本發明涉及生物檢測技術領域，特別涉及一種檢測16種呼吸道病原體的基因芯片檢測用試劑盒及方法。
背景技術：
呼吸道感染是世界范圍內最常見的疾病之一，發病率在各國居民發病率總體結構中占據主要地位，每年的流行高峰期約有10％的居民患有呼吸道感染。呼吸道感染會導致鼻炎，流涕，鼻塞，咳嗽，輕度咽炎，全身發熱等癥狀，嚴重的會導致呼吸困難甚至死亡。據世界衛生組織2002年統計報告，呼吸道感染居全球十大死亡原因中第三位，全球每年近四百萬人死于呼吸道感染。
基因芯片技術是近年來興起的生物高新技術，集成了探針固相原位合成技術、照相平板印刷技術、精密控制技術、激光共聚焦顯微技術和高分子合成技術。該技術的原型是80年代中期提出的，1991年Stephen Fodor博士首次將該技術定義為基因芯片，到1995年它在《Science》雜志刊登的一篇關于研究分析基因表達圖譜的文章中再次被提及，目前該技術在研究癌癥和檢測微生物方面得到廣泛的應用。我們通常所提到的基因芯片(又稱DNA芯片、寡核苷酸芯片等)是指根據經過特殊處理技術，將核酸分子(寡聚核苷酸、DNA、RNA等)固定于硅片、玻璃、尼龍膜等固相載體上，利用生物分子間特異相互作用的原理，將生化反應及分析過程集成于芯片表面，從而實現對DNA、RNA的高通量快速檢測。其突出特點在于高度并行性、多樣性、微型化和高度自動化。
目前國內已有許多檢測呼吸道病原體的試劑。主要是針對于病毒類的PCR熒光檢測試劑或者血清免疫檢測試劑，而對于細菌類病原體還是采取了比較傳統的細菌培養板培養的方法。熒光PCR雖然能夠得到較好的靈敏度和特異性，但是由于儀器采集信號通道的限制，每次反應都只能檢測幾種病原體，通量較低，而采取多管檢測的時候又會極大增加檢測的經濟成本和時間成本；而血清免疫檢測試劑雖然可以獲得較大的檢測通量，但是由于血清免疫檢測的是血清中的所產生的抗體，因此存在著一個較長的空窗期，并且靈敏度相對也較低；而對于細菌類病原體的檢測則是更加困難，細菌培養法雖然準確率高，但是周期長，培養效果差，很多細菌無法培養，延誤了最佳的治療時機。
技術實現要素：
本發明的發明目的在于提供一種檢測16種呼吸道病原體的基因芯片檢測用試劑盒及方法，以實現同時檢測16種呼吸道病原體的檢測需要。
根據本發明的實施例，第一方面示出一種檢測16種呼吸道病原體的基因檢測試劑盒，所述試劑盒包括：PCR緩沖溶液、逆轉錄酶、dNTPs、引物、探針以及Taq酶和金屬陽離子；
所述探針包括雜交探針和內標探針；
所述引物包括16種呼吸道病原體引物和2種內標引物和1種通用引物；
所述引物的序列為：SEQ ID NO:1-37；所述探針的序列為SEQ ID NO:38-55。
進一步，每條所述雜交探針的5’末端都經過氨基與多聚polyT修飾。
進一步，每條所述雜交探針的5’端oligodT的C6位置進行氨基化修飾。
本發明第二方面示出一種檢測16種呼吸道病原體的基因檢測方法，包括：
篩選出16種呼吸道病原體的保守區域，分別得到16對引物，在所述16種呼吸道病原體的保守區域設計出16條雜交探針；
選取方形尼龍膜，使用10％EDC活化1h，將所述16條雜交探針、1種DNA內標探針、1種RNA內標探針點在尼龍膜上，探針排列為3×6矩陣，點與點之間的間距為100μm，得到雜交盒；
配置檢測試劑盒，設置PCR反應擴增的程序，進行擴增反應，得到擴增產物；
向所述擴增產物中加入0.2mol的NaOH50uL，得到變性后的擴增產物；
在雜交盒每孔內加入500uL預雜交液，15min后取出在雜交盒中預雜交液，在雜交盒每孔內加入雜交液400uL，同時相應的加入所述變性后的擴增產物100uL，將雜交盒放入55℃烘箱中，30min后取出移出孔內的雜交液；在雜交盒每孔內加入500ul雜交洗液1清洗3min，移出雜交洗液1；在雜交盒每孔內加入300ul酶標溶液，置于37℃烘箱中，30min后移出酶標溶液；在雜交盒每孔內加入500uL雜交洗液1，震蕩清洗3min，用500uL雜交洗液2，震蕩清洗3min；在雜交盒每孔內加入400ul顯色液，室溫顯色1-2min，移出顯色液，用雜交洗液2清洗每孔，用Bio-rad顯影，得到雜交顯色結果；
將所述雜交顯色結果與標準卡進行對比，得出檢測結果；
所述雜交洗液1為2x SSC與0.1％十二烷基硫酸鈉溶液的混合溶液；所述雜交洗液2為0.5x SSC與0.1％十二烷基硫酸鈉溶液的混合液溶液。
進一步，所述PCR反應擴增的程序為：
逆轉錄，逆轉錄的溫度為50℃。時間為30min；
cDNA預變性，預變性的溫度為90℃-105℃，時間為1-10min，
變性，變性的溫度為90℃-105℃，時間為10s-30s；
退火，退火的溫度為40℃-65℃，時間為10s-60s；
延伸，延伸溫度為40℃-80℃，時間為10s-5min。
進一步，所述PCR反應擴增的程序為：
所述逆轉錄的溫度為50℃。時間為30min；
所述預變性的溫度為95℃，時間為2min，
所述變性的溫度為95℃，時間為15s；
所述退火的溫度為57℃，時間為20s；
延伸溫度為72℃，時間為45s。
進一步，在每條所述引物的5’端添加人工接頭序列。
進一步，所述酶標溶液為鏈霉親和素和酶標母液的混合液；按照鏈霉親和素酶標母液＝1:200的配制。
進一步，所述顯色液為2mg/ml TMB：顯色緩沖液：30％H2O2＝500:500:1。
進一步，所述預雜交液、所述雜交液、所述雜交洗液1，所述雜交洗液2和所述酶標溶液使用前在55℃烘箱中預熱30min。
由以上技術方案可知，本發明實施例示出一種檢測16種呼吸道病原體的基因芯片檢測用試劑盒及方法，所述試劑盒包括：包括：PCR緩沖溶液、逆轉錄酶、dNTPs、引物、探針以及Taq酶和金屬陽離子；所述探針包括雜交探針和內標探針；所述引物包括16種呼吸道病原體引物和2種內標引物和1種通用引物；所述引物的序列為：SEQ IDNO:1-37；所述探針的序列為SEQ ID NO:38-55。本發明基于PCR技術，針對16種呼吸道病原體的保守區域設計引物(SEQ ID NO:1-37)對靶核酸序列進行擴增，并通過基因芯片雜交技術對擴增產物進行雜交和顯色，最后將基因芯片上雜交斑點顯色情況與標準卡進行對比，從而對檢測結果進行分析判斷，同時為了避免由于樣本提取或者試劑失效導致的假陰性結果，本發明設置了人源管家基因(在取樣過程中會取到人源上皮細胞)作為內標質控，對靶核酸的提取和擴增進行監控，從而保證檢測結果的精確性。
附圖說明
為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發明的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。
圖1為根據一優選實施例示出的一種檢測16種呼吸道病原體的基因檢測方法。
具體實施方式
下面將結合本發明實施例中的附圖，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整的描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。
一種檢測16種呼吸道病原體的基因檢測試劑盒，包括：PCR緩沖溶液、DNA聚合酶、dNTPs、引物、探針以及催化DNA聚合酶所需要的金屬陽離子；所述探針包括雜交探針和內標探針；
所述引物包括16種呼吸道病原體引物和2種內標引物和1種通用引物；
所述引物的序列為：SEQ ID NO:1-37；
所述探針的序列為SEQ ID NO:38-55。
進一步，每條所述雜交探針的5’末端都經過氨基與多聚polyT修飾。
進一步，每條所述雜交探針的5’端oligodT的C6位置進行氨基化修飾。
本發明的基因芯片上具有與所檢測的16中呼吸道病原體DNA/RNA互補的核苷酸序列的探針(SEQ ID NO:38-55)。為了增強雜交探針與基質的結合度，有利于后續與擴增產物的雜交反應的進行，每條雜交探針都經過5’末端氨基與多聚polyT修飾。本發明針對16中病原體和2種內標18種雜交探針，每條雜交探針都有著合適的堿基成分，Tm值相對比較均一，即18種型別的雜交探針和對應的PCR產物雜交時的最適雜交條件基本一致，不會因為不同雜交探針所匹配的最適雜交溫度不同從而影響雜交結果，保證了檢測的準確性。而在擴增方面，我們在每一對擴增引物的5’末端都加入了一段人工合成的接頭序列，該序列與現有基因庫中基因組無特異性結合，并在接頭序列的5’末端進行生物素標記。先通過帶接頭序列的特異性引物將靶標基因進行擴增富集，再通過接頭序列對富集的模板進行擴增。從而導致了在反應的最后擴增階段反應體系中只有一對擴增引物，避免了不同引物對之間由于擴增效率不同而導致出現假陰性的情況，實現了所有靶標的同步擴增。
本發明實施例第二方面示出一種檢測16種呼吸道病原體的基因檢測方法，如圖1所示所述方法包括：
S101篩選出16種呼吸道病原體的保守區域，分別得到16對引物，在所述16種呼吸道病原體的保守區域設計出16條雜交探針；
S102選取方形尼龍膜，使用10％EDC活化1h，將所述16條雜交探針、1種DNA內標探針、1中RNA內標探針點在尼龍膜上，探針排列為3×6矩陣，點與點之間的間距為100μm，得到雜交盒；
S103配置檢測試劑盒，設置PCR反應擴增的程序，進行擴增反應，得到擴增產物；
S104向所述擴增產物中加入0.2mol的NaOH50uL，得到變性后的擴增產物；
S105在雜交盒每孔內加入500uL預雜交液，15min后取出在雜交盒中預雜交液，在雜交盒每孔內加入雜交液400uL，同時相應的加入所述變性后的擴增產物100uL，將雜交盒放入55℃烘箱中，30min后取出移出孔內的雜交液；在雜交盒每孔內加入500ul雜交洗液1清洗3min，移出雜交洗液1；在雜交盒每孔內加入300ul酶標溶液，置于37℃烘箱中，30min后移出酶標溶液；在雜交盒每孔內加入500uL雜交洗液1，震蕩清洗3min，用500uL雜交洗液2，震蕩清洗3min；在雜交盒每孔內加入400ul顯色液，室溫顯色1-2min，移出顯色液，用雜交洗液2清洗每孔，用Bio-rad顯影，得到雜交顯色結果；
S106將所述雜交顯色結果與標準卡進行對比，得出檢測結果；
所述雜交洗液1為2x SSC與0.1％十二烷基硫酸鈉溶液的混合溶液；所述雜交洗液2為0.5x SSC與0.1％十二烷基硫酸鈉溶液的混合液溶液。
進一步，在每條所述引物的5’端添加人工接頭序列。
進一步，所述酶標溶液為鏈霉親和素和酶標母液的混合液；按照鏈霉親和素酶標母液＝1:200的配制。
進一步，所述顯色液為2mg/ml TMB：顯色緩沖液：30％H2O2＝500:500:1。
進一步，所述預雜交液、所述雜交液、所述雜交洗液1，所述雜交洗液2和所述酶標溶液使用前在55℃烘箱中預熱30min。
具體的，本發明的優選方案配置檢測試劑盒為：
本發明的檢測方法采取RT-PCR與基因芯片相結合的方式，因此首先需要完成PCR反應擴增的過程。一般的RT-PCR反應過程為：
1)逆轉錄；2)cDNA預變性，時間和長度取決于靶核苷酸長度及堿基組成，預變性的溫度一般為90℃-105℃，時間一般為1-10min，預變性的目的為使雙鏈核苷酸序列徹底分離為單鏈；3)變性，溫度一般為90℃-105℃，時間一般為10s-30s；4)退火，使各引物退火至呼吸道病原體或內標質控核酸的靶序列上。退火的溫度通常為40℃-65℃，退火的時間可以是10s-60s；5)延伸，引物與模板結合，開始合成新的雙鏈DNA，延伸溫度一般為40℃-80℃，延伸時間可以是10s-5min。本發明由于涉及到人工接頭引物的引入和擴增，根據需要對擴增步驟進行了略微的修改。本發明的優選方案為：
本發明的關鍵內容為靶核苷酸以及內標的特異性擴增引物和接頭引物，以及后來的雜交探針。
本發明中的核苷酸序列為：
本發明中的保護點為本發明中提供的核苷酸序列或部分序列(引物、探針及內標)及與其相似的序列或反向互補的序列，以及PCR反應體系組分及濃度參數、PCR擴增程序、芯片雜交反應體系組成成分、濃度參數以及雜交反應條件。
結果分析：
證明該發明方法的可行性，進行了方法學研究：
⑴最低檢測限(LOD)試驗；
通過對各濃度梯度的樣本進行檢測，表明本檢測方法的檢測靈敏度(LOD)為1000copies/mL。
(2)特異性實驗與其它疾病的交叉反應情況；
通過用本發明中的檢測方法對16種呼吸道病原體以外的其它病原體進行檢測，結果表明本發明中的方法對EB病毒、HPV病毒、STD等病原體感染樣本無交叉反應，表明其具有高特意性。
(3)對潛在內源物質的抗干擾性；
試驗表明，當檢驗人中含有以下濃度的藥物，不會影響到試劑盒對樣本檢測結果的判定：0.2mg/L倍氯米松、0.15mg/L地塞米松、12mg/L曲安西龍、0.4mg/L布地奈德、0.05mg/L莫美達松、0.5mg/L氟替卡松、75mg/L苯佐卡因、5mg/L扎那米韋、37.5mg/L奧司他韋、75mg/L妥布霉素、50mg/L金剛烷胺、75mg/L硫磺、150mg/L金英、50mg/L鹽酸金剛乙胺、0.125mg/L腎上腺素、25mg/L薄荷腦、0.05％羥甲唑啉、500mg/L氟尼縮松、500mg/L莫匹羅星。
(4)對潛在外源物質的抗干擾性
試驗表明，常見干擾物質，如血液、唾液、鼻分泌物在分別在10％時，不會對試劑盒檢測結果產生影響。但考慮上述干擾物質中的RNA酶的影響，仍提醒采樣時應盡量避免上述物質的干擾。
由以上技術方案可知，本發明實施例示出一種檢測16種呼吸道病原體的基因芯片檢測用試劑盒及方法，所述試劑盒包括：包括：PCR緩沖溶液、逆轉錄酶、dNTPs、引物、探針以及Taq酶和金屬陽離子；所述探針包括雜交探針和內標探針；所述引物包括16種呼吸道病原體引物和2種內標引物和1種通用引物；所述引物的序列為：SEQ IDNO:1-37；所述探針的序列為SEQ ID NO:38-55。本發明基于PCR技術，針對16種呼吸道病原體的保守區域設計引物(SEQ ID NO:1-37)對靶核酸序列進行擴增，并通過基因芯片雜交技術對擴增產物進行雜交和顯色，最后將基因芯片上雜交斑點顯色情況與標準卡進行對比，從而對檢測結果進行分析判斷。同時為了避免由于樣本提取或者試劑失效導致的假陰性結果，本發明設置了人源管家基因(在取樣過程中會取到人源上皮細胞)作為內標質控，對靶核酸的提取和擴增進行監控，從而保證檢測結果的精確性。
本領域技術人員在考慮說明書及實踐這里公開的發明后，將容易想到本發明的其它實施方案。本申請旨在涵蓋本發明的任何變型、用途或者適應性變化，這些變型、用途或者適應性變化遵循本發明的一般性原理并包括本發明未公開的本技術領域中的公知常識或慣用技術手段。說明書和實施例僅被視為示例性的，本發明的真正范圍和精神由下面的權利要求指出。
應當理解的是，本發明并不局限于上面已經描述并在附圖中示出的精確結構，并且可以在不脫離其范圍進行各種修改和改變。本發明的范圍僅由所附的權利要求來限制。
SEQUENCE LISTING
<110> 湖南圣湘生物科技有限公司
<120> 一種檢測16種呼吸道病原體的基因芯片及檢測用試劑盒
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<170> PatentIn version 3.5
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<210> 42
<211> 40
<212> DNA
<213> Human Chlamydiales pneumoniae
<400> 42
tttttttttt gttcaggttg ctttcaagtt catcgtacag 40
<210> 43
<211> 35
<212> DNA
<213> Human Legionella pneumophila
<400> 43
tttttttttt ccatatgcaa gacctgaggg aacat 35
<210> 44
<211> 36
<212> DNA
<213> Human Mycoplasmal Pneumonia
<400> 44
tttttttttt ctgataaccc cttgttcctg cagcta 36
<210> 45
<211> 38
<212> DNA
<213> Human Rhinovirus
<400> 45
tttttttttt cagctagatc agtcgtagca taatcttc 38
<210> 46
<211> 35
<212> DNA
<213> Human Parainfluenza Virus 1
<400> 46
tttttttttt cacagccatc aacagtcgtt ggcat 35
<210> 47
<211> 29
<212> DNA
<213> Human Parainfluenza Virus 2
<400> 47
tttttttttt tgacgccgcg gtgcggctg 29
<210> 48
<211> 35
<212> DNA
<213> Human Parainfluenza Virus 3
<400> 48
tttttttttt cgtcagaatg ggtgctattg atggc 35
<210> 49
<211> 35
<212> DNA
<213> Pertussis
<400> 49
tttttttttt ccaaagactt gttgaccttg cctgt 35
<210> 50
<211> 37
<212> DNA
<213> Chlamydia trachomatis
<400> 50
tttttttttt ctcccagctt aagaaccgtc agacaga 37
<210> 51
<211> 40
<212> DNA
<213> HaemoPhilus influenza
<400> 51
tttttttttt cttcgttgaa atagtaccac ttatcagcga 40
<210> 52
<211> 35
<212> DNA
<213> Moraxella Catarrhalis
<400> 52
tttttttttt aacacggaaa tcacgacctg cccca 35
<210> 53
<211> 35
<212> DNA
<213> Streptococcus Pneumoniae
<400> 53
tttttttttt cctaacgcga tgttgtattc tggtg 35
<210> 54
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 54
tttttttttt tcaatgtcgg attgatgaaa cccag 35
<210> 55
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 55
tttttttttt ggcatactca tctttttcag tgggg 35