

實施例3

（1）溶解離心：取海帶干粉，按其重量1:80（w/v）的比例量取PBS緩沖液。先用PBS緩沖液將海帶干粉溶解，溶解離心：取海帶干粉，按其重量1:90（w/v）的比例量取PBS緩沖液。先用PBS緩沖液將海帶干粉溶解，攪拌8h，10000r/min離心60min，取上清液。將沉淀溶于10倍（w/v）蒸餾水后繼續攪拌8h后再次10000r/min離心60min，取上清液。再將沉淀溶解于10倍（w/v）蒸餾水進行第三次攪拌，離心后取上清液，作為上柱液。

（2）柱平衡：用pH 7.5平衡緩沖液平衡柱體，用恒流泵控制流速為700ml/min，平衡時間5小時。

（3）上樣：將上柱液加入層析柱，恒流泵控制流速為700ml/min。上樣結束后，用平衡緩沖液洗滌層析柱，恒流泵控制流速為800ml/min。

（4） 洗滌：用pH 9.0洗滌緩沖液洗滌層析柱，恒流泵控制流速為800ml/min。

（5）洗脫：洗滌結束后，用pH 10.0洗脫液洗脫層析柱，恒流泵控制流速為900ml/min。洗脫的同時，使用核酸蛋白檢測儀粗略測量流出液640nmOD值，當OD值接近0.95時改用紫外分光光度計精密測量OD值，當流出液OD值在0.7以上，開始收集流出液，直到OD值在0.7以下，停止收集流出液。

（6）柱再生：洗脫結束后，用含1mol /L氫氧化鈉溶液的再生液洗滌層析柱，之后再用純化水洗滌層析柱，流速均用恒流泵控制在1000ml/min。

（7）沉淀：計量收集流出液體積，轉入不銹鋼桶內，邊攪邊加入流出液體積8倍量(v/v)的冷乙醇，乙醇溫度不超過-5℃，靜置沉淀36小時，至乙醇澄清沉淀物全部沉于不銹鋼桶底部。

（8）離心、脫水：用軟管自然虹吸上層乙醇，下層沉淀物裝入離心杯用低速大容量冷凍離心機離心，使固液分離，設定離心轉速不低于5000rpm。離心結束后，棄去上層母液，收集下層固體，按固體物重量1:9（w/v）比例于離心杯內加入無水乙醇脫水4次，再按上述步驟離心，收集固體物干燥。

（9）真空干燥：將上述盛有離心固體物的離心杯放置于真空干燥箱，干燥35小時以上，干燥后即得產品。