本發明涉及一種青稞的紫外脅迫相關基因及其應用。
背景技術：
：青稞英文名：hullessbarley，是禾本科大麥屬的一種禾谷類作物，因其內外穎殼分離，籽粒裸露，故又稱裸大麥、元麥、米大麥。主要產自中國西藏、青海、四川、云南等地，是藏族人民的主要糧食。青稞在青藏高原上種植約有3500年的歷史，從物質文化之中延伸到精神文化領域，在青藏高原上形成了內涵豐富、極富民族特色的青稞文化。有著廣泛的藥用以及營養價值，已推出了青稞掛面、青稞饅頭、青稞營養粉等青稞產品。臭氧層變薄導致的到達地面的紫外輻射增強對植物的影響已經引起了全社會的廣泛關注,是當今學術領域研究的主要課題。紫外脅迫會嚴重影響青稞的生長發育，對最終的產量造成較大的影響。然而，目前在檢測青稞是否受到紫外輻射方面，卻未見有效的手段。技術實現要素：本發明提供了一種與青稞的紫外脅迫相關的基因及其克隆方法，該基因可用于檢測青稞是否受到紫外脅迫。本發明提供了青稞的紫外脅迫相關基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本發明提供了一種青稞的紫外脅迫相關蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。本發明提供了一種克隆前述青稞的紫外脅迫相關基因的方法，步驟如下：1)取青稞，提取RNA；2)以SEQIDNO.3～SEQIDNO.4所示引物對為引物進行反轉錄，純化，即可。步驟2)中，反轉錄的體系和條件如下：反轉錄反應體系：反轉錄反應條件：步驟2)中，純化的方法是：純化的方法是瓊脂糖凝膠電泳中回收目標DNA片段的方法。本發明提供了一種檢測青稞受紫外輻射脅迫的試劑盒，包括任選的用于檢測前述基因表達水平或者前述蛋白含量的試劑。其中，所述試劑是PCR方法用試劑。其中，所述試劑包含SEQIDNO.5～SEQIDNO.6所示引物對。其中，所述試劑還包括如下試劑：5×RTReactionMix、Oligo(dT)、TUREscriptH-RTase/RIMix以及RNaseFreedH2O，它們的體積比為4:1.4:1:8.6。本發明發現了青稞紫外輻射脅迫相關的基因(核苷酸序列如SEQIDNO.1所示)，本發明基因的表達水平與青稞是否受青紫外輻射脅迫相關，受到紫外輻射脅迫后，青稞的本發明基因的表達水平會顯著提升，通過檢測本發明基因的表達水平或者蛋白的含量可以判斷青稞是否受過紫外輻射脅迫，為青稞生長后續生長條件的控制提供理論支持，具有良好的市場應用前景。顯然，根據本發明的上述內容，按照本領域的普通技術知識和慣用手段，在不脫離本發明上述基本技術思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。以下通過實施例形式的具體實施方式，對本發明的上述內容再作進一步的詳細說明。但不應將此理解為本發明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發明上述內容所實現的技術均屬于本發明的范圍。附圖說明圖128a-本發明基因的酶切驗證圖圖2表達結果圖圖3GAPDH檢測擴增曲線(綠色為對照組,紅色為紫外處理組)圖4GAPDH檢測溶解曲線(綠色為對照組,紅色為紫外處理組)圖5本發明基因檢測擴增曲線(綠色為對照組,紅色為紫外處理組)圖6本發明基因檢測溶解曲線(綠色為對照組,紅色為紫外處理組)圖7對照組與本發明實驗組的2^-△△Ct結果具體實施方式實施例1本發明基因的克隆與表達一：基因克隆(一)RNA抽提及反轉錄1.用青稞320及喜8種子發芽成長成苗。2.采取新鮮葉片用植物提取試劑盒抽提RNA并檢測。3.提取步驟如下：3.1儀器與試劑主要儀器：SCILOGEXD3024R離心機、analytikjena-Easycycler；Scientz-48高通量組織研磨儀；主要試劑：反轉錄試劑盒(TUREscript1stStandcDNASYNTHESISKit)(艾德來,貨號PC1802，)；2×預混液(德國DBIpcrMix)。3.2實驗方法與步驟3.2.1組織樣本中RNA的提取RNA提取試劑盒采用jenainnuPREPRNAMiniKit。3.2.2cDNA的合成(反轉錄)采用Aidlab公司反轉錄試劑盒(TUREscript1stStandcDNASYNTHESISKit)進行反轉錄操作，采用20uL反應體系(各反應500ul體系用于后續PCR)：反轉錄反應條件如下：反應結束后，得到cDNA，-20℃保存。本發明基因引物信息如下：(二)PCR產物電泳及編輯1儀器與試劑主要儀器：電源、電泳儀、成像系統。主要試劑：瓊脂糖、500ml1XTAE、marker、Goldview。2實驗方法與步驟：2.1制備1％瓊脂糖凝膠:稱取0.5g瓊脂糖置于錐形瓶中,加入50ml1×TAE.電磁爐加熱煮沸3次至瓊脂糖全部融化,搖勻,即成1.0％瓊脂糖凝膠液.2.2膠板制備:取電泳槽內的有機玻璃內槽(制膠槽)洗干凈,晾干,放入制膠玻璃板.將內槽置于水平位置,并在固定位置放好梳子.將冷卻到65℃左右的瓊脂糖凝膠液混勻小心地倒入內槽玻璃板上,使膠液緩慢展開,直到整個玻璃板表面形成均勻膠層.室溫下靜置直至凝膠完全凝固(30min),垂直輕拔梳子,取下膠帶,將凝膠及內槽放入電泳槽中.添加1×TAE電泳緩沖液至沒過膠板為止。2.3加樣:用10ul微量移液器分別將樣品加入膠板的樣品小槽內(2ul),每加完一個樣品,應更換一個加樣頭,以防污染,加樣時勿碰壞樣品孔周圍的凝膠面。2.4電泳:加樣后的凝膠板立即通電進行電泳,電壓130V,13min,樣品由負極(黑色)向正極(紅色)方向移動。2.5觀察照相:在紫外燈下觀察,DNA存在則顯示出紅色熒光條帶,采用凝膠成像系統拍照保存。二：回收PCR產物測序亞克隆并誘導表達重組表達菌株的構建1.基因鑒定1.1目的DNA片段的回收用10g/L瓊脂糖凝膠電泳分離PCR擴增產物，凝膠回收試劑盒回收目的片段。(1)切取含目的片段的瓊脂糖后搗碎，按重量/體積比1:3(瓊脂糖重量：NE結合液的體積)加入NE結合液。如200mg瓊脂糖加600mLNE結合液；(2)50～60℃水浴3～5min，膠完全融化即可，其間可上下顛倒2～3次；(3)將溶液轉入中，靜置5min使DNA充分與硅膠膜結合，13000r/min離心10～20秒，倒掉收集管中的廢液；(4)加入500μl的80％乙醇于離心純化柱中，13000r/min離心10～20秒，倒掉收集管中的廢液；(5)重復步驟(4)；(6)13000r/min再次離心1min，盡量除去殘余乙醇；(7)將離心純化柱置于新的離心管中，開蓋放置2～3min，使乙醇揮發完；(8)將無菌TE溶液50℃預熱，向離心純化柱中加入40～50μl，靜置3～5min，使洗脫液充分將硅膠膜浸透；(9)13000r/min離心1min，管底溶液即為所需的DNA。1.2制備感受態細胞BL21(DE3)(1)從37℃培養16～20h的平板中挑取一個單菌落(直徑2-3mm)，轉到一個含有100mLLB培養基的中，于37℃劇烈振蕩培養2h后，每隔30min測OD600至0.5左右；(2)將細菌轉移到一個無菌，用冰預冷的50mL聚丙烯管中，使培養物冷卻至0℃；(3)于4℃以4000r/min離心10min，以回收細胞；(4)倒出培養液，將管倒置1min，以使最后的痕量培養液流盡；(5)每50mL初始培養液用20mL，0.1mol/LCaCl2和10mL，0.1mol/LMgCl2在冰上放置30min，溶液重懸每份沉淀，置冰水混合物中10min；(6)于4℃以4000r/min離心10min，以回收細胞；(7)倒出上清液，將管倒置1min，以使最后的痕量上清液流盡；(8)每50mL初始培養液用2mL用冰預冷的0.1mol/LCaCl2溶液重懸每份細胞沉淀。細胞在4℃保存12～24h，以提高轉化效率。以上操作均在無菌條件下進行。本發明目的基因片段的核苷酸序列(SEQIDNO.1)如下：ATGGTGCACGCTGCGACGGCCGAGTGCTTCAGCAGCGTGTTCGCCTCATTCGACCACGACGCCGACGGCAGGATCTCGGCGGCGAAGCTGCGGCTGTGCATGAAGGCGACGCTAGGCGAGGACGTGTCGGCGGAGGACGCCGAGGCGCTCTTGGCGTCGGCCAACGCCGACGGATACCAGCTGCTGGACGAGCAGGAGTTCCTCCGGCTGGTGGCGCGGCCGGAGACGGAGGAGGAGGAGGAGCGGTGCAGGGGGCTGAGGGAGGCATTCGCGATGTACGAGGTGAAGGGCGAAGGGTGCATCACGCCGTCGAGCCTGATGCGGATGCTCGCCAGGCTGGGGTCCGAACAGGGCATCGAGGAGTGCCGCGCCATGATCCGCATGTTTGATTTGAATGAAGACGGACTGGTTTGCTACGACGAGTTCAAGGTTATGATGGATGCGTAG1.3本發明基因基因PCR產物純化回收及表達質粒pET28a(+)的提取、酶切與回收將含有質粒pet128-質粒與pET28a(+)的菌株培養后，抽提質粒，并用BamHI和XhoI雙酶切，將本發明基因片段PCR純化回收產物(本發明基因片段可以按照前述方法制備，也可以直接合成)用BamHI和XhoI雙酶切，酶切體系見下表，37℃作用2h，凝膠回收試劑盒回收目的DNA。質粒酶切反應體系：1.4酶切回收產物pET28a(+)與本發明基因片段的連接取0.2mL滅菌Eppendorf管一個，按表4-2加入各成分后16℃連接過夜。連接反應體系：pET28a-本發明基因的酶切圖如圖1所示，說明得到了含有本發明基因的重組pET28a質粒。1.5誘導表達1.5.1重組表達質粒pET28a-本發明基因轉化表達宿主菌BL21(DE3)感受態細胞。同時將提取的空載體pET28a(+)轉化表達宿主菌BL21(DE3)作陽性對照；BL21(DE3)感受態細胞不轉化組作陰性對照。1.5.2重組蛋白的誘導表達及表達條件的優化1.5.3重組表達菌株的培養及表達挑取LB固體培養基(含Kan100ug/mL)上生長的已轉化入pET28a-本發明基因的BL21(DE3)菌落接種于5mLLB液體培養基(含Kan100ug/mL)；37℃振蕩培養至OD600約為0.5時，取1mL按1:100比例接種于含Kan的LB液體培養基中；將培養的100mL培養液分為2份，其中一份加IPTG誘導表達，另一份不加IPTG作為對照。加入IPTG至終濃度為1mmol/L，繼續振蕩培養改變IPTG濃度、誘導溫度和培養時間獲得最佳誘導表達條件。取IPTG誘導后菌液1mL，離心，棄上清，沉淀用生理鹽水洗滌后，加入100ul生理鹽水及5×SDS上樣緩沖液25ul，100℃煮沸10min，離心，取上清進行SDS-PAGE。對未誘導菌液做同樣處理，觀察表達情況。同時將LB液體培養未轉化及空載體pET28a(+)轉化的BL21作為對照。1.5.4重組表達質粒SDS-PAGE電泳檢測(1)按說明裝好垂直電泳槽，保證封口膠條對槽口的密封。根據目的蛋白的大小及電泳槽規格確定分離膠及濃縮膠的濃度及體積；(2)配置所需濃度的分離膠，速將其注入凝膠裝置，留出灌注濃縮膠所需空間，用吸管小心在分離膠面上覆蓋一層水，將凝膠垂直放置于室溫下；(3)分離膠聚合完全后，凝膠和水之間出現一條明顯的交界線，傾出覆蓋層液體，用濾紙吸干殘留液體；(4)配制所需濃度的濃縮膠，在已聚合的分離膠上灌注濃縮膠，并將梳子插入濃縮膠中，應避免產生氣泡，將凝膠垂直放置于室溫下，聚合45min左右；(5)濃縮膠聚合完全后，小心取出梳子。將凝膠固定于電泳槽上，上下槽中均灌注Tris-甘氨酸電泳緩沖液；(6)按預定順序加樣，打開電源，恒壓電泳。先以60V低電壓電泳，當染料前沿進入分離膠后，把電壓調至120V，繼續電泳直至溴酚藍到達分離膠底部；(7)電泳完畢后取出凝膠，用去離子水漂洗凈膠上的電泳緩沖液，將凝膠放入固定液中固定15min，以考馬斯亮藍染液染色，于65℃染色15～20min,然后以脫色液平緩搖動脫色3～5h，觀察蛋白條帶。如圖2所示，本發明表達得到了目標蛋白。本發明基因表達得到的目標蛋白的氨基酸序列(SEQIDNO.2)如下：MVHAATAECFSSVFASFDHDADGRISAAKLRLCMKATLGEDVSAEDAEALLASANADGYQLLDEQEFLRLVARPETEEEEERCRGLREAFAMYEVKGEGCITPSSLMRMLARLGSEQGIEECRAMIRMFDLNEDGLVCYDEFKVMMDA實施例2本發明基因與青稞受到紫外輻射脅迫的相關性1.材料已提供的青稞2個幼苗，樣品信息如下：2.儀器與試劑2.1主要儀器analytikjena-qTOWER2.2型熒光定量PCR儀(德國)、SCILOGEXD3024R離心機(美國)、普通PCR儀analytikjena-Easycycler(德國)；超微量核酸蛋白測定儀scandrop100(德國)；移液器(美國bio-rad)，DNA電泳圖譜觀察儀(君儀)，電泳儀(君儀)。2.2主要試劑耗材反轉錄試劑盒(TUREscript1stStandcDNASYNTHESISKit)(艾德來(是品牌)貨號PC1802，)；2×Green預混液(德國DBI)。10ul槍頭(美國GCS)，200ul槍頭(美國GCS)，1ml槍頭(美國GCS),200ul無RNA酶PCR反應管(AXGEN)；1.5Ml無RNA酶EP管(GCS)。3.實驗方法與步驟3.1組織樣本中RNA的提取(1)在已加入trizal試劑的樣品離心管中加入200ul的氯仿，在振蕩器上振蕩30秒混勻，室溫放置3min。(2)4℃，12000×g，離心15分鐘，收集上清約600uL，轉移至新1.5mL的EP管中。(3)加入等體積的異丙醇，充分顛倒混勻，室溫下靜置10min。(4)4℃，12000×g離心10分鐘，棄上清。(5)加入1ml75％的乙醇，充分顛倒混勻，4℃，7500×g離心5分鐘。(6)倒掉酒精，晾干，加入50ulDEPC水溶解RNA，立即檢測濃度。(13)4℃，12000×g離心2分鐘，離心管中溶液即為RNA樣品。3.2RNA提取結果3.2.1紫外分光光度計檢測結果3.3cDNA的合成(反轉錄)采用Aidlab公司反轉錄試劑盒(TUREscript1stStandcDNASYNTHESISKit)進行反轉錄操作，采用40uL反應體系：反轉錄反應條件如下：反應結束后，得到cDNA，-20℃保存。引物信息如下：3.4引物信息3.5Real-timePCR反應條件的優化反應條件體系：Step1-95℃-3MinStep2-95℃-10sStep3-TM℃-30s+platereadStep5-Gotostep2,39cyclesStep6-Meltcurveanalysis(60℃～95℃，+1℃/cycle，holdingtime4s)。qPCR反應液成分：4實驗結果4.1所有基因引物Tm值擴增實驗將所有基因的特異性引物按上述qPCR反應體系配置，在PCR板離心機上4℃6000rpm離心30s。再置于定量PCR儀按上述程序進行擴增。GADPH與本發明基因的擴增曲線如圖3～圖6所示。4.2試驗樣品檢測根據各個基因特異性引物的退火溫度(Tm值)，分別對每個樣品進行上樣檢測，設置2個副孔。各個樣品中目的基因相對表達量的計算由儀器軟件qPCRsoft3.0自動執行，采用Pfafflmethod，公式如下：4.3試驗結果以GADPH做基因內參,計算2^-△△Ct結果如圖7和下表所示：2^-△△Ct對照組(1#)1實驗組(2#)34.7756試驗結果說明，本發明基因的表達水平與青稞受到紫外輻射脅迫呈正相關，通過檢測本發明基因的表達水平，可以測定青稞時候受到紫外輻射脅迫。綜上，本發明發現了青稞紫外輻射脅迫相關的基因(核苷酸序列如SEQIDNO.1所示)的表達水平與青稞是否受青紫外輻射脅迫相關，通過檢測本發明基因的表達水平可以判斷青稞是否受過紫外輻射脅迫，為青稞生長后續生長條件的控制提供理論支持，具有良好的應用前景。SEQUENCELISTING<110>西藏自治區農牧科學院農業研究所成都生命基線科技有限公司<120>一種青稞的紫外脅迫相關基因及其應用<130>GY462-16P1477<160>8<170>PatentInversion3.5<210>1<211>447<212>DNA<213>本發明基因的核苷酸序列<400>1atggtgcacgctgcgacggccgagtgcttcagcagcgtgttcgcctcattcgaccacgac60gccgacggcaggatctcggcggcgaagctgcggctgtgcatgaaggcgacgctaggcgag120gacgtgtcggcggaggacgccgaggcgctcttggcgtcggccaacgccgacggataccag180ctgctggacgagcaggagttcctccggctggtggcgcggccggagacggaggaggaggag240gagcggtgcagggggctgagggaggcattcgcgatgtacgaggtgaagggcgaagggtgc300atcacgccgtcgagcctgatgcggatgctcgccaggctggggtccgaacagggcatcgag360gagtgccgcgccatgatccgcatgtttgatttgaatgaagacggactggtttgctacgac420gagttcaaggttatgatggatgcgtag447<210>2<211>148<212>PRT<213>本發明基因表達的蛋白的氨基酸序列<400>2MetValHisAlaAlaThrAlaGluCysPheSerSerValPheAlaSer151015PheAspHisAspAlaAspGlyArgIleSerAlaAlaLysLeuArgLeu202530CysMetLysAlaThrLeuGlyGluAspValSerAlaGluAspAlaGlu354045AlaLeuLeuAlaSerAlaAsnAlaAspGlyTyrGlnLeuLeuAspGlu505560GlnGluPheLeuArgLeuValAlaArgProGluThrGluGluGluGlu65707580GluArgCysArgGlyLeuArgGluAlaPheAlaMetTyrGluValLys859095GlyGluGlyCysIleThrProSerSerLeuMetArgMetLeuAlaArg100105110LeuGlySerGluGlnGlyIleGluGluCysArgAlaMetIleArgMet115120125PheAspLeuAsnGluAspGlyLeuValCysTyrAspGluPheLysVal130135140MetMetAspAla145<210>3<211>29<212>DNA<213>本發明基因的引物-F<400>3attgcgggatccatggtgcacgctgcgac29<210>4<211>31<212>DNA<213>本發明基因的引物-R<400>4attgccctcgagctacgcatccatcataacc31<210>5<211>17<212>DNA<213>本發明基因的引物-S<400>5ggtccgaacagggcatc17<210>6<211>20<212>DNA<213>本發明基因的引物-A<400>6accttgaactcgtcgtagca20<210>7<211>19<212>DNA<213>GAPDH-S<400>7ccaagccagccacctatga19<210>8<211>20<212>DNA<213>GAPDH-A<400>8tggaaacaaggtcctcatcg20當前第1頁1 2 3