本發明涉及植物病毒學領域，具體而言，涉及一種櫻桃病毒A(Cherry virus A,CVA)熒光定量PCR檢測的專用引物和方法。

背景技術：

櫻桃是一種具有較高經濟價值的水果，近年來隨著種植面積的不斷擴大，病毒病已成為限制其產量和質量提高的重要因素。櫻桃病毒A(Cherry virus A,CVA)是一種能侵染櫻桃、李子、杏等李屬果樹的潛隱性病毒，為乙型線形病毒科(Betaflexiviridae)發形病毒屬(Capillovirus)成員。CVA最早于1995年在德國南部的櫻桃樣品中被發現，在我國則最早于2007年在江蘇省的杏樹樣品和云南省的櫻桃樣品中被相繼發現。CVA侵染寄主植物能導致寄主果實產量和品質的降低，但是作為一種潛隱性病毒，其侵染寄主植物后沒有明顯的癥狀表現，給該病毒的早期診斷帶來較大的困難。與此同時，CVA常與櫻桃小果病毒(Little cherry virus,LChV)伴隨發生，關于其病毒與病毒、病毒與植物互作機制的基礎研究也逐漸受到重視。因此，有必要建立一種高效、靈敏的對CVA進行定量檢測的方法。

技術實現要素：

本發明提出一種對櫻桃病毒A(Cherry virus A,CVA)進行熒光定量PCR檢測的方法及其專用引物，該檢測方法可實現對供試果樹樣本材料中CVA基因組拷貝數的絕對定量。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：

一種櫻桃病毒A熒光定量PCR檢測的專用引物，包括上游引物和下游引物，上游引物CVA-4F：5’-TCACATTATCAGAGAACCAGAG-3’；

下游引物CVA-4B：5’-GCAAAAGTTAATAATGACATGCC-3’。

本發明還提出了一種櫻桃病毒A熒光定量PCR檢測的方法，包括以下步驟：

第一步，提取CVA毒源材料的總RNA，用隨機引物反轉錄得到cDNA，以CVA-4F和CVA-4B為引物進行PCR擴增，大小為205bp的擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳后割膠回收，連接克隆載體，轉化大腸桿菌感受態細胞，篩選并挑取含陽性克隆的大腸桿菌進行培養，提取質粒得到陽性質粒標準品；

第二步，陽性質粒標準品分別梯度稀釋至不同濃度，以CVA-4F和CVA-4B為引物進行熒光定量PCR擴增，以Ct值為縱坐標，以質粒拷貝數為橫坐標，繪制得到標準曲線；

第三步，提取待測樣品的總RNA，以CVA-4B為引物反轉錄得到cDNA，以該cDNA為模板，按照與步驟(2)中完全相同的條件進行熒光定量PCR擴增，所得Ct值代入標準曲線公式得到待測樣品中CVA基因組RNA的含量。

優選的，在第一步中，陽性質粒標準品的制備，其PCR反應體系為：2×Ex Taq Mix 12.5μL，10μM CVA-4F和CVA-4B引物各1.0μL，模板2.0μL，雙蒸水補足至25μL。

優選的，在第一步中，陽性質粒標準品的制備，其PCR反應程序為：95℃ 3min；95℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 20s，共35個循環；72℃ 10min。

優選的，在第二步中，繪制標準曲線時根據公式：拷貝數(copy/μL)＝(濃度(ng/μL)×10^-9×6.02×10²³)/(質粒堿基數×660)，將質粒標準品依次稀釋至10⁸，10⁷，10⁶，10⁵，10⁴copy/μL共5個濃度。

優選的，在第二步中，繪制標準曲線和檢測待測樣品時的熒光定量PCR反應體系為：2×SYBR Green qPCR Mix 10.0μL，10μM CVA-4F和CVA-4B各1.4μL，模板1.0μL，雙蒸水補足至20μL。

優選的，在第二步中，繪制標準曲線和檢測待測樣品時的熒光定量PCR反應程序為：95℃ 2min；95℃ 5s，58℃ 10s，共39個循環；由65℃至95℃，以每10s升溫0.5℃讀取熒光值得到溶解曲線。

本發明構建了對CVA進行定量檢測的實時熒光PCR體系，該方法特異性強、靈敏度高，可對大量樣品進行高通量的標準化操作。該方法應用于生產實際，可實現對果樹苗木中CVA帶毒情況的快速檢測，對果樹病毒病的防控，進而提高產品產量和品質具有重要作用。同時，該方法也可用于科研工作，對探索CVA與其它果樹病毒的互作機制、致病機理等學術問題具有重要的應用價值。

附圖說明

為了更清楚地說明本發明的技術方案，下面對實施例中所需要使用的附圖作如下說明：

圖1為本發明實施例中以10⁸，10⁷，10⁶，10⁵，10⁴copy/μL不同濃度質粒標準品為模板擴增獲得的標準曲線。

圖2為本發明實施例中以10⁸，10⁷，10⁶，10⁵，10⁴copy/μL不同濃度質粒標準品為模板擴增的擴增曲線。

圖3為本發明實施例中以10⁸，10⁷，10⁶，10⁵，10⁴copy/μL不同濃度質粒標準品為模板擴增的溶解曲線。

具體實施方式

下面將結合本發明實施例中的附圖，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。此處所描述的具體實施例僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。

實施例

1.引物合成

由生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物CVA-4F(5’-TCACATTATCAGAGAACCAGAG-3’)和CVA-4B(5’-GCAAAAGTTAATAATGACATGCC-3’)，用雙蒸水溶解至10μM備用。

2.質粒標準品構建

2.1.感染CVA的櫻桃枝條樣品采自遼寧省興城市。使用RNAprep Pure植物總RNA提取試劑盒(TIANGEN,DP140916)提取樣品總RNA，具體步驟參照試劑盒說明書。

2.2.使用隨機引物反轉錄，反轉錄酶購自Promega，具體步驟如下：

70℃水浴5min，冰置5min，加入下列成分：

37℃反應1h，95℃滅活5min，得到的cDNA；

2.3.以cDNA為模板，以CVA-4F和CVA-4B為引物進行PCR擴增，所使用的Ex Taq Mix購自康為世紀，反應體系如下：

PCR反應程序為：95℃預變性3min；95℃變性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，35個循環；72℃補充延伸10min。

2.4.PCR產物在1.5％瓊脂糖凝膠中145V恒壓電泳15min，凝膠在EB染液中染色5min后用紫外凝膠成像系統成像拍照；用潔凈刀片割下大小約為200bp的產物，使用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(TIANGEN,DP209)純化回收目標產物，具體方法參照說明書；回收片段連接pGEM-T easy(Promega)克隆載體，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞(康為世紀)，在含50μg/mL氨芐青霉素的LB平板上篩選得到陽性克隆，具體方法參照相關說明書；經PCR驗證陽性的單克隆菌落擴大培養后，使用質粒小提試劑盒(TIANGEN,DP103)提取質粒得到陽性質粒標準品；測定質粒濃度為262ng/μL。

2.5.為確保本方法的準確性，重組陽性質粒委托北京奧科鼎盛生物科技有限公司，使用通用引物M13F/M13R對插入片段進行DNA測序，測序結果如SEQ ID NO:1。將該序列與GenBank數據庫中的已有序列進行在線BLAST分析(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，結果表明插入片段確為CVA基因組片段，其與GenBank中已提交的CVA序列一致性為91.7％(KT310083)～95.1％(KU215411)：

TCACATTATCAGAGAACCAGAGAGCCGTGAAGAACACCATCAGGAATTACTACCTGAGGATAATGTTTGGGAATCTTGCGGTGATGGGAACAAGCGAGCAGACAGACTACCCAGGAGAGCATCTAGCGATTCCGAGACCAGTAATAGAGAATCAGGAGGCTCTGACTGCACATCTCCCAGCAGGCATGTCATTATTAACTTTTGC

3.標準曲線繪制

3.1.參照公式：拷貝數(copy/μL)＝(濃度(ng/μL)×10^-9×6.02×10²³)/(質粒堿基數×660)，將262ng/μL的質粒標準品稀釋至10⁸copy/μL，其中質粒堿基數為3220，即1μL質粒標準品加741.2μL雙蒸水，再將10⁸copy/μL的質粒標準品依次稀釋至10⁷，10⁶，10⁵，10⁴copy/μL。

3.2.分別以各濃度的質粒標準品為模板，使用Quant One Step RT-qPCR Kit(SYBR Green)試劑盒(TIANGEN,FP303)進行熒光定量PCR，反應體系如下：

使用Bio-Rad iQ^TM5實時熒光定量PCR儀按如下反應程序進行：95℃ 2min；95℃ 5s,58℃ 10s,Read,39cycle；65℃ to 95℃,0.5℃/10s read。程序運行結束后由軟件自動生成標準曲線：Y＝-3.511×log(X)+42.507，R²＝0.995

4.待測植物材料的定量檢測

待測櫻桃枝條樣品采自遼寧省葫蘆島市興城市，按照上述方法提取樣品總RNA，隨機引物反轉錄得到cDNA，以cDNA為模板，CVA-4F和CVA-4B為引物，完全按照上述體系和程序進行熒光定量PCR擴增，同時分別設置健康櫻桃樣品、無菌雙蒸水作為陰性對照，確保檢測結果的準確性。5份待測樣品Ct值為20.74～24.30，代入上述標準曲線公式，得到待測樣品CVA拷貝數為1.54×10⁵～1.59×10⁶copy/μL。陰性對照樣品均未出現擴增曲線和溶解峰。

最后應說明的是：以上所述僅為本發明的優選實施例而已，并不用于限制本發明，盡管參照前述實施例對本發明進行了詳細的說明，對于本領域的技術人員來說，其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換,凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。

序列表

<110> 東北農業大學

<120> 一種櫻桃病毒A熒光定量PCR檢測的專用引物和方法

<160> 2

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 櫻桃病毒A熒光定量PCR檢測上游引物

<400> 1

TCACATTATC AGAGAACCAG AG 22

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 櫻桃病毒A熒光定量PCR檢測下游引物

<400> 2

GCAAAAGTTA ATAATGACAT GCC 23