本發明屬于基因工程
技術領域：
，具體涉及一種重組菌及其在催化萊鮑迪甙A生成萊鮑迪甙D中的應用。
背景技術：
：隨著人們對健康的關注意識日益提高，消費者對蔗糖的攝入量逐漸減少，食品工業致力于發展低熱值高甜度的天然甜味劑。甜菊糖提取自原產于南美巴拉圭和巴西的多年生菊科草本植物甜葉菊，具有高甜度（為蔗糖的250～300倍）、低熱量（僅為蔗糖的1/300）的特性，無毒副作用，無致癌物，食用安全，對高血壓、糖尿病、肥胖癥、心臟病、齲齒等病癥還有一定的藥理作用和輔助療效。它是繼甘蔗糖、甜菜糖之外的第三種有開發價值和健康推崇的天然蔗糖替代品，被國際上譽為“世界第三糖源”。1998年，美國食品和藥物管理局（FDA）同意將甜菊糖添加到食品飲料中。瑞士將甜菊糖列入本國藥典作為糖漿劑、口服液或含片的主要甜味劑原料,取代了糖精鈉等傳統藥用甜味劑。相對于日本、美國和瑞士，歐盟批準使用甜菊糖的時間稍晚一些。2008年歐盟正式批準其作為食品添加劑。由于對甜菊糖的需求量不斷增加，許多國家包括日本、新加坡、馬來西亞、韓國、中國、以色列、印度、巴西和澳大利亞等都已在商業化種植甜葉菊。甜葉菊的葉子含有多種天然的甜味糖甙如甜菊甙、萊鮑迪A-F、杜爾可甙A和甜茶甙。其中，萊鮑迪甙D雖然不是甜菊糖總甙中的主要糖甙，但其后苦味顯著低于萊鮑迪甙A（ChemosensPercept.6(3):109–117）。2008年，美國FDA簽發了確認萊鮑迪甙A能以最低95%的純度用作零卡路里甜味劑的“通常認為是安全的”（“GRAS”）通知。萊鮑迪甙D與萊鮑迪甙A結構相似，只相差一個葡萄糖基，甜菊糖苷相關的結構物質的毒性研究也證實萊鮑迪甙D食用安全，可用于食品藥品等領域(Int.J.Toxicol.,2013,32(4):261-273.)。因此，萊鮑迪甙D是比萊鮑迪甙A具有更好味質的潛在天然甜味劑。植物來源的UDP-糖基轉移酶能催化萊鮑迪甙A糖基化生成萊鮑迪甙D，如UGT91D2(US2014/0357588A1)、EUGT11(WO/2013/022989A2)和UGTSL2（US2014/0357588A1,Biomolecules2014,4:374-389)等。糖基轉移酶由于UDP-糖基轉移酶所催化的轉糖基反應中需要活化的糖基供體UDP-葡萄糖，為了降低成本，通常會采用再生UDP-葡萄糖再生體系，如在體系在加入UDP和蔗糖，在蔗糖合酶的作用下生成UDP-葡萄糖和果糖（Biotechnol.Adv.2016,34(2):88-111.）。專利CN201310353500.9和CN201410019981.4在以萊鮑迪甙A為底物制備萊鮑迪甙M過程中萊鮑迪甙D為其中間產物或直接用作制備萊鮑迪甙M的底物。反應體系中使用重組細胞，需要添加甲苯或其它細胞通透劑；或使用重組細胞凍干粉，而凍干粉的制備耗能、成本高；此外都需要額外添加UDP作為UDP-葡萄糖再生體系的輔底物。專利CN201410019981.4中雖然對CN201310353500.9的工藝進行了優化、但還需要調配UDP-糖基轉移酶和蔗糖合酶的添加比例，重組菌用量大，產酶成本高。技術實現要素：為了解決上述問題，本發明提供一種重組菌及其在催化萊鮑迪甙A生成萊鮑迪甙D中的應用，構建的重組菌可以共表達番茄來源的UDP-糖基轉移酶UGTSL2和馬鈴薯來源的蔗糖合酶StSUS1，不需要分開表達和制備、也不需要調節兩種酶之間的配比，應用于合成萊鮑迪甙D過程中直接使用重組菌破碎后的粗酶液，不需添加UDP或UDP-葡萄糖，以及細胞通透劑或其他化學試劑，簡化了工藝過程，收率高。為了實現上述目的，本發明采用的技術方案為：一株重組菌，所述重組菌中同時含有番茄來源糖基轉移酶UGTSL2基因和馬鈴薯來源蔗糖合酶StSUS1基因，所述番茄來源糖基轉移酶UGTSL2基因序列如SEQ.NO.1所示，其編碼的番茄來源糖基轉移酶UGTSL2的氨基酸序列如SEQ.NO.3所示，所述馬鈴薯來源蔗糖合酶StSUS1基因序列如SEQ.NO.2所示，其編碼的馬鈴薯來源蔗糖合酶StSUS1氨基酸序列如SEQ.NO.4所示。將番茄來源糖基轉移酶UGTSL2基因克隆到pRSFDuet-1的NdeI與XhoI位點之間，構建得到重組質粒pRSFDuet-SL2，然后再將馬鈴薯來源蔗糖合酶StSUS1基因克隆到pRSFDuet-SL2的NcoI和EcoRI位點之間，構建得到重組質粒pRSFDuet-SL2-SUS1，將重組質粒pRSFDuet-SL2-SUS1轉化到宿主細胞中，得到重組菌。所述的重組菌在催化萊鮑迪甙A生成萊鮑迪甙D中的應用。將重組菌誘導表達后取粗酶液，加入到反應混合物中催化萊鮑迪甙A生成萊鮑迪甙D，所述反應混合物中包括萊鮑迪甙A、蔗糖和磷酸鈉緩沖液。所述重組菌的誘導表達條件為：將重組菌接種到LB培養基中，于20~37℃、250rpm振蕩培養8h，再將培養菌液按2%接種量接入誘導培養基中，于200rpm，20~37℃培養2h，待OD600達到0.2左右時轉25℃誘導培養22h，離心收集菌體。所述反應混合物中萊鮑迪甙A濃度為4~10g/L，蔗糖濃度為30~50g/L，粗酶液濃度為2~10g/L，采用磷酸鈉緩沖液調節pH為6.4~8；進一步地，優選萊鮑迪甙A濃度為10g/L，蔗糖濃度為30g/L，粗酶液濃度為8g/L，采用磷酸鈉緩沖液調節pH為7.2。所述反應溫度為20~55℃，反應時間為2~25h。所述LB培養基配方為0.5g/L酵母粉、0.5g/L氯化鈉、1g/L胰蛋白胨、0.05g/L卡納霉素。所述誘導培養基配方為25g/L酵母粉、15g/L胰蛋白胨、10g/L氯化鈉、2g/L葡萄糖、0.05~0.2g/L乳糖。誘導培養基中優選乳糖濃度為0.1g/L。通過控制反應條件，在30℃，pH7.2，底物萊鮑迪甙A：蔗糖質量比1:3、酶濃度為8mg/mL、反應時間16h時，萊鮑迪甙D摩爾收率提高了1.7倍，達到86%。有益效果：本發明構建的共表達番茄來源UDP-糖基轉移酶UGTSL2和馬鈴薯來源蔗糖合酶StSUS1的重組菌作為生物催化劑，不需要分開表達和制備UDP-糖基轉移酶與蔗糖合酶，也不需要調節兩種酶之間的配比。重組菌可以在-20℃或-80℃保存，反應中使用重組菌破碎后的粗酶液，避免了酶的分離純化，也無需制作凍干粉，簡化了工藝過程。在催化萊鮑迪甙A生成萊鮑迪甙D過程中，反應液中不需添加UDP或UDP-葡萄糖，顯著降低成本。反應液中不需添加任何細胞通透劑或其他化學試劑，環境友好性更佳。萊鮑迪甙D的產率高達10.8g/L。附圖說明圖1：蔗糖合酶StSUS1與糖基轉移酶UGTSL2偶聯反應示意圖；圖2：反應液樣品HPLC檢測結果圖。具體實施方式以下實施例中，萊鮑迪甙D采用液相色譜檢測，HPLC在安捷倫AgilentTechnologies1290Infinity液相色譜儀上進行，色譜分析條件如下：色譜柱：Agilent5TC-C18（Netheriands）250×4.6mm；流動相為0.1%甲酸：乙腈（70:30；V:V）；流速1min/mL；柱溫55℃；檢測波長：210nm。萊鮑迪甙D標準品購自上海源葉生物科技有限公司。實施例1重組菌株S1的構建番茄來源糖基轉移酶UGTSL2的基因序列如SEQ.NO.1所示，馬鈴薯來源蔗糖合酶StSUS1基因序列如SEQ.NO.2所示，經密碼子優化后由南京金斯瑞公司合成。設計引物GGGAATTCCATATGGCGACCAACCTGCG和CCGCTCGAGTTAGTGGTGATGATGGTGATGTTTG擴增UGTSL2基因，將該基因亞克隆到pRSFDuet-1（Novagen）的NdeI與XhoI位點之間，構建重組質粒pRSFDuet-SL2；設計引物TAATAAGGAGATATACCATGGCCGAACGTGTCCTGACCC和AGGCGCGCCGAGCTCGAATTCTTATTCAGCTGCCAGCG，用南京諾唯贊生物科技有限公司的一步克隆試劑盒（OneStepCloningKit，Vazyme）將StSUS1基因亞克隆到pRSFDuet-SL2的NcoI和EcoRI位點之間，構建重組質粒pRSFDuet-SL2-SUS1。以pRSFDuet-SL2-SUS1為模板，設計引物CATGCCATGGCCGAACGTGTC和CCGGAATTCTTATTCAGCTGCCAGCG，將StSUS1基因亞克隆到pET22b(+)（Novagen）的NcoI和EcoRI位點之間，構建重組質粒pET22b-SUS1。將pRSFDuet-SL2-SUS1和pET22b-SUS1轉化到大腸桿菌BL21（DE3），獲得重組菌BL21（pRSFDuet-SL2-SUS1，pET22b-SUS1），簡稱S1。分子克隆操作中TransFastTaqDNA聚合酶購自北京全式金生物技術有限公司，T4DNA連接酶及限制性內酶均購自大連TaKaRa公司，質粒提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。轉化步驟參考《分子克隆實驗指南》（（美）J.薩姆布魯克等著；黃培堂等譯；科學出版社有限責任公司；第三版，上冊，P91），根據質粒的抗性篩選轉化子，再提質粒經酶切驗證以確認陽性克隆。實施例2重組菌S2的構建以實施例1中構建的重組質粒pRSFDuet-SL2-SUS1為模板，設計引物AAGGAAAAAAGCGGCCGCTATGGCGACCAACCTGC和CCGGAATTCGTGGTGATGATGGTGATGTTTGCTC擴增UGTSL2基因，將其亞克隆到pET22b(+)（Novagen）的NotI與EcoRI位點之間，構建重組質粒pET22b-SL2。將pRSFDuet-SL2-SUS1和pET22b-SL2轉化到大腸桿菌BL21（DE3），獲得重組菌BL21（pRSFDuet-SL2-SUS1，pET22b-SL2），簡稱S2。實施例3重組菌S3的構建將實施例1中構建的pRSFDuet-SL2和pET22b-SUS1轉化到大腸桿菌BL21（DE3），獲得重組菌BL21（pRSFDuet-SL2，pET22b-SUS1），簡稱S3。實施例4重組菌S4的構建將實施例1中構建的pRSFDuet-SL2-SUS1轉化到大腸桿菌BL21（DE3），獲得重組菌BL21（pRSFDuet-SL2-SUS1），簡稱S4。實施例5誘導表達重組酶及粗酶液制備將重組菌S1~S4分別接種到含有0.05g/L卡納霉素的5mLLB培養基（0.5g/L酵母粉，0.5g/L氯化鈉，1g/L胰蛋白胨），于37℃、250rpm振蕩培養8h，再將培養菌液按2%接種量接入含有100mL誘導培養基（25g/L酵母粉，15g/L胰蛋白胨，10g/L氯化鈉，2g/L葡萄糖，0.05g/L乳糖）的500mL搖瓶中，于200rpm，30℃培養2h，待OD600達到0.2左右時轉25℃誘導22h離心收集菌體。超聲破菌，離心取上清液為粗酶液，置于4℃冰箱待用。在50mL三角瓶中加入10mL的反應混合物，包含10g/L萊鮑迪甙A（購自曲阜海根甜菊制品有限公司）、50g/L蔗糖、50mM磷酸鈉緩沖調節混合物的pH為7.2，然后分別加入3mg/mLS1~S4的粗酶液，反應在30℃、200rpm條件下進行，反應2-25h后取樣于95℃加熱5min滅活酶，離心取上清，采用高效液相色譜（HPLC）檢測萊鮑迪甙濃度，結果見表1。表1：上述4株菌誘導表達后取粗酶液進行反應，以采用重組菌S4誘導表達后獲取粗酶液反應的反應液中萊鮑迪甙D的產量最高，為4.71g/L。其次是采用菌株S2和S3粗酶的反應液，萊鮑迪甙D濃度為2.87和2.89g/L，而采用菌株S1粗酶的反應液中萊鮑迪甙D濃度最低（0.98g/L）。其原因可能是由于株菌S1—S3中都含有兩個質粒，誘導表達時菌株負擔大，目的蛋白大多以包含體形式存在，難以穩定控制兩種重組酶的比例，使其偶聯反應不能達到更高的產量。實施例6溫度對重組菌S4的誘導表達的影響將重組菌S4接種到含有0.05g/L卡納霉素的5mLLB培養基（0.5g/L酵母粉，0.5g/L氯化鈉，1g/L胰蛋白胨），37℃條件下、250rpm振蕩培養8h，再將培養菌液按2%接種量接入含有100mL誘導培養基（25g/L酵母粉，15g/L胰蛋白胨，10g/L氯化鈉，2g/L葡萄糖，0.05g/L乳糖）的500mL搖瓶中，于200rpm，分別在30℃條件下培養2h，待OD600達到0.2左右時，分別在20℃，25℃，30℃，37℃誘導22h離心收集菌體，超聲破菌，離心取上清液為粗酶液，置于4℃冰箱待用。分別取不同誘導溫度下獲取的粗酶液，在溫度30℃，pH7.2，萊鮑迪甙A10g/L，蔗糖30g/L，8mg/mL粗酶液的條件下進行反應，萊鮑迪甙D產量見表2。表2溫度(℃)萊鮑迪甙D（g/L）209.76257.98305.90370.45在20℃條件下誘導產酶，其粗酶液合成萊鮑迪甙D產量最高，為9.76g/L。實施例7乳糖濃度對重組菌S4的誘導表達的影響將重組菌S4接種到含有0.05g/L卡納霉素的5mLLB培養基（0.5g/L酵母粉，0.5g/L氯化鈉，1g/L胰蛋白胨），37℃條件下、250rpm振蕩培養8h，再將培養菌液按2%接種量接入含有不同乳糖濃度的100mL誘導培養基（25g/L酵母粉，15g/L胰蛋白胨，10g/L氯化鈉，2g/L葡萄糖，分別為0.02g/L、0.05g/L、0.1g/L、0.15g/L、0.2g/L的乳糖濃度）的500mL搖瓶中，于200rpm，分別在30℃條件下培養2h，待OD600達到0.2左右時，分別在20℃誘導22h離心收集菌體，超聲破菌，離心取上清液為粗酶液，置于4℃冰箱待用。分別取不同乳糖濃度誘導下獲取的粗酶液，在溫度30℃，pH7.2，萊鮑迪甙A10g/L，蔗糖30g/L，8mg/mL粗酶液的條件下進行反應，萊鮑迪甙D產量見表3。表3乳糖濃度（g/L）萊鮑迪甙D（g/L）0.0210.070.058.00.110.780.1510.230.210.12由實施例6和7可以得到重組菌S4的最佳誘導條件為：誘導溫度20℃，誘導劑乳糖濃度為0.1g/L。實施例8采用重組菌S4誘導表達后獲取的粗酶液進行反應，在50mL三角瓶中，10mL反應混合物中包含10g/L萊鮑迪甙A，50g/L蔗糖，pH7.2的50mM磷酸鈉緩沖，3mg/mL粗酶液，反應在30℃和200rpm條件下進行。加入粗酶液啟動反應，分別在反應0、2、7、14和25h后取樣于95℃加熱5min滅活酶，離心取上清，測得不同時間反應液中萊鮑迪甙D的含量，結果見表4。表4時間（h）萊鮑迪甙D(g/L)00.1320.9873.37145.69256.1在25h反應液中萊鮑迪甙D產量最高，這時反應液中萊鮑迪甙D的濃度為6.1g/L。但14h已經達到了5.69g/L，可見14h后，反應進行緩慢，產物積累很少。實施例9采用重組菌S4誘導表達后獲取的粗酶液進行反應。在50mL三角瓶中，10mL反應混合物中包含10g/L萊鮑迪甙A，50g/L蔗糖，pH7.2的50mM磷酸鈉緩沖，3mg/mL粗酶液，反應分別在20、30、37、45、55℃和200rpm條件下進行。加入粗酶液啟動反應，反應14h后取樣于95℃加熱5min滅活酶，離心取上清，測得不同反應溫度下反應液中萊鮑迪甙D的含量，結果見表5。表5溫度(℃)萊鮑迪甙D(g/L)202.75303.82373.56451.01550.24可見在30℃條件下反應液中萊鮑迪甙D產量最高，這時反應液中萊鮑迪甙D的濃度為3.82g/L。實施例10采用重組菌S4誘導表達后獲取的粗酶液進行反應。在50mL三角瓶中，10mL反應混合物中包含10g/L萊鮑迪甙A，50g/L蔗糖，3mg/mL粗酶液，50mM磷酸鈉緩沖pH分別配置為6.4、6.8、7.2、7.6和8，反應在30℃、200rpm條件下進行。加入粗酶液啟動反應，反應14h后取樣于95℃加熱5min滅活酶，離心取上清，測得不同反應pH下反應液中萊鮑迪甙D的含量，結果見表6。表6pH萊鮑迪甙D（g/L）6.42.836.85.557.25.837.63.658.03.31測得在pH7.2條件下反應液中萊鮑迪甙D產量最高，這時反應液中萊鮑迪甙D的濃度為5.83g/L。實施例11采用重組菌S4誘導表達后獲取的粗酶液進行反應。在50mL三角瓶中，10mL反應混合物中包含10g/L萊鮑迪甙A，質量比分別為1：1、1：3、1：5、1：7和1：10的蔗糖，pH7.2的50mM磷酸鈉緩沖，3mg/mL粗酶液，反應在30℃、200rpm條件下進行。加入粗酶液啟動反應，反應14h后取樣于95℃加熱5min滅活酶，離心取上清，測得不同底物濃度配比下反應液中萊鮑迪甙D的含量，結果見表7。表7萊鮑迪甙A:蔗糖萊鮑迪甙D(g/L)1:13.601:34.071:53.821:73.381:103.50當萊鮑迪甙A與蔗糖的質量比為1：3時反應液中萊鮑迪甙D產量最高，為4.07g/L。實施例12采用重組菌S4誘導表達后獲取的粗酶液進行反應。在50mL三角瓶中，10mL反應混合物中包含10g/L萊鮑迪甙A，50g/L蔗糖，pH7.2的50mM磷酸鈉緩沖，粗酶液蛋白濃度分別為2、4、6、8和10mg/mL，反應在30℃、200rpm條件下進行。加入粗酶液啟動反應，反應14h后取樣于95℃加熱5min滅活酶，離心取上清，測得不同粗酶液濃度下反應液中萊鮑迪甙D的含量，結果見表8。表8酶濃度（g/L）萊鮑迪甙D（g/L）21.454364.9388.2108.2當粗酶液蛋白濃度為8和10mg/mL時反應液中萊鮑迪甙D產量最高，為8.2g/L。由實施例8-12可知，最佳反應條件為：采用重組菌S4誘導表達后獲取的粗酶液進行反應。在50mL三角瓶中，10mL反應混合物中包含10g/L萊鮑迪甙A，30g/L蔗糖，pH7.2的50mM磷酸鈉緩沖，粗酶液蛋白濃度8mg/mL，反應在30℃、200rpm條件下進行。加入粗酶液啟動反應，反應16h后取樣于95℃加熱5min滅活酶，離心取上清，反應液中萊鮑迪甙D產量最高，為10.8g/L，產率為86%。SEQUENCELISTING<110>南京工業大學<120>一株重組菌及其在催化萊鮑迪甙A生成萊鮑迪甙D中的應用<130><160>12<170>PatentInversion3.3<210>1<211>1329<212>DNA<213>人工序列<400>1atggcgaccaacctgcgtgtgctgatgttcccgtggctggcgtacggtcacatcagcccg60tttctgaacattgcgaaacagctggcggatcgtggcttcctgatctacctgtgcagcacc120cgtattaacctggagagcatcattaagaaaatcccggaaaagtatgcggacagcatccac180ctgattgagctgcaactgccggagctgccggaactgccgccgcactatcacaccaccaac240ggtctgccgccgcacctgaacccgaccctgcacaaggcgctgaaaatgagcaagccgaac300tttagccgtatcctgcagaacctgaaaccggatctgctgatttacgacgtgctgcagccg360tgggcggagcacgttgcgaacgaacaaaacattccggcgggtaaactgctgaccagctgc420gcggcggtgttcagctatttctttagctttcgtaagaacccgggcgttgagttcccgttt480ccggcgatccacctgccggaagtggaaaaggttaaaatccgtgagattctggcgaaagaa540ccggaggaaggtggccgtctggatgagggtaacaagcagatgatgctgatgtgcaccagc600cgtaccatcgaggcgaaatacattgactattgcaccgaactgtgcaactggaaggtggtt660ccggtgggtccgccgttccaagatctgatcaccaacgatgcggacaacaaagagctgatt720gactggctgggtaccaagcacgaaaacagcaccgtgttcgttagctttggcagcgagtac780ttcctgagcaaagaagatatggaggaagttgcgtttgcgctggagctgagcaacgtgaac840ttcatctgggttgcgcgttttccgaaaggcgaggaacgtaacctggaagatgcgctgccg900aagggcttcctggagcgtattggtgaacgtggccgtgtgctggacaagtttgcgccgcag960ccgcgtatcctgaaccacccgagcaccggtggcttcattagccactgcggttggaacagc1020gcgatggagagcatcgattttggcgttccgatcattgcgatgccgatccacaacgaccaa1080ccgattaacgcgaaactgatggtggagctgggtgtggcggttgaaatcgttcgtgacgat1140gacggtaaaatccaccgtggcgagattgcggaaaccctgaagagcgtggttaccggcgag1200accggcgaaattctgcgtgcgaaagtgcgtgaaatcagcaaaaacctgaagagcattcgt1260gatgaggaaatggacgcggttgcggaggaactgatccaactgtgccgtaacagcaacaag1320agcaaataa1329<210>2<211>2418<212>DNA<213>人工序列<400>2atggccgaacgtgtcctgacccgtgtccatagtctgcgtgaacgtgttgatgctaccctg60gctgcccaccgtaatgaaatcctgctgtttctgagtcgtattgaaagccacggcaaaggt120atcctgaaaccgcacgaactgctggcagaatttgatgctattcgccaggatgacaaaaac180aaactgaacgaacatgcattcgaagaactgctgaaaagcacccaagaagctatcgtcctg240ccgccgtgggtggcactggcaattcgtctgcgcccgggcgtttgggaatacatccgtgtt300aacgtcaatgcgctggttgtggaagaactgagtgtgccggaatatctgcagtttaaagaa360gaactggtcgatggcgcgtccaacggtaatttcgtgctggaactggactttgaaccgttc420accgcctcatttccgaaaccgaccctgacgaaatcgattggcaacggtgttgaatttctg480aatcgtcatctgagcgccaaaatgttccacgataaagaatctatgaccccgctgctggaa540tttctgcgcgcacatcactataaaggtaaaaccatgatgctgaacgatcgtattcagaac600agcaatacgctgcaaaatgtgctgcgcaaagcggaagaatacctgatcatgctgccgccg660gaaaccccgtacttcgaatttgaacataaattccaggaaattggcctggaaaaaggctgg720ggtgatacggcagaacgtgtgctggaaatggtttgcatgctgctggatctgctggaagct780ccggacagctgtaccctggaaaaatttctgggtcgcattccgatggttttcaacgtcgtg840atcctgtctccgcacggctattttgcgcaggaa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