本發明屬于動物細菌基因工程技術領域。

背景技術：

基因工程方法致弱的鼠傷寒沙門氏菌作為載體表達外源基因，廣泛用于人類和動物的各種疾病的治療研究，取得了良好效果。但是在許多報道中的沙門氏菌載體，要么使減毒載體過度減毒，失去了免疫原性，或者雖保留了良好的免疫原性，但是載體菌株卻減毒不夠，缺乏安全性。

豬霍亂沙門氏菌是豬的重要病原菌。關于以豬霍亂沙門氏菌為載體遞送豬的其他病原抗原的研究，在國內外已有少量報道，如：華中農業大學的陳煥春院士實驗室以豬霍亂沙門氏菌中國弱毒疫苗標準株C500為載體遞送豬肺炎支原體抗原；軍事醫學科學院軍事獸醫研究所的涂長春實驗室利用豬霍亂沙門氏菌中國弱毒疫苗標準株C500為載體遞送豬瘟病毒的抗原。這些研究結果都有如下的共同點：一是這些候選疫苗株對豬霍亂沙門氏強毒株的攻毒（攻毒劑量>10×LD₅₀）可以產生100%的保護；二是對外源病原的攻毒雖然有一定的作用，但是保護效率不夠理想。其原因可能是使用了豬霍亂沙門氏菌弱毒疫苗標準株C500為載體，雖然豬霍亂沙門氏菌弱毒疫苗標準株C500對宿主足夠減毒，但是其產生的免疫原性似乎還不足以誘導理想的針對外源抗原的免疫反應。因此迫切需要研制一種疫苗載體，既要使疫苗載體足夠減毒，保證動物完全的安全性，又要使疫苗載體能誘導出優秀免疫原性，高質量地抗擊載體菌和其攜帶的外源抗原的病原感染。

本實驗室在前期研究過程中發現，用阿拉伯糖調控豬霍亂沙門氏菌的crp毒力基因所產生的減毒載體菌（中國專利申請CN 104498418A）可以誘導出對成年BALB/c小鼠較好的免疫原性，但是減毒株免疫后，用高劑量20×LD₅₀的野生型豬鏈球菌2型（SS2）比用10×LD₅₀的SS2攻毒的保護效率低，同時減毒株在小鼠的肝臟和脾臟仍然有減毒菌株的復制，表明作為減毒株的安全性和免疫原性還存在一定的風險和不足。

sopB 基因是由沙門氏菌SPI-1編碼，該基因的敲除能夠減少鼠傷寒沙門氏菌引起宿主腸道的炎性反應，減少鼠傷寒沙門氏菌對宿主免疫系統的應激，減輕對宿主免疫系統的損傷，從而提高對宿主的安全性，同時，可以提高宿主對鼠傷寒沙門氏菌和其攜帶的外源抗原的免疫原性。不同動物有不同易感的沙門氏菌，反之，同一種沙門氏菌對于不同動物也有不同的致病性，其所含的毒力基因的作用也會不同。在豬霍亂沙門氏菌中缺失sopB基因，是否會達到相同的降低豬霍亂沙門氏菌感染導致的炎癥反應，提高豬霍亂沙門氏菌對豬的免疫原性，到目前為止國內外還未見報過。

技術實現要素：

針對現有技術缺陷，本發明目的在于提供一種具有安全性較高和免疫原性較強的特點的豬霍亂沙門氏菌減毒載體菌。

本發明所述減毒載體菌為缺失了ΔmanA、Δcrp::TT araC P_BAD、ΔrelA::araCP_BADlacI TT、ΔsopB和ΔasdA基因的C78-3豬霍亂沙門氏菌，命名為rSC0016。

rSC0016保藏在位于中國北京市朝陽區北辰西路1號院3號的中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)，保藏日為2016年6月20日，保藏編號為CGMCC NO.12645，該生物材料的分類命名為:減毒豬霍亂沙門氏菌,拉丁文學名為:Salmonella choleraesuis。

本發明以C78-3豬霍亂沙門氏菌為母體，在阿拉伯糖調控豬霍亂沙門氏菌載體毒力基因表達的基礎上，由于敲除了豬霍亂沙門氏菌中的sopB 基因，使載體菌具備減毒的安全特性時，提高載體菌誘導宿主的免疫原性的能力，使載體菌成為安全和高效保護性的疫苗株；同時敲除了載體菌的asd 基因，使載體菌與其攜帶的原核表達外源抗原的asd+ 載體形成致死平衡系統，避免使用具有抗生素標記的原核表達載體。

本發明達到了如下的有益效果：

1、免疫原性強：

將阿拉伯糖調控豬霍亂沙門氏菌載體毒力基因延遲缺失和延遲表達外源抗原的技術與敲除豬霍亂沙門氏菌引起宿主炎癥的sopB基因方法相結合，使載體菌具備減毒的安全特性時，提高載體菌誘導宿主的免疫原性。實驗證明，含有ΔsopB突變的rSC0016株比不含有ΔsopB 的rSC0011株（ΔmanA、Δcrp::TT araC P_BAD、ΔrelA::araC P_BADlacI TT和ΔasdA）所誘導的免疫應答更好。例如：攜帶豬鏈球菌2型的SaoA蛋白的rSC0016(pS-SaoA)，可以100%抵抗高劑量的野生型豬鏈球菌2型的攻擊，證明了rSC0016能夠誘導出完美的免疫原性，這對于豬的各種疾病具有極大的市場應用性和創造出顯著的經濟效益。

以上不含有ΔsopB 的rSC0011株（ΔmanA、Δcrp::TT araC P_BAD、ΔrelA::araCP_BADlacI TT和ΔasdA）公布于2015年(Zhenying Jib, Jing Shangb, Yuan Li, Shifeng Wang, Huoying Shi, Live attenuated Salmonella enterica serovar Choleraesuis vaccinevector displaying regulated delayed attenuation and regulateddelayed antigen synthesis to confer protection againstStreptococcus suis in mice, Vaccine 33 (2015) 4858–4867)。

2、更高安全性：

相比于不含有ΔsopB 突變的rSC0011株（ΔmanA、Δcrp::TT araC P_BAD、ΔrelA::araCP_BADlacI TT和ΔasdA），本發明含有ΔsopB 突變的rSC0016更加減毒，因而具有更高的安全性，適合作為疫苗載體免疫剛斷奶的仔豬。

本發明另一目的在于提供上述豬霍亂沙門氏菌減毒載體菌的構建方法。

本發明構建方法包括以下步驟：

1）構建含ΔsopB突變基因的自殺載體：

以豬霍亂沙門氏菌C78-3的基因組為模板，通過引物擴增同源臂片段，敲除豬霍亂沙門氏菌C78-3的基因序列中的sopB 基因片段，并將敲除豬霍亂沙門氏菌C78-3的基因序列中的sopB 基因片段后的片段基因連接至自殺質粒pRE112中，取得缺失ΔsopB 基因序列自殺質粒；再將缺失ΔsopB 基因序列自殺質粒轉化至工程菌大腸桿菌χ7213中，制得含ΔsopB突變基因的自殺載體，命名為χ7213（pS006）；

2）構建引入ΔsopB突變基因的rSC0013株：

以缺失了ΔmanA、ΔP_crp::TT araC P_BADcrp和ΔrelA::araC P_BADlacI TT基因的C78-3豬霍亂沙門氏菌為受體菌，以含ΔsopB突變基因的自殺載體為供體菌，將供體菌和受體菌進行接合，經培養、純化，取得引入ΔsopB突變基因的rSC0013株(ΔmanA，ΔP_crp::TT araC P_BADcrp，ΔrelA::araC P_BADlacI TT，ΔsopB）；

3）構建豬霍亂沙門氏菌減毒載體菌rSC0016：

以引入ΔsopB突變基因的rSC0013株為受體菌，以含ΔasdA自殺載體χ7213(pS004)為受體菌，將供體菌和受體菌進行接合，經培養、純化，取得豬霍亂沙門氏菌減毒載體菌rSC0016。

本發明采用無抗性標記的自殺載體作為構建豬霍亂沙門氏菌載體的方法，可以避免使用抗生素標記的載體，可以安全使用在臨床實踐中；此外采用致死平衡系統攜帶外源抗原，可以保證只有攜帶外源抗原的疫苗株才能在生產疫苗和進入宿主體內存活，提高疫苗的免疫效率。

進一步地，本發明所述步驟1）中，以豬霍亂沙門氏菌C78-3的基因組為模板，由引物P1和P2經PCR擴增得pipC同源臂基因序列；以豬霍亂沙門氏菌C78-3的基因組為模板，由引物P3和P4經PCR擴增得pipD基因的同源臂序列；將pipC同源臂基因序列和pipD基因的同源臂序列以堿基長度1:1的比例混合制得混合產物；以混合產物作為模板，利用引物P1和引物P4進行Overlap PCR擴增得到長度為493bp的同源臂片段，并將該同源臂片段連接至pM18T克隆載體，轉化之JM109感受態細胞，提取上述細菌質粒，再經KpnI和SacI酶切，連接至具有氯霉素和蔗糖篩選標記的自殺質粒載體pRE112中，得到缺失ΔsopB基因序列的pRE112載體。

所述引物P1、P2、P3和P4的核苷酸序列分別為：

P1：5’- CGCAGAGCTCATATCACCTATAATTATC - 3’；

P2：5’- CATATAGTTACCTCAAGACAGCGTTTTTAATATTCCTG - 3’；

P3：5’- CAGGAATATTAAAAACGCTGTCTTGAGGTAACTATATG - 3’；

P4：5’- ATTAGGTACCAGCAGTATTGTCTGCGTCAGC - 3’。

所述步驟2）中，取缺失了ΔmanA、ΔP_crp::TT araC P_BADcrp和ΔrelA::araC P_BADlacI TT基因的C78-3豬霍亂沙門氏菌于LB液體培養基中，經10-12小時培養，制得受體菌菌液；將含ΔsopB突變基因的自殺載體于LB液體中，經10-12小時培養，制得供體菌培養菌液；所述用于培養含ΔsopB突變的自殺載體的LB液體中，2,6-二氨基庚二酸（DAP）含量為50ug/mL，氯霉素含量為25mg/mL。

所述步驟2）中，純化后，挑取單菌落于LB液體培養基中培養至云霧狀，10倍系列稀釋涂布于LB固體培養基中；從固體培養基挑取單菌落分別于LB板、含氯霉素的LB板劃線，于37℃環境下經10-12小時培養，然后挑取只在LB中生長的引入ΔsopB突變的rSC0013株。

所述步驟3）中，取rSC0013株于LB液體培養基中，經10-12小時培養，制得制得受體菌菌液；取含ΔasdA自殺載體χ7213(pS004) 于LB液體培養基中，經10-12小時培養，制得供體菌培養菌液；所述用于培養含ΔasdA自殺載體χ7213(pS004)的LB液體培養基中，2,6-二氨基庚二酸（DAP）含量為50ug/mL，氯霉素含量為25mg/mL。

試驗證明，本發明在阿拉伯糖調控毒力基因延遲減毒和延遲表達外源抗原的載體上構建的含有ΔsopB突變基因的豬霍亂沙門氏菌載體，能夠降低豬霍亂沙門氏菌減毒株的毒力，減輕減毒株引起的炎性反應對宿主的損傷作用，顯著提高豬霍亂沙門氏菌所攜帶的外源抗原誘導宿主的免疫原性，從而使含有sopB突變基因的攜帶豬鏈球菌SaoA蛋白的豬霍亂沙門氏菌疫苗候選株rSC0016（pS-SaoA）能夠對SS2及SS7野毒株的感染提供完全的保護和交叉保護作用。

附圖說明

圖1是ΔsopB基因缺失構建圖。

圖2是ΔsopB突變自殺載體圖。

圖3是含ΔsopB突變的χ7213(pS006)的PCR鑒定電泳圖。其中，泳道1：DL2000 DNA marker；泳道2-7：陽性結果（即：鑒定為突變陽性的樣品進一步純化后隨機抽取菌落的PCR電泳圖；以下出現的“陽性結果”，除非特殊說明，均為這種情況）。

圖4是含ΔsopB突變的rSC0013的PCR鑒定電泳圖。其中，泳道1：DL2000 DNA marker；泳道2-3：rSC0017陽性結果；泳道4-6：rSC0013陽性結果。

圖5是含ΔasdA突變rSC0016的PCR鑒定電泳圖。其中，泳道1：DL2000 DNA marker；泳道2-6：rSC0016陽性結果。

圖6是不同毒株感染兔回腸的炎性分泌物體積和接種后時間關系圖。圖中，##：與野毒株C78-3株比較（p<0.01），**：與LB空白對照組比較（P<0.01）。

圖7是不同毒株感染兔回腸的炎性分泌物細菌總數。圖中， #：與野毒株C78-3株比較（p<0.05），**：與LB空白對照組比較（P<0.01）。

圖8是接種野毒株 C78-3后兔回腸的病理變化（H.E染色）圖片。

圖9是接種rSC0016后兔回腸的病理變化（H.E染色）圖片。

圖10是接種LB后兔回腸的病理變化（H.E染色）圖片。

圖11是擴增saoA基因的PCR鑒定電泳圖。其中，泳道1：DL2000 DNA Marker；泳道2-6：擴增saoA基因PCR電泳圖。

圖12是pS-SaoA重組表達質粒的酶切鑒定電泳圖。其中，泳道1：DL10000 DNA Marker；泳道2-4：陽性結果酶切電泳圖。

圖13是重組質粒的酶切鑒定電泳圖。其中，泳道1：DL10000 DNA Marker；泳道2：rSC0016(pS-SaoA)；泳道3：rSC0011(pS-SaoA)；泳道4：rSC0018(pS-SaoA)。

圖14是Western-blot檢測SaoA在rSC0016(pS-SaoA)、rSC0018(pS-SaoA)、rSC0011(pS- SaoA)菌株中的表達電泳圖。其中，泳道1：蛋白Marker；泳道2：rSC0011(pS-SaoA)；泳道3：rSC0016(pS- SaoA)；泳道4：rSC0018(pS-SaoA)。

圖15是pS-SaoA質粒在rSC0016(pS-SaoA)中傳10-50代酶切電泳圖。其中，泳道1：DL10000 DNA marker；泳道2-6：rSC0016(pS-SaoA)10-50代。

圖16是減毒株在BALB/c小鼠肝臟中定植能力比較實驗圖。

圖17是減毒株在BALB/c小鼠脾臟中定植能力比較實驗圖。

圖18是減毒株在BALB/c小鼠腸道派伊爾氏結中定植能力比較實驗圖。

圖19是免疫減毒株BALB/c小鼠血清中抗SaoA的IgG圖。

圖20是免疫減毒株BALB/c小鼠血清中抗沙門氏菌OMPs的IgG圖。

圖21是免疫減毒株BALB/c小鼠陰道沖洗液中抗SaoA的IgA圖。

圖22是ELISA檢測免疫減毒株BALB/c小鼠肺和脾中細胞因子IFN-γ含量的圖。

圖23是ELISA檢測免疫減毒株BALB/c小鼠肺和脾中IL-4含量的圖。

圖24是ELISA檢測免疫減毒株BALB/c小鼠血清中細胞因子IFN-γ含量的圖。

圖25是ELISA檢測免疫減毒株BALB/c小鼠血清中IL-4含量圖。

圖26是ELISA檢測免疫減毒株試驗豬血清中針對豬鏈球菌SS2 SaoA蛋白的抗體IgG水平圖。

圖27是ELISA檢測免疫減毒株試驗豬血清中針對豬霍亂沙門氏菌外膜蛋白OMPs抗體IgG水平圖。

圖28是ELISA檢測免疫減毒株試驗豬鼻腔棉拭子中針對豬鏈球菌SS2SaoA的粘膜抗體IgA水平圖。

圖29是ELISA檢測免疫減毒株試驗豬肺和脾中細胞因子IFN-γ含量的圖。

圖30是ELISA檢測免疫減毒株試驗豬肺和脾中細胞因子IL-4含量的圖。

圖31是ELISA檢測免疫減毒株試驗豬肺和脾中細胞因子IL-17含量的圖。

圖32是ELISA檢測免疫減毒株試驗豬血清中細胞因子IFN-γ含量的圖。

圖33是ELISA檢測免疫減毒株試驗豬肺和脾中細胞因子IL-4含量的圖。

圖34是ELISA檢測免疫減毒株試驗豬肺和脾中細胞因子IL-17含量的圖。

圖35是免疫減毒株試驗豬經SS2攻毒的存活率比較的圖。

圖36是PBS對照組試驗豬經SS2攻毒腦組織病理變化照片。

圖37是PBS對照組試驗豬經SS2攻毒肺組織病理變化照片。

圖38是免疫rSC0018(pYA3493)株試驗豬經SS2攻毒腦組織病理變化照片。

圖39是免疫rSC0018(pYA3493)株試驗豬經SS2攻毒肺組織病理變化照片。

圖40是免疫rSC0018(pS-SaoA)株試驗豬經SS2攻毒腦組織病理變化照片。

圖41是免疫rSC0018(pS-SaoA)株試驗豬經SS2攻毒肺組織病理變化照片。

圖42是免疫rSC0016(pYA3493)株試驗豬經SS2攻毒腦組織病理變化照片。

圖43是免疫rSC0016(pYA3493)株試驗豬經SS2攻毒肺組織病理變化照片。

圖44是免疫rSC0016(pS-SaoA)株試驗豬經SS2攻毒腦組織照片。

圖45是免疫rSC0016(pS-SaoA)株試驗豬經SS2攻毒肺組織照片。

圖46是經SS2攻毒后時間與體溫的變化關系圖。

具體實施方式

為了闡明本發明的技術方案及技術目的，下面結合附圖及具體實施方式對本發明做進一步的介紹。

一、構建豬霍亂沙門氏菌減毒載體：

1、構建含ΔsopB突變基因的自殺載體及鑒定：

根據Genbank中豬霍亂沙門氏菌的全基因序列，找到其中ΔsopB基因全基因序列及其上下游序列，根據該基因上下游基因設計引物P1、P2、P3和P4，以上下游基因的300bp左右的片段為同源臂，敲除sopB基因（ATG到TAA），如圖1所示。

具體步驟如下：以豬霍亂沙門氏菌C78-3的基因組為模板，由引物P1和P2經PCR擴增得pipC同源臂基因序列，稱為片段1；以豬霍亂沙門氏菌C78-3的基因組為模板，由引物P3和P4經PCR擴增得pipD基因的同源臂序列，稱為片段2。將片段1和片段2按照堿基長度1:1混合，將上述混合產物作為模板，利用引物P1和引物P4進行Overlap PCR擴增得到長度為493bp的同源臂片段。回收該同源臂片段連接至pM18T克隆載體，轉化之JM109感受態細胞，提取上述細菌質粒，再經KpnI和SacI酶切，連接至具有氯霉素和蔗糖篩選標記的自殺質粒載體pRE112中（圖2），經酶切鑒定與序列測定，將正確缺失ΔsopB基因序列的pRE112載體（命名為pS006）電轉化至工程菌大腸桿菌χ7213中，命名為：χ7213（pS006），于-20℃備用。

引物P1、P2、P3和P4的核苷酸序列分別為：

P1：5’- CGCAGAGCTCATATCACCTATAATTATC - 3’。

P2：5’- CATATAGTTACCTCAAGACAGCGTTTTTAATATTCCTG - 3’。

P3：5’- CAGGAATATTAAAAACGCTGTCTTGAGGTAACTATATG - 3’。

P4：5’- ATTAGGTACCAGCAGTATTGTCTGCGTCAGC - 3’。

使用引物P1和P4通過PCR鑒定含ΔsopB突變的自殺載體χ7213(pS006)，含ΔsopB突變的PCR陽性片段大小為493bp，由圖3可見：含ΔsopB突變基因的自殺載體χ7213(pS006)構建成功。

2、構建引入ΔsopB突變基因的rSC0013株：

分別用野生型豬霍亂沙門氏菌C78、缺失了ΔmanA、ΔP_crp::TT araC P_BADcrp和ΔrelA::araC P_BADlacI TT基因的C78-3豬霍亂沙門氏菌為受體菌，供體菌為步驟1)中所制得的χ7213（pS006）（含ΔsopB突變基因的自殺載體）。在缺失了ΔmanA、ΔP_crp::TT araC P_BADcrp和ΔrelA::araC P_BADlacI TT基因的C78-3豬霍亂沙門氏菌中引入ΔsopB突變，構建取得rSC0013株。

具體方法如下：

按照中國專利文獻CN 104498418A的說明書第0040至0101段中方法制備取得缺失了ΔmanA、ΔP_crp::TT araC P_BADcrp和ΔrelA::araC P_BADlacI TT基因的C78-3豬霍亂沙門氏菌，命名為豬霍亂沙門氏菌rSC0010。

制備受體菌菌液：挑取豬霍亂沙門氏菌rSC0010于5mL的LB液體培養基中，經10-12小時培養。

制備供體菌菌液：將含ΔsopB突變基因的自殺載體χ7213(pS006)置于5mL的LB液體中（其中含50ug/mL 2,6-二氨基庚二酸（DAP），25mg/mL的氯霉素，經10-12小時培養。

將供體菌和受體菌進行接合，并經10-12小時培養，再純化至單菌落。

挑取單菌落于LB液體培養基中培養至云霧狀，10倍系列稀釋涂布于LB（含5%蔗糖）固體培養基中；從固體培養基挑取單菌落分別于LB板、含氯霉素的LB（含25mg/mL的氯霉素）板劃線，于37℃過夜培養，然后挑取只在LB中生長的單菌落。

根據以上引物P1和P4進行菌落PCR鑒定ΔsopB突變。ΔsopB缺失株陽性菌的PCR片段大小為493 bp，將C78-3（ΔsopB）和構建成的引入ΔsopB突變基因 (ΔP_crp::TT araCP_BADcrp，ΔmanA ，ΔrelA::araC P_BADlacI TT + ΔsopB）分別命名為rSC0017株和rSC0013株。

由圖4可見：rSC0017株（圖4中2-3電泳道）和rSC0013株（圖4中4-6電泳道）中成功引入ΔsopB突變。對PCR鑒定結果正確的菌株進行純化再鑒定。對再鑒定正確的菌株PCR擴增其sopB基因上下游序列，并送南京金斯瑞公司進行序列測定，將測序結果正確的菌株保存。

3、構建減毒豬霍亂沙門氏菌rSC0016：

在rSC0013(ΔmanA，ΔP_crp::TT araC P_BADcrp，ΔrelA::araC P_BADlacI TT，ΔsopB）中引入ΔasdA突變基因。

具體如下：

制備受體菌菌液：挑取rSC0013單菌落于5mL的LB液體培養基中，經10-12小時培養。

按照中國專利文獻CN 104498418A的說明書中第0066～0071段方法取得含ΔasdA自殺載體χ7213(pYAs004)。

制備供體菌菌液：挑取含ΔasdA自殺載體χ7213(pYAs004)于5 mL的LB液體培養基(含50 μg/mL 2,6-二氨基庚二酸，25 mg/mL 氯霉素)中，經10-12小時培養。

取供體菌和受體菌的菌液各100 μL涂布接合于LB固體培養基(含50 mg/mL 2,6-二氨基庚二酸)中，37℃恒溫培養箱培養過夜；刮取菌苔轉接種于LB固體培養基(含50 μg/mL 2,6-二氨基庚二酸 ，25 mg/mL氯霉素)，在37℃環境下經10-12小時培養；純化至接合菌在LB固體培養基(含50 μg/mL 2,6-二氨基庚二酸 ，25 mg/mL 氯霉素)上長出單菌落，挑取幾個單菌落于LB(含50 μg/mL 2,6-二氨基庚二酸)液體培養基中，37℃、220 rpm振蕩培養至菌液呈云霧狀；取100 μL菌液，連續10倍稀釋至合適的濃度涂布于LB固體培養基(含50 mg/mL 2,6-二氨基庚二酸，5% 蔗糖)中；挑取單菌落分別于普通LB固體培養基、含氯霉素的LB固體培養基(含25 mg/mL 氯霉素)、含氯霉素和2,6-二氨基庚二酸的LB固體培養基(含50 mg/mL 2,6-二氨基庚二酸，25 mg/mL 氯霉素)中鑒別培養，挑取只在含有2,6-二氨基庚二酸的LB固體培養基中生長的單菌落。

用公開發表的引物ΔasdA-F和ΔasdA-R進行菌落PCR鑒定ΔasdA突變。ΔasdA缺失株陽性菌的PCR片段大小為633bp，由圖5說明：rSC0013(ΔmanA ΔP_crp::TT araC P_BADcrp ΔrelA::araC P_BADlacI TT ΔsopB）引入ΔasdA突變已構建成功。對再鑒定正確的菌株PCR擴增其asdA基因上下游序列，并送南京金斯瑞公司進行序列測定，將測序結果正確的菌株命名為rSC0016。

引物ΔasdA-F：TGCTCTAGATGTGCATGGCAATCGCCCAAC。

引物ΔasdA-R：TCCCCCGGGTATCTGCGTCGTCCTACCTTC。

rSC0016保藏在位于中國北京市朝陽區北辰西路1號院3號的中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)，保藏日為2016年6月20日，保藏編號為CGMCC NO.12645，該生物材料的分類命名為:減毒豬霍亂沙門氏菌,拉丁文學名為:Salmonella choleraesuis。

二、對構建的減毒豬霍亂沙門氏菌rSC0016進行表型鑒定：

1、rSC0016中ΔsopB突變的表型鑒定：

取健康的8周齡的新西蘭大白兔隔夜禁食，氣管注射異氟烷麻醉，使回腸暴露，每隔5-6cm用線結扎，間隔1cm，共計結扎3個腸段。每段回腸分別注射1mL總細菌數為1×10⁹CFU的豬霍亂沙門氏菌C78-3、rSC0017（C78-3（ΔsopB），來源于實施例1步驟2）制備所得）和LB液體培養基為空白對照。縫合腹部肌肉組織和皮膚，新西蘭大白兔用毛毯維持體溫在37℃左右。手術8小時后，新西蘭大白兔用戊巴比妥鈉氣管注射實施安樂死。重新打開兔子腹部，收集每段回腸中的分泌物，并比較它們的體積；然后將上述分泌物稀釋至合適的稀釋度后于麥康凱瓊脂培養基涂布分離試驗菌株，計算回腸分泌物中細菌總量；同時取各段回腸用福爾馬林溶液固定制作組織病理切片，觀察不同菌株對新西蘭兔子腸道的炎癥反應。結果顯示含ΔsopB突變的rSC0017感染的回腸中炎性分泌物及細菌總量顯著少于野毒株C78-3株（如圖6和圖7，##：p<0.01；#：p<0.05），但是都顯著多于LB空白對照組（如圖6和圖7，**：P<0.01）；HE染色結果也顯示含ΔsopB突變的rSC0017株腸組織內炎性細胞明顯少于C78-3野毒株，腸絨毛較野毒株組更整齊。證明ΔsopB突變能明顯降低豬霍亂沙門氏菌野毒株引起的腸道炎性反應，如圖8、9、10所示。實驗結果為三次實驗重復的平均。圖8為接種野毒株C78-3后，腸黏膜炎性細胞浸潤；圖9為接種rSC0016后，腸黏膜絨毛完整；圖10為接種LB，腸黏膜絨毛完整。

2、rSC0016中ΔasdA突變的表型鑒定：

在中國標準弱毒株C500（購自中檢所）中通過上述同源重組的方法引入ΔasdA 突變，命名為rSC0018，作為在下面的實驗中沒有阿拉伯糖調控延遲減毒和沒有sopB基因缺失的陰性對照毒株。

挑取rSC0016、rSC0018單菌落分別接種5 mL LB液體培養基和含2,6-二氨基庚二酸的LB液體培養基(含50 μg/mL 2,6-二氨基庚二酸)中，于37 ℃恒溫搖床220rpm振蕩培養過夜，觀察該菌在兩種不同營養條件中培養的生長狀態。結果可見ΔasdA突變的菌株在無外源2,6-二氨基庚二酸的環境下不生長，LB液體培養基清亮透明。該結果表明，rSC0016、rSC0018只有在含有2,6-二氨基庚二酸的LB液體培養基中才能生長，在LB液體培養基中不能生長，因而rSC0016、rSC0018株的ΔasdA突變成功。

三、應用：

豬鏈球菌病是一種重要人畜共患傳染病，不僅影響著養豬業健康發展，還嚴重危害著人類的健康。目前我國的豬用商品化鏈球菌疫苗還存在著諸多不完善的方面。

在本實施例中，選擇大多數豬鏈球菌血清型菌株都有的Sao（surface antigen one）作為減毒株的異源抗原，克隆到原核表達載體pYA3493中，稱為含有saoA基因的原核表達質粒pS-SaoA。將pS-SaoA轉化至含有阿拉伯糖調控的延遲減毒和延遲表達外源抗原系統和sopB和asdA基因缺失的霍亂沙門氏菌減毒株rSC0016中，形成疫苗候選株rSC0016(pS-SaoA)菌株，并在BALB/c小鼠和斷奶仔豬中進行了毒力和免疫保護效率的評價，為豬病的防控提供新的思路。

1、構建rSC0016(pS-SaoA)、SC0011(pS-SaoA)、rSC0018(pS-SaoA)菌株：

1）構建asd⁺的表達SaoA蛋白原核表達質粒pS-SaoA：

參照GenBank中豬鏈球菌2型菌設計擴增saoA基因的引物saoA-F和saoA-R，以CVCC3928豬鏈球菌2型為模板，PCR擴增saoA基因777bp（見圖11）。將測序正確的saoA基因，與原核表達載體Asd⁺ pYA3493經雙酶切后回收產物，并連接，轉化至工程菌χ7213中。使用表3中saoA-F，saoA-R引物進行菌落PCR和酶切鑒定，最終獲得PCR和酶切鑒定皆陽性的χ7213(pS-SaoA)菌株，其中pYA3493片段大小3133 bp，saoA片段大小777 bp（如圖12），再次測序鑒定saoA基因，結果正確。

擴增saoA所用的引物saoA-F和saoA-R序列：

saoA-F：ATGGATCCCAACCTGATGGGGGAC；

saoA-R：GCGTCGACCATTGCTTCCTTAGAG。

2）構建rSC0016(pS-SaoA)、rSC0011(pS-SaoA)、rSC0018(pS-SaoA)、rSC0016(pYA3493)、rSC0011(pYA3493)、rSC0018(pYA3493)菌株：

提取χ7213(pS-SaoA)和χ7213(pYA3493)菌株的質粒，即表達SaoA蛋白的asd⁺ 原核表達質粒pS-SaoA和空載體質粒pYA3493。將pS-SaoA和pYA3493質粒通過熱激法轉化入減毒豬霍亂沙門氏菌rSC0016、rSC0011和rSC0018感受態細胞中。

具體操作為：無菌條件下取適量pS-SaoA或pYA3493質粒分別與rSC0016、rSC0011、rSC0018感受態菌；混勻后冰浴30min，42℃熱激90s，加入700μL LB液體培養基，于37℃恒溫搖床100rpm振蕩培養45min；取上述菌液200μL，涂布于LB固體培養基，于37℃恒溫培養箱培養24h；挑取表面光滑呈灰白色的單菌落，使用表3中saoA-F，saoA-R引物進行菌落PCR鑒定，通過提質粒和酶切鑒定；對PCR陽性菌進行純培養再酶切鑒定，酶切結果見pYA3493空載體是3113bp，saoA基因是777bp（如圖13所示）。最終獲得PCR和酶切鑒定皆陽性的rSC0016(pS-SaoA)、rSC0016(pYA3493)、rSC0018(pS-SaoA)、rSC0018(pYA3493)、rSC0011(pS-SaoA)和rSC0011(pYA3493)株。

2、檢測rSC0016(pS-SaoA)、rSC0011(pS-SaoA)、rSC0018(pS-SaoA)菌株SaoA蛋白表達及表達量比較：

挑取上步過程中鑒定結果正確的rSC0016(pS-SaoA)、rSC0011(pS-SaoA)、rSC0018(pS- SaoA)菌株的單菌落，分別于5毫升LB液體培養基中220rpm 37℃震蕩培養至OD₆₀₀值均為0.8時離心收集菌體，加1mL PBS重懸。用超聲細胞裂解儀裂解上述菌體至菌液澄清透亮，12000rpm離心取上清。取等量的該上清液進行Western Blot鑒定。將rSC0016(pS-SaoA)、rSC0018(pS-SaoA)、rSC0011(pS-SaoA)菌株的超聲裂解液進行Western Blot鑒定。結果如圖14，可見三種菌株均能表達SaoA蛋白，且在相同OD值的情況下，等量rSC0016(pS-SaoA)菌液（圖14中標號3）中表達的SaoA蛋白量略高于rSC0011(pS-SaoA)，顯著高于rSC0018(pS-SaoA)（圖14中標號2和4）表達的量。

3、 pS-SaoA質粒在rSC0016(pS-SaoA)中的穩定性測定：

挑取鑒定完全正確的rSC0016(pS-SaoA)單菌落接種于2mL LB液體培養基，于37℃恒溫搖床振蕩培養。以12h為一代，將菌液按照1:100接種新鮮的LB液體培養基，如此連續傳至50代。分別挑取10、20、30、40、50代單菌進行雙酶切鑒定。結果顯示，雙酶切后出現pYA3493和saoA的條帶，與預期結果相符合，如圖15所示。結果表明pS-SaoA重組質粒能在rSC0016中穩定復制傳代。

4、 rSC0016(pYA3493)、rSC0018(pYA3493)、rSC0011(pYA3493)和C78-3的定植實驗：

挑取rSC0016(pYA3493)、rSC0018(pYA3493)和rSC0011(pYA3493)和C78-3于5 mL的LB液體培養基，于37℃震蕩培養12h，按體積比1:100接種于50 mL的LB液體培養基，于37℃恒溫搖床上振蕩培養至菌液的OD600值為0.9左右，離心收集菌體，加入PBS重懸沉淀，連續10倍稀釋。取100μL連續10倍稀釋至合適的稀釋度并于麥康凱培養基上計數，另外一部分菌液用于接種小鼠。48只6周齡雌性BALB/c小鼠分為4組，每組12只，每組分別口服接種1×10⁹的rSC0016(pYA3493)、rSC0018(pYA3493)、rSC0011(pYA3493)，C78-3（野毒株）；在接種后第3d，7d，14d，21d無菌剖取3只小鼠的肝、脾、腸道派伊爾氏淋巴小結，稱重、研磨，10倍稀釋組織勻漿液，取100μL的菌液計數。肝、脾勻漿液涂布LB固體培養基，腸系膜淋巴小結勻漿液涂布麥康凱培養基，于37℃恒溫培養24h；根據相應培養基上菌落生長結果，計算臟器中細菌含量。結果顯示，由于C78-3是豬霍亂沙門氏菌強毒株，在接種第3d，在肝臟、脾臟和腸道派伊爾氏淋巴小結中可以分離到比減毒株多很多的C78-3菌株（圖16、17、18中，$$，p<0.01），第5d，所有接種C78-3的小鼠全部死亡；而3個減毒株隨著接種時間的增長，各減毒株在各臟器上的菌量逐漸減少。 rSC0016(pYA3493) 在小鼠肝臟及脾臟中的定植數量與rSC0018(pYA3493)菌株的定植數量相似，并都顯著低于rSC0011(pYA3493) 菌株的定植數量（圖16、17中，##，p<0.01），表明rSC0016(pYA3493)和rSC0018(pYA3493) 的毒力低于rSC0011。但在腸道派伊爾氏淋巴小結，口服后7d-21d， rSC0016(pYA3493)和rSC0011(pYA3493)的定植能力相似，都顯著強于rSC0018(pYA3493)株的定植能力（圖18中，**， p<0.01），表明rSC0016(pYA3493)在淋巴組織的定居能力與rSC0011(pYA3493)株的定植能力一樣強。

四、對疫苗候選株進行在BALB/c小鼠中的免疫效果評價：

挑取rSC0016(pS-SaoA)、rSC0016(pYA3493)、rSC0018(pS-SaoA)、rSC0018(pYA3493)、rSC0011(pS-SaoA)、rSC0011(pYA3493)于5 mL的LB液體培養基，于37 ℃震蕩培養12h，按體積比1:100接種于50 mL的LB液體培養基，于37℃恒溫搖床上振蕩培養至菌液的OD₆₀₀值為0.9左右，離心收集菌體，加入PBS重懸沉淀，連續10倍稀釋。取100μL連續10倍稀釋至合適的稀釋度并于麥康凱培養基上計數，另外一部分菌液用于免疫小鼠。

105只6周齡的BALB/c小鼠分為7組，每組15只小鼠。其中1組口服PBS作為陰性對照組。另外6組分別口服免疫10⁹CFU/20μL的rSC0016(pS-SaoA)、rSC0016(pYA3493)、rSC0018(pS-SaoA)、rSC0018(pYA3493)、rSC0011(pS-SaoA)、rSC0011(pYA3493)菌液。首免后3周加強免疫一次。于首免后3周、5周從小鼠的頜下靜脈采血，同時用PBS沖洗陰道，收集陰道黏膜沖洗液。將收集到的血液于4 ℃過夜制得血清。用間接ELISA檢測血清和陰道粘膜沖洗液針對豬鏈球菌2型的SaoA蛋白的IgG和IgA抗體效價。在二免后0.5d、3d和5d，各組從小鼠頜下靜脈采血收集血清，并在二免后7d時各組安樂死5只小鼠，取脾臟，肺臟制成勻漿離心取上清，由細胞因子IFN-γ及IL-4的檢測試劑盒檢測由各毒株誘導小鼠的細胞和體液免疫應答水平；在首免后5周，對各組剩下的10只小鼠，用30×LD₅₀的SS2毒株通過腹腔注射途徑進行攻毒，觀察21天并記錄小鼠存活情況。

1、各減毒株免疫BALB/c小鼠后誘導的針對SaoA蛋白IgG和黏膜免疫抗體IgA的測定：

用純化的SaoA蛋白包被酶標版，間接ELISA的方法檢測首次免疫3周、5周血清中針對SaoA的IgG效價以及陰道沖洗液中IgA效價，用C78-3外膜蛋白OMPs包被酶標版，間接ELISA的方法檢測血清中誘導的針對豬霍亂沙門氏菌外膜蛋白OMPs的IgG效價，每個樣品重復檢測3次。結果見圖19、20、21所示，所有免疫含有SaoA蛋白的減毒株誘導的針對SaoA蛋白的血清IgG和陰道黏膜抗體IgA的效價都顯著高于不含有SaoA蛋白的空載體減毒株誘導的抗體效價（見圖19和21，**，P<0.01）；在首免后第3周和第5周，免疫rSC0016（pS-SaoA）株和rSC0011（pS-SaoA）株小鼠產生的針對SaoA的血清抗體IgG水平及粘膜抗體IgA水平明顯高于免疫rSC0018（pS-SaoA）株（見圖19和21，#，P<0.05；##，p<0.01）；首免后第5周，免疫rSC0016（pS-SaoA）株或rSC0016（pYA3493）株的小鼠產生的針對豬霍亂沙門氏菌的OMPs的血清抗體IgG水平明顯高于免疫rSC0018（pYA3493）株的小鼠（見圖20，#，P＜0.05）。

2、各減毒株免疫BALB/c小鼠后誘導的IFN-γ及IL-4的水平測定：

取二免后7d的BALB/c小鼠，剖取整脾及整肺，制成勻漿。反復凍融后12000rpm離心1min取上清。取二次免疫后0.5d、3d和5d，頜下靜脈采血收集血清。

將上述組織勻漿上清以及血清作為樣品，用ELISA測定小鼠IL-4、IFN-γ的試劑盒測定小鼠細胞因子水平，二免后7d的結果見圖22、23、24、25所示，免疫rSC0016（pS-SaoA）、rSC0011（pS-SaoA）和rSC0018（pS-SaoA）的小鼠產生的IFN-γ和IL-4水平都顯著高于免疫含有空載體的減毒株誘導的水平（圖22、23、24、25，**，P＜0.01）；免疫rSC0016（pS-SaoA）小鼠肺臟和脾臟中細胞因子IFN-γ水平顯著高于免疫rSC0011（pS-SaoA）或免疫rSC0018（pS-SaoA）組小鼠肺臟和脾臟中細胞因子IFN-γ水平（圖22，#，p<0.05；##，P＜0.01）；且免疫rSC0016（pS-SaoA）及rSC0011（pS-SaoA）株小鼠肺臟及脾臟中細胞因子IFN-γ及IL-4的水平均顯著高于免疫rSC0018（pS-SaoA）株的組（圖22、23，#，p<0.05；##，P＜0.01）。

免疫小鼠的血清中細胞因子的檢測結果見圖24、25所示，免疫rSC0016（pS-SaoA）、rSC0011（pS-SaoA）和rSC0018（pS-SaoA）的小鼠產生的IFN-γ和IL-4水平都顯著高于免疫含有空載體的減毒株誘導的水平（圖24、25，*，p<0.05；**，P＜0.01）；免疫rSC0016（pS-SaoA）組的小鼠血清中IFN-γ及IL-4的濃度在二免后12小時達到最高峰值，在加強免疫后72h內明顯高于免疫rSC0011（pS-SaoA）、rSC0018（pS-SaoA）組（圖24、25，#，p<0.05；##，P＜0.01）；免疫rSC0011（pS-SaoA）組的小鼠血清IFN-γ和IL-4濃度在二免后72h內濃度均明顯高于免疫rSC0018（pS-SaoA）組（圖24、25，##，P＜0.01）。

3、免疫小鼠的攻毒：

在首免后5周，對各組剩下的10只小鼠，用30×LD₅₀的SS2毒株通過腹腔注射途徑進行攻毒，觀察21天并記錄小鼠存活情況。攻毒后，口服免疫rSC0016(pS-SaoA)的小鼠在21d的觀察期內均存活，口服免疫rSC0011(pS-SaoA)的小鼠的存活率是40%，而口服免疫rSC0018(pS-SaoA)、rSC0016(pYA3493)、rSC0011(pYA3493)、rSC0018(pYA3493)和對照組的小鼠在24h-48h內全部死亡，如下表所示。

SS2攻毒保護效力表：

五、對疫苗候選株進行在斷奶仔豬中的免疫效果評價：

1、疫苗候選株的準備和仔豬的免疫：

挑取rSC0016(pS-SaoA)、rSC0016(pYA3493)、rSC0018((pS-SaoA)、rSC0018(pYA3493)于5 mL的LB液體培養基，于37 ℃震蕩培養8h，按體積比1:100接種于100 mL的LB液體培養基，于37 ℃恒溫搖床上振蕩培養至菌液的OD₆₀₀值為0.9左右，離心收集菌體，加入PBS重懸沉淀，連續10倍稀釋。取100μL連續10倍稀釋至10^-7、10^-8、10^-9，并于LB固體培養基上計數，剩余菌液用于免疫仔豬。

65只21日齡的斷奶仔豬分為5組，每組13只；一組作為空白對照組；其余4組經口服分別灌服10⁹CFU的rSC0016(pS-SaoA)、rSC0016(pYA3493)、rSC0018(pS-SaoA)、rSC0018(pYA3493)株；各組首免3周后加強免疫一次，于首免后3周、5周從仔豬的前腔靜脈采血，同時收集免疫豬的鼻腔黏膜拭子。將收集到的血液于4 ℃過夜制得血清；在二免后0.5d、3d和5d，各組從仔豬的前腔靜脈采血收集血清；在二免后7d時各組安樂死3只仔豬，取脾臟，肺臟制成勻漿離心取上清，對免疫豬的血清和脾臟、肺臟組織勻漿上清，用豬細胞因子IFN-γ、IL-4及IL-17檢測試劑盒檢測由各毒株誘導免疫豬的細胞和體液免疫應答水平；在首免后5周，各組中分別取5只免疫豬用5.0×10⁸劑量的SS2，取5只免疫豬用1.0×10¹⁰SS7毒株，經耳靜脈注射攻毒，觀察14天并記錄仔豬臨床癥狀及存活情況，對死亡豬進行剖解，采集病死豬的腦和肺組織進行病理變化的觀察。

2、免疫后仔豬產生的針對SaoA蛋白的抗體水平檢測：

首免后3周、5周在前腔靜脈采血制成血清，同時取鼻腔棉拭子。用純化的SaoA蛋白包被酶標板，間接ELISA檢測血清中針對豬鏈球菌SaoA蛋白的IgG和鼻腔粘膜中IgA抗體效價，針對豬霍亂沙門氏菌載體OMPs的IgG效價。結果如圖26、27、28所示。首免3周和5周后，免疫rSC0016(pS-SaoA)株和rSC0018(pS-SaoA)株的仔豬產生的針對SaoA的血清抗體IgG效價和粘膜抗體IgA效價均顯著高于免疫空載體組(圖26、28，**，P＜0.01)；免疫rSC0016(pS-SaoA)株組產生的針對SaoA的血清抗體IgG效價和粘膜抗體IgA效價均顯著高于免疫rSC0018(pS-SaoA)株組（圖26、28，#，p<0.05；##，P＜0.01）；免疫rSC0016株組的仔豬產生的針對載體菌OMPs的血清抗體IgG水平也明顯高于免疫rSC0018株組（圖27，#，P＜0.05；##，P＜0.01）。

3、免疫后仔豬IFN-γ及IL-4、IL-17的水平測定：

分別在加強免疫后0.5d、3d和5d，經前腔靜脈采血收集血清；并于7d時每組各剖殺3只仔豬，取脾臟，肺臟制成勻漿。經豬細胞因子ELISA試劑盒檢測血清和組織勻漿中細胞因子IFN-γ、IL-4、IL-17的水平。結果如圖29、30、31、32、33、34所示：二免7天后，在仔豬脾臟和肺臟中，免疫rSC0016（pS-SaoA）和rSC0018（pS-SaoA）誘導的IFN-γ、IL-4和IL-17水平都顯著高于免疫空載體的菌株（圖29、30、31，**，p<0.01）；在肺臟中，免疫rSC0016（pS-SaoA）組產生的IFN-γ、IL-4和IL-17水平都顯著高于免疫傳統減毒株rSC0018（pS-SaoA）組(圖29、30、31，#，p<0.05；##，P＜0.01)；在脾臟中，免疫rSC0016（pS-SaoA）減毒株組血清中的細胞因子IFN-γ、IL-4的濃度均明顯高于免疫傳統弱毒疫苗株rSC0018（pS-SaoA）疫苗株組圖29、30、31，#，p<0.05；##，P＜0.01)。

免疫仔豬血清中細胞因子的檢測結果（見圖20）顯示，在加強免疫后72h內，免疫rSC0016（pS-SaoA）和rSC0018（pS-SaoA）的仔豬產生的IFN-γ和IL-4 IL-17水平都顯著高于免疫含有空載體的減毒株誘導的水平（圖32、33、34，*，p<0.05；**，P＜0.01）；在加強免疫后48h內，免疫rSC0016（pS-SaoA）和rSC0018（pS-SaoA）的仔豬產生的IL-17水平都顯著高于免疫含有空載體的減毒株誘導的水平（圖34，*，p<0.05；**，P＜0.01）；在加強免疫后72h內，免疫rSC0016（pS-SaoA）組的仔豬血清中IFN-γ、IL-4和IL-17的濃度明顯高于免疫rSC0018（pS-SaoA）組（圖32、33、34，#，p<0.05；##，P＜0.01）。

4、免疫仔豬的攻毒：

為評價ΔsopB在提高豬霍亂沙門氏菌的免疫原性，檢測其對豬鏈球菌2及7型攻擊的保護力，對口服免疫rSC0016(pS-SaoA) 、rSC0016(pYA3493)、rSC0018((pS-SaoA)、rSC0018(pYA3493)及口服等量PBS的空白對照組的所有仔豬進行豬鏈球菌2及7型的攻毒實驗。首免后5周各免疫組取5只仔豬，分別用5.0×10⁸劑量的SS2及1.0×10¹⁰SS7毒株進行耳靜脈注射攻毒，觀察14天并記錄仔豬臨床癥狀及存活情況。

1 ）SS2攻毒后仔豬存活率和病理特征：

免疫rSC0016(pS-SaoA)株的仔豬經耳靜脈攻毒5.0×10⁸劑量的SS2后，個別仔豬在攻毒后48h內有輕微精神沉郁現象，72h后明顯好轉，隨后無明顯的病理癥狀，免疫豬存活率為100%；免疫rSC0018(pS-SaoA)株、rSC0016(pYA3493)株和rSC0018(pYA3493)株和PBS組的仔豬在108h內全部死亡（如圖35所示）。

免疫rSC0016(pS-SaoA)株的豬沒有任何病理癥狀，豬行動自如，而免疫rSC0018(pS-SaoA)株的大多數仔豬在攻毒后24h內表現出嗜睡、不食，攻毒后72h開始有便秘，轉圈、前肢爬行、四肢游泳狀、呼吸困難，關節腫脹，有跛行；口服PBS空白對照組和rSC0016(pYA3493)、rSC0016(pYA3493)組的仔豬經SS2攻毒后，出現的臨床癥狀更加嚴重；對空白對照組、rSC0018(pS-SaoA)、rSC0018(pYA3493)、 rSC0016(pYA3493)株的死亡豬剖解發現，病死豬的肺部有嚴重的纖維素性樣變、肺臟出血，腦膜出血等，與免疫rSC0016(pS-SaoA)株的豬攻毒后未見腦的病變和輕微肺炎形成顯著反差。取病死豬肺，肝組織分離SS2，均能分離到攻毒所用的SS2；攻毒后14天，撲殺所有免疫rSC0016(pS-SaoA)株的存活豬，剖檢取肝、脾、肺、腦組織，沒有分離到攻毒株SS2。

采集死亡豬和存活豬的肺臟和腦組織制作病理切片，顯微鏡下觀察可見對照組仔豬與免疫rSC0018(pS-SaoA)株、rSC0018(pYA3493)、rSC0016(pYA3493)株的豬腦膜血管充血，水腫，炎性細胞浸潤。肺淤血，肺泡壁增厚，肺泡內大量炎性滲出，血管周圍大量炎性細胞浸潤見圖36-圖45所示。圖36和37可見對照組仔豬經野生型豬鏈球菌2型攻毒后腦組織嚴重出血，肺組織淤血、出血和炎性滲出；圖38和39是免疫化學致弱株rSC0018攜帶的空載體仔豬經野生型豬鏈球菌2型攻毒后腦組織也嚴重出血，肺組織淤血、出血和炎性滲出；圖40和41是免疫化學致弱株rSC0018攜帶表達豬鏈球菌的SaoA蛋白載體仔豬經野生型豬鏈球菌2型攻毒后腦組織出血，肺組織淤血、出血和炎性滲出；圖42和43是減毒株rSC0016攜帶的空載體仔豬經野生型豬鏈球菌2型攻毒后腦組織出血，肺組織淤血、出血和肺泡中炎性滲出；而免疫rSC0016(pS-SaoA)組大部分仔豬的腦組織和肺中未出現明顯病理變化如圖44-圖45所示。

2）SS7攻毒后仔豬存活率和病理特征：

各減毒株免疫后第5周，取5只免疫豬，以1.0×10¹⁰劑量的SS7經耳靜脈攻毒。結果顯示，口服免疫rSC0016(pS-SaoA)組在7天的觀察期內無明顯臨床癥狀，而體溫保持正常水平。而免疫rSC0018(pS-SaoA)、rSC0018(pYA3493)、 rSC0016(pYA3493) 株的豬均出現了體溫升高（如圖46所示），并且出現了厭食，精神沉郁，氣喘等癥狀，持續5天后這些癥狀消失，體溫恢復至正常水平。

綜上所述，本發明在阿拉伯糖調控毒力基因延遲減毒和延遲表達外源抗原的載體上構建的含有ΔsopB突變基因的豬霍亂沙門氏菌載體，能夠降低豬霍亂沙門氏菌減毒株的毒力，減輕減毒株引起的炎性反應對宿主的損傷作用，顯著提高豬霍亂沙門氏菌所攜帶的外源抗原誘導宿主的免疫原性，從而使含有sopB突變基因的攜帶豬鏈球菌SaoA蛋白的豬霍亂沙門氏菌疫苗候選株rSC0016（pS-SaoA）能夠對SS2及SS7野毒株的感染提供完全的保護和交叉保護作用。

<110> 揚州大學

<120>一種豬霍亂沙門氏菌減毒載體菌及其構建方法

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<212> DNA

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