專利名稱：：細(xì)胞增殖相關(guān)基因cnksr3與篩選方法及其應(yīng)用的制作方法細(xì)胞增殖相關(guān)基因C/VA5/W與篩選方法及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物工程與生物醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
。具體涉及基于細(xì)胞增殖相關(guān)siRNA干涉文庫篩選細(xì)胞增殖相關(guān)基因av/:s^的方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：人類基因組計(jì)劃已經(jīng)完成，但是人類染色體大多數(shù)基因的功能仍然不清楚。主要原因是缺乏能夠大規(guī)模、高通量進(jìn)行功能基因掃描的手段和策略。WinzelerEA等人在啤酒酵母(&cc/zaraw少c^cwev/w'ae)基因組序列的測(cè)序成功之后，利用酵母基因敲除技術(shù)構(gòu)建了大約6925株不同的精確敲除單個(gè)開放閱讀框(openreadingframe,ORF)(Brown，Dorfmanetal.)的缺失型菌株，使得系統(tǒng)性地研究啤酒酵母基因組中這些開放閱讀框的功能成為可能。而在模式生物線蟲(Cae"w/wk/z'toe/egara)和果蠅(Dmy—z7"附e/層ga他r)中，RNA干擾現(xiàn)象(Fire,Xuetal.1998;KennerdellandCarthew1998)的發(fā)現(xiàn)使得在這些模式生物中對(duì)未知功能基因進(jìn)行大規(guī)模功能缺失(loss-of-fUnction)研究成為可能。RNA干擾是轉(zhuǎn)錄后序列特異性的基因沉默過程(Tuschl，Zamoreetal.1999)，由雙鏈的RNA分子所介導(dǎo)(ZamoreandHaley2005)。目前研究證實(shí)一種叫做Dicer的核酸酶能夠切割長的雙鏈RNA，產(chǎn)生19-29bp左右的短雙鏈RNA，稱為siRNA。siRNA的一條鏈作為RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)的模板同互補(bǔ)的mRNA結(jié)合，并使其被降解(MeisterandTuschl2004)。RNA干擾能夠有效地抑制特定基因的表達(dá)，且這種干擾機(jī)制在哺乳動(dòng)物中也廣泛存在(Harborth,Elbashiretal.2001)。因此RNA干擾不但成為高等生物功能組基因?qū)W研究中的重要工具；也成為大規(guī)模、高通量地在哺乳動(dòng)物細(xì)胞或者組織中進(jìn)行功能缺失性(loss-of-function)掃描的主要手段(MiyagishiandTaira2003)。目前，利用化學(xué)合成的siRNA構(gòu)建的RNA干涉文庫，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程起到重要調(diào)節(jié)作用的基因家族(Ren,Wagneretal.2004)，以及同細(xì)胞生存相關(guān)基因(Murphy，MacKeiganetal.2004)、同內(nèi)吞作用相關(guān)的激酶基因等(Pelkmans,Favaetal.2005)。除了化學(xué)合成的siRNA，另一個(gè)方法就是構(gòu)建以表達(dá)siRNA質(zhì)粒為基礎(chǔ)的RNA干涉文庫，進(jìn)行大規(guī)模高通量的基因功能研究和篩選。RNA干涉現(xiàn)象被發(fā)現(xiàn)不久，一些實(shí)驗(yàn)室就已經(jīng)開始研究siRNA表達(dá)質(zhì)粒。他們研究發(fā)現(xiàn)RNA聚合酶III啟動(dòng)子序列的質(zhì)粒，能夠通過單一或者雙向的RNA聚合酶III啟動(dòng)子序列，在真核細(xì)胞體內(nèi)長期持久地表達(dá)shRNA(單一啟動(dòng)子)禾PsiRNA(雙向啟動(dòng)子)，并且無論是shRNA還是siRNA都能夠有效地抑制特定基因的表達(dá)(KaykasandMoon2004;Miyagishi，Matsumotoetal.2004)。利用這一技術(shù)，Berns和他的同事們構(gòu)建大約23,742個(gè)獨(dú)立的shRNA表達(dá)質(zhì)粒，這些質(zhì)粒靶向人類7,914個(gè)不同基因。并且通過在人類細(xì)胞中進(jìn)行大規(guī)模的掃描，他們發(fā)現(xiàn)了l個(gè)已知功能和5個(gè)未知功能基因，這些基因可能在依賴于p53引起的細(xì)胞周期阻滯起著重要調(diào)節(jié)作用(Berns,Hijmansetal.2004)。Kaykas和他的同事們也證實(shí)由他們構(gòu)建完成的pHippy的雙向啟動(dòng)子siRNA表達(dá)載體能夠有效地沉默連接了熒光素酶報(bào)告基因的基因(KaykasandMoon2004)。因此，利用siRNA干涉文庫對(duì)新功能基因進(jìn)行掃描，是發(fā)現(xiàn)新功能基因的重要手段。利用雙向啟動(dòng)子的siRNA表達(dá)載體，我們組建了耙向人類胚胎干細(xì)胞和造血干細(xì)胞增殖、分化相關(guān)基因的siRNA干涉文庫。目前，我們的文庫含有近450個(gè)載體，靶向225個(gè)人類基因。我們利用一部分文庫(包含70個(gè)基因(20個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，50個(gè)未知功能蛋白))對(duì)細(xì)胞增殖相關(guān)基因進(jìn)行新功能基因的篩選(Ghildiyal,Seitzetal.2008)。并發(fā)現(xiàn)了能夠影響細(xì)胞增殖的新功能基因一CA^SiJCA^S及J(NM—173515;HomosapiensCNKSRfamilymember3(CNKSR3))又名MAGI1(membraneassociatedguanylatekinaseinteractingprotein-like1)。目前已有石開究表日月CA^5W能夠同上皮細(xì)胞選擇性粘附分子(Endothelialcell-selectiveadhesionmolecule,ESAM)相互結(jié)合，介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞間的相互接觸，而且同ESAM的結(jié)合很有可能是通過CA^5W蛋白上的PDZ結(jié)構(gòu)域完成的(Wegmann,Ebnetetal.2004)。同時(shí)CA^5iW也介導(dǎo)Dill(Delta-likel)在細(xì)胞膜上的定位(Mizuhara,Nakatanietal.2005)，而且整合素相關(guān)激酶(Integrin-linkedkinase，ILK)同CNKSR3基因的調(diào)節(jié)區(qū)相互作用，負(fù)調(diào)節(jié)CA^S/3基因的表達(dá)(Acconcia,Barnesetal.2007)，但是關(guān)于aV/Si^對(duì)于細(xì)胞增殖能力的影響還未見報(bào)道。通過siRNA文庫掃描以及進(jìn)一歩對(duì)CA^5i3的功能研究證實(shí)基因在細(xì)胞增殖過程中有著重要的作用，沉默CW尤Si^的表達(dá)促進(jìn)了細(xì)胞的增殖。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提出一種基于細(xì)胞增殖相關(guān)siRNA干涉文庫篩選細(xì)胞增殖相關(guān)基因CA^5/3的方法。OVA57W基因能夠影響細(xì)胞的增殖狀況，尤其是在腫瘤和胚胎細(xì)胞中。這些基因在細(xì)胞分化、腫瘤治療、抗腫瘤藥物的開發(fā)等方面有著巨大的潛在應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明是利用構(gòu)建特異性的siRNA表達(dá)載體pNKRY，組建siRNA干涉文庫，利用該文庫在人宮頸癌HeLa細(xì)胞中，對(duì)細(xì)胞增殖相關(guān)基因進(jìn)行篩選(WST-1分析)。初次掃描之后，確定CA^Si3作為候選基因，再對(duì)CA^5i3基因的功能通過4個(gè)不同的分析方法進(jìn)行了進(jìn)一步評(píng)價(jià)1)GFP細(xì)胞比例改變程度分析細(xì)胞增殖能力；2)WST-1分析細(xì)胞增殖能力；3)細(xì)胞計(jì)數(shù)分析細(xì)胞增殖能力；4)BrdU滲入分析細(xì)胞增殖能力。本發(fā)明提供的細(xì)胞增殖相關(guān)基因CNKSR3的核苷酸序列如序列表所示。所述的細(xì)胞增殖相關(guān)基因CNKSR3的篩選方法，包括下述步驟第l、限制性siRNA干涉文庫的構(gòu)建第l.l、候選基因的挑選、siRNA模版的設(shè)計(jì)與合成第l丄l、根據(jù)美國斯坦福大學(xué)2004年公布的關(guān)于干細(xì)胞發(fā)育過程中基因芯片(http:〃smd-www.stanford.edu/cgi-bin/source/sourceResult.html)的結(jié)果，從中挑選在干細(xì)胞發(fā)育過程中表達(dá)量發(fā)生明顯變化，大于2倍，的基因作為候選基因；第1丄2、根據(jù)PUBMED數(shù)據(jù)庫，檢索上步候選基因的cDNA序列；第1.1.3、根據(jù)Ambion公司(http:〃www.ambion.com/techlib/misc/siRNA—finder.html)所提供的在線軟件尋找siRNA作用的耙序列；第l丄4、根據(jù)siRNA耙序列設(shè)計(jì)siRNA模板，并交由試劑公司合成；第1.2、siRNA模版的制備與磷酸化第1.2.1將合成的單鏈DNA稀釋至lpg^L;第1.2.2取正義鏈、反義鏈各22.5pL，加入5^L10x退火緩沖液；第1.2.3加熱至94。C，反應(yīng)5min，隨后自然冷卻至室溫，單鏈DNA即退火形成雙鏈siRNA模板；第1.2.4退火的雙鏈siRNA模板lpL(l嗎/nL),10xT4磷酸酶緩沖液lpL，T4磷酸激酶lpL，濃度10u^iL;ATPlpL，濃度10mmol/L;并加雙蒸水至終體積10|aL，；37'C下反應(yīng)30min;第1.2.5反應(yīng)完成之后，加熱體系至70'C終止反應(yīng)，然后自然冷卻至室溫；第1.3、特異性的siRNA表達(dá)載體構(gòu)建第1.3.1將磷酸化的siRNA模板與線性化siRNA表達(dá)載體100ng，用T4連接酶進(jìn)行連接；第1.3.216'C反應(yīng)12h之后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞￡丄0//￡)//5;第1.3.3利用Amp抗性在含有Amp，濃度50昭/pL的1%的LB瓊脂糖平板上挑選陽性轉(zhuǎn)化子；第1.3.4每個(gè)平板隨機(jī)挑選10個(gè)陽性轉(zhuǎn)化子，菌落PCR對(duì)陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行鑒定，上游引物5'-CTGGGAAATCACCATAAACGTGAA-3';下游引物5，-GCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCG-3，；PCR反應(yīng)程序94°C4min;94°C30s，55°C30s，72°C60s，重復(fù)25個(gè)循環(huán)；72°C2min;陽性轉(zhuǎn)化子電泳時(shí)只存在186bp左右的帶；第1.3.5提取篩選得到的陽性轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒，多個(gè)基因的siRNA表達(dá)載體質(zhì)粒就組成了細(xì)胞增殖相關(guān)的siRNA干涉文庫；第2、文庫功能鑒定第2.1、HEK293T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染第2丄1細(xì)胞轉(zhuǎn)染參照Lipofectamine2000說明書，取對(duì)數(shù)生長期HEK293T細(xì)胞，接種于6孔培養(yǎng)板，每孔接種細(xì)胞5xl()5個(gè)；第2丄2培養(yǎng)24h后進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，并設(shè)未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞和轉(zhuǎn)染等量空白質(zhì)粒(不靶向任何基因，只表達(dá)綠色熒光蛋白的質(zhì)粒)pNKRY-GFP作為對(duì)照；第2丄3轉(zhuǎn)染48h之后，按照Trizol說明書，提取各組細(xì)胞的總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄RT-PCR檢測(cè)特定基因的沉默效果；上游引物SOCS3:5'-ATGGTAGCACGCAACCAGG-3',GAPDH:5'-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACGGATTTGGC-3，；下游引物SOCS3:5'-TCAGATCTGGAAGGGGAAG-3'，GAPDH:5'-CATCGAAGGTGGAAGAGTGGGAGTTGCTGT-3';第2丄4按照哺乳動(dòng)物裂解試劑盒說明書，裂解細(xì)胞，取全蛋白進(jìn)行SDS-PAGE;第2丄5將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，室溫下以5%脫脂奶粉阻斷1h，兔抗人SOG^抗體孵育lh，辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG孵育lh;第2丄6ECL法顯色，暗室曝光顯影成像；第3、高通量功能基因掃描第3.1、WST-1高通量細(xì)胞增殖分析第3丄1將用含10%FCS的D-MEM培養(yǎng)基在5%二氧化碳溫箱中培養(yǎng)狀態(tài)良好的HeLa細(xì)胞鋪96于孔板中，每孔2xl04/Cells;第3丄212小時(shí)后將siRNA干涉文庫中同一個(gè)基因的兩個(gè)質(zhì)粒混合后利用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染；每個(gè)基因轉(zhuǎn)染3個(gè)復(fù)孔；第3丄3轉(zhuǎn)染48小時(shí)后在450nm下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行WST-1檢測(cè)；WST-1是一種類似于MTT的化合物，在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成橙黃色的formazan細(xì)胞增殖越多越快，則顏色越深；細(xì)胞增殖越慢，則顏色越淺；第3丄4取第4個(gè)小時(shí)的各基因數(shù)據(jù)進(jìn)行雙側(cè)t檢驗(yàn)，根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果選出變化顯著的基因，其T值>1.645或者T值<一1.645;并計(jì)算同轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒數(shù)據(jù)的比率;經(jīng)對(duì)50個(gè)未知功能基因均進(jìn)行了掃描，實(shí)驗(yàn)顯示CW^Si3(NMJ73515;HomosapiensCNKSRfamilymember3(aV《Si3))，其T值=8.051663>1.645，能夠影響HeLa細(xì)胞的增殖能力，沉默CA^Si^基因能夠促進(jìn)HeLa細(xì)胞的增殖，增殖比率19%±2.82%;第4、CA^S7^基因的克隆按照Trizol使用說明書，從HEK293T細(xì)胞中提取TotalRNA;利用CA^Si3引物正義爭(zhēng)連5'-atggaacccgtgaccaagtggagcccca-3，；反義鏈5'-gtgagtcaacagtttgaggcgcgta-3';通過Invitrogen公司提供的RT-PCR試劑盒，按照該公司提供的實(shí)驗(yàn)步驟擴(kuò)增CA^S/3基因，通過Invitrogen膠提取試劑盒提取擴(kuò)增的CA^S/3基因片段。然后通過Invitrogen公司提供的pCDNA31ffis/V5ToPo載體，根據(jù)該公司提供的實(shí)驗(yàn)步驟將CiVXSW基因克隆到pcDNA3.iHis/V5TOPO載體，最后，通過測(cè)序確定RGS1序列克隆了CA^S/3基因，并將其連入pcDNA3.1V5表達(dá)載體中；第5、對(duì)篩選的細(xì)胞增殖相關(guān)基因CA^SiW基因功能進(jìn)一步鑒定第5.1、GFP細(xì)胞比例改變程度分析CA^Si3基因?qū)?xì)胞增殖能力的影響基因?qū)?xì)胞增殖存在影響，轉(zhuǎn)染了成功的細(xì)胞與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞、以及轉(zhuǎn)染了空白對(duì)照載體的細(xì)胞相比，增殖能力存在差異，培養(yǎng)一段時(shí)間之后會(huì)造成轉(zhuǎn)染的陽性細(xì)胞比率的改變；第5.2、WST-1檢測(cè)CA^SW基因?qū)?xì)胞增殖功能的影響將pcDNA3.1-CA^5i3,pNKRY-WCA^SiU以及他們的對(duì)照質(zhì)粒pcDNA3.1，pNKRY-GFP轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，并通過WST-1方法檢測(cè)CA^SW基因?qū)ζ湓鲋彻δ艿挠绊懀坏?.3、細(xì)胞計(jì)數(shù)分析CA^S7^基因?qū)?xì)胞增殖能力的影響WST-1檢測(cè)細(xì)胞增殖完成之后，我們又將各組的細(xì)胞用胰酶消化下來，臺(tái)盼蘭染色之后，計(jì)數(shù)各組的細(xì)胞，分析CAT57^基因?qū)?xì)胞增殖能力的影響；第5..4、BrdU滲入檢測(cè)CA/X基因?qū)?xì)胞增殖能力的影響B(tài)rdU是一種核苷類似物能夠特異性地滲入進(jìn)入S期的細(xì)胞，因此在新增殖的細(xì)胞合成的DNA中會(huì)滲入BrdU，用PE標(biāo)記的抗BrdU特異性的抗體，就能夠標(biāo)記出新增殖的細(xì)胞，利用FACS分析細(xì)胞的增殖能力；在轉(zhuǎn)染了各組質(zhì)粒細(xì)胞的培養(yǎng)液中加入BrdU，培養(yǎng)48小時(shí)之后，按照BrdUFlowKits提供的說明書進(jìn)行染色，然后FACS分析各組細(xì)胞的情況。本發(fā)明提供的上述方法還可以應(yīng)用于大規(guī)模功能基因的篩選及功能基因的研究。所述的細(xì)胞增殖相關(guān)基因CA^Si3，可應(yīng)用于抗腫瘤藥物以及影響細(xì)胞增殖藥物的制備中。本發(fā)明提供了一個(gè)非常有效的基于細(xì)胞增殖相關(guān)基因siRNA干涉文庫篩選細(xì)胞增殖相關(guān)基因CA^Si3的方法，在對(duì)細(xì)胞增殖與分化、腫瘤治療、抗腫瘤藥物的開發(fā)等研究有著重要的意義。通過細(xì)胞增殖相關(guān)基因siRNA干涉文庫和WST-1高通量分析建立了篩選細(xì)胞增殖相關(guān)基因的方法。細(xì)胞增殖相關(guān)基因CA^SiJ參與細(xì)胞增殖信號(hào)通路的調(diào)控，在細(xì)胞增殖與分化，腫瘤治療，抗腫瘤藥物的開發(fā)等方面有著潛在的應(yīng)用價(jià)值。CA^SiJ基因在細(xì)胞增殖信號(hào)通路調(diào)控中具有重要作用，細(xì)胞增殖相關(guān)基因在腫瘤治療，細(xì)胞分化的研究中具有重要作用，是生物治療和新藥物開發(fā)的重要靶點(diǎn)。本發(fā)明的積極效果細(xì)胞增殖相關(guān)基因CA^S/W對(duì)細(xì)胞的分化與增殖研究具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。細(xì)胞的分化與增殖是一個(gè)多基因調(diào)控的過程。目前對(duì)于分化與增殖的調(diào)控的分子機(jī)制目前還不清楚。研究細(xì)胞增殖與分化相關(guān)基因有助于在分子水平了解細(xì)胞增殖與分化的分子機(jī)制，對(duì)通過生物手段控制細(xì)胞的定向分化具有重要的意義。細(xì)胞增殖相關(guān)基因CA^Si3對(duì)腫瘤治療具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。惡性腫瘤是目前亟需解決的疾病之一。每年死于惡性腫瘤的人數(shù)眾多。腫瘤的發(fā)生與發(fā)展、以及腫瘤的生長是多基因參與的復(fù)雜的調(diào)控過程。我們通過高通量的siRNA干涉文庫掃描，在人宮頸癌細(xì)胞株HeLa細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)CA^Si3能夠影響癌細(xì)胞的增殖能力，為我們研究癌細(xì)胞的生長機(jī)制提供了一個(gè)選擇。對(duì)闡明癌細(xì)胞生長的機(jī)制具有重要的意義。與此同時(shí)，由于后續(xù)的研究進(jìn)一步證實(shí)CW^Si^在細(xì)胞增殖過程中具有重要的作用。因此，CA^Si^腫瘤的生物治療以及新的抗腫瘤藥物的研發(fā)中，可能成為重要的靶基因。對(duì)腫瘤的治療和新藥物的開發(fā)具有重要的意義。圖1是根據(jù)靶序列設(shè)計(jì)的siRNA模版示意圖。圖2是電泳檢測(cè)陽性轉(zhuǎn)化子。圖3是特異性siRNA表達(dá)載體及其對(duì)照空白載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。圖4是轉(zhuǎn)染各組細(xì)胞的TotalRNA及其RT-PCR電泳結(jié)果。A是轉(zhuǎn)染各組細(xì)胞的TotalRNA的電泳結(jié)果；B利用S0CS3的引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄RT-PCR的電泳結(jié)果。表明轉(zhuǎn)染了SOCS3特異性siRNA表達(dá)載體pNKRY-w'SOGS3在轉(zhuǎn)染細(xì)胞48小時(shí)之后，能夠在mRNA水平上有效地沉默SOCS3的表達(dá)。圖5是轉(zhuǎn)染各組細(xì)胞的Western-Blotting。圖6是WST-1高通量掃描結(jié)果。圖7是利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞中表達(dá)綠色熒光細(xì)胞比率。A是流式細(xì)胞儀檢測(cè)時(shí)選取的細(xì)胞群；B是檢測(cè)未轉(zhuǎn)染細(xì)胞中表達(dá)綠色熒光細(xì)胞比率，作為陰性對(duì)照；C是轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒pNKRY-GFP在第O小時(shí)時(shí)，轉(zhuǎn)染細(xì)胞中表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)的細(xì)胞比率；D是轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒pNKRY-GFP在第48小時(shí)時(shí)，轉(zhuǎn)染細(xì)胞中表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)的細(xì)胞比率；CD說明轉(zhuǎn)染空白對(duì)照載體pNKRY-GFP的細(xì)胞中熒光細(xì)胞的比率在0h，48h變化不大。E是轉(zhuǎn)染siRNA表達(dá)質(zhì)粒pNKRY-w'CA^Si^在第0小時(shí)時(shí)，轉(zhuǎn)染細(xì)胞中表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)的細(xì)胞比率；F是轉(zhuǎn)染siRNA表達(dá)質(zhì)粒pNKRY-w'CiVX5i^在第48小時(shí)時(shí)，轉(zhuǎn)染細(xì)胞中表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)的細(xì)胞比率；EF說明培養(yǎng)48小時(shí)之后，轉(zhuǎn)染siRNA表達(dá)載體pNKRY-w'CA^Si3的細(xì)胞中的綠色熒光細(xì)胞的比率明顯增加，即沉默了CWiffi/^確實(shí)能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖。圖8是WST-1檢測(cè)法檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖能力。A是WST-1檢測(cè)轉(zhuǎn)染表達(dá)載體pcDNA-CA^Si3及其對(duì)照載體的細(xì)胞的增殖能力；轉(zhuǎn)染了CA^5i3基因表達(dá)載體pcDNA-V5-CA^SW的細(xì)胞，使aVXSW過量表達(dá)會(huì)抑制細(xì)胞的增殖。B是WST-1檢測(cè)轉(zhuǎn)染siRNA表達(dá)載體pNKRY-w'CA^5i^及其對(duì)照載體的細(xì)胞的增殖能力；轉(zhuǎn)染了CA^SW基因的siRNA表達(dá)載體pNKRY-^CA^Si^的細(xì)胞，沉默CA^Si3的表達(dá)則促進(jìn)細(xì)胞的增殖。圖9是細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖能力。圖10利用BrdU滲入法檢測(cè)轉(zhuǎn)染各種載體之后，細(xì)胞的增殖能力的變化。A是轉(zhuǎn)染對(duì)照載體pcDNA3.1-V5的細(xì)胞在第0小時(shí)時(shí)，F(xiàn)ITC/PE雙陽性細(xì)胞的比率；B是轉(zhuǎn)染對(duì)照載體pcDNA3.1-V5的細(xì)胞在第48小時(shí)時(shí)，F(xiàn)ITC/PE雙陽性細(xì)胞的比率；C是轉(zhuǎn)染表達(dá)載體pcDNA3.1-CA^S73的細(xì)胞在第0小時(shí)時(shí)，F(xiàn)ITC/PE雙陽性細(xì)胞的比率；D是轉(zhuǎn)染對(duì)照載體pcDNA3.1-CA^SW的細(xì)胞在第48小時(shí)時(shí)，F(xiàn)ITC/PE雙陽性細(xì)胞的比率；AD說明轉(zhuǎn)染了GVi^i^基因表達(dá)載體pcDNA-V5-CiViffl7^的細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)之后，和轉(zhuǎn)染了空白對(duì)照載體pcDNA3.1-V5的細(xì)胞相比，F(xiàn)ITC/PE雙陽性細(xì)胞的比率降低，表明CA^S73過量表達(dá)會(huì)抑制細(xì)胞的增殖。E是轉(zhuǎn)染對(duì)照載體pNKRY-GFP的細(xì)胞在第0小時(shí)時(shí)，GFP/PE雙陽性細(xì)胞的比率；F是轉(zhuǎn)染對(duì)照載體pNKRY-GFP的細(xì)胞在第48小時(shí)時(shí)，GFP/PE雙陽性細(xì)胞的比率；G是轉(zhuǎn)染siRNA表達(dá)載體pNKRY-'CASi3的細(xì)胞在第0小時(shí)時(shí)，GFP/PE雙陽性細(xì)胞的比率；H是轉(zhuǎn)染siRNA表達(dá)載體pNKRY-'aViSi^的細(xì)胞在第48小時(shí)時(shí)，GFP/PE雙陽性細(xì)胞的比率；EH說明轉(zhuǎn)染siRNA表達(dá)載體pNKRY-WCA^Si^的細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)之后，和轉(zhuǎn)染了空白對(duì)照siRNA表達(dá)載體對(duì)照載體pNKRY-GFP的細(xì)胞相比，GFP/PE雙陽性細(xì)胞的比率明顯增加，表明沉默CA^SiJ的表達(dá)則促進(jìn)細(xì)胞的增殖。具體實(shí)施方式下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體描述實(shí)施例1、細(xì)胞增殖相關(guān)基因C7Vffi/W的篩選(1)限制性siRNA干涉文庫的構(gòu)建1)候選基因的挑選、siRNA模版的設(shè)計(jì)與合成1我們根據(jù)美國斯坦福大學(xué)2004年公布的關(guān)于干細(xì)胞發(fā)育過程中基因芯片(http:〃smd-www.stanford.edu/cgi-bin/source/sourceResult.html)的結(jié)果，從中挑選在干細(xì)胞發(fā)育過程中表達(dá)量發(fā)生明顯變化，變化值>2倍，的基因作為候選基因。2根據(jù)PUBMED數(shù)據(jù)庫，檢索候選基因的cDNA序列。3根據(jù)Ambion公司(http:〃www.ambion.com/techlib/misc/siRNA—finder.html)所提供在線軟件尋找siRNA作用的靶序列，每個(gè)基因至少2個(gè)靶序列。4根據(jù)siRNA耙序列設(shè)計(jì)siRNA模板，并交由試劑公司和成。圖1是我們?cè)O(shè)計(jì)出的siRNA模板的示意圖，我們尋找到的siRNA的耙序列是一對(duì)同源互補(bǔ)的序列，長度為19bp，分別在正義鏈與反義鏈的5'端加上"aaag"和"aaaa"4個(gè)堿基，使其由平末端轉(zhuǎn)變成為粘性末端，這樣既保證了siRNA模板能夠以正確的方式連入siRNA表達(dá)載體pNKRY，又提高了連接的效率，使得模板更加容易連接。表1是我們選取的50個(gè)細(xì)胞增殖相關(guān)基因siRNA的靶位點(diǎn)。表1基因名稱靶位點(diǎn)序列1靶位點(diǎn)序列2AACTGACTCAGTCATCATTGCAAGAACTCACTTCTCAGAACAAACGACTGCTTCGTCAAGATCAAGGGCAACTACTGGACCCTGAAGATACAGGACTTACCATCCAACAGCAGTGAGCAAGGTGAT￡>/AAGCGCATTCTGCACAAGACCAACAAGCGCATTCTGCACAAGAAGCGATCAAGCAGCGACTATAAGGTATTCAGCCAAACGACCAAGAGTTTGCATCTCTAACAGAACAGTTTCCCAGGCAGTACTAAGCTGGTGAAAGTGTGCACAAACGTGGAGCTCAAGTTTGTGAAGCACAGACAAGAATGGACAAACACACGAACACAGACCAGAAACTATCTTCCTGCTGGTGACAAGCTGTGAAGAAACTGCTGGCC"AACCGCCAAGTGTGTGCCAACAAGTGTGTGCCAACCCAGAGA藩5;AAGTTCGTCTTCTCCACGGAGAACTTCAGACCAGATTGTTCCAAGTCGAGTGTGCTACTCAACAAGAAGGCGCGCAAGAACGCTAAGAAGAGGAGGACATCAGTGAAGTCAAGCACAATGGCTGGGAACACAGTCAGCAAGCTGGTGAATGAACCACAGTGCTTCTACAAGTGTCACCTCATTCCAGGCAAGATGCTCCACATAAGATCCMM渭AACAGTTATGCGGCCTGGGCTAAGGAGGCGGAGGCATTCCTAW冊(cè)2AACCTGAACCATTACGCCACCAACAACGCAGCCACCATCTTG幼"AAGAGAGTGAGGATGTGTCCAAAGGTGTCAATGTCCAGCACTAACATACAGAAACTTTGCTGGAAGATGAATTGAATCTTCTGGAAGGTCTGGAGCAGAGCTGTGAACTCTGGCTCCTTACAGCAGAACAGGTGTCTAGTCACATTCAACGAGTGCTTCGTCAAGGTGAAGCCTCACCTCCTCTACAAG￡CMZAAGATAAGAGGACGCAGAAGC，/AAGACTTGACCACTTACTTGGJ7F7AATGAGGTTGTTAGCCTGATGAATGCTATGGTGCTGGAACTG孤2AAGACATGGAGTTATTGGTGGAACACATGCATTCTCGAAGAGAAGGAGAGTGGTGACATCTCG房認(rèn)〃AAGTACTTGGAGTTACGAAAGAACGATGCAGAGAGTAGGAAG，77AAGCAACAACTCTCAATGTAGAAGGAGACATTCGACTCTGTGAACACCTTTCGAAACTCCTGAAAGACCCAATGATCAATGAGA層57AACAAGAGATTGAAAGAACTCAACAGTGAAGGCTGTGTTCAAAATGTACTGGCACATCCTTGCAAGGACATCTTTAAGGAAGAGAAGTTACTTCATCATGTGACAAACTATCACAGACTTCTGTACAAGTACCAAGTGGAGTACGACAACAGTTGTGCCTATAAGGTGAAGACAGTGACAGTGCTCCTCAAGAAGCAGGTCTAGAAGAAGAAGAGATGCTGGATGAAGAAGAAGCTGAAGTACTGCTTCACCAAGCTGCAGCAGAAGGAGGAGAACTCCAAGTCAGATTATGTCAAGGTGTCTTACACCTTACAGAACCAGTCAGTACGAGAGTTCAAGGACAAGGAGGAGAAGGACAAGTACTCTGAGTACTGAAGGAAGCCAGAGAATCTGCTGTACAAGAAGACTGGCCTAGAGATGAAGCACACGGCCAGCAATGTGAATGGCACGACCTAGTGGTCGAAGCTCTACACATATATCCAGAAGAAGATAGAACAGTGTGACAACTCTGTGAAGGTGATGTACAATGAAGAACAAGCATGTAACAAGCACATGGAGATAGACATCAAGAGAAGCTGTCGAATCCTCAACATCAGAGGATTCAAACGCAAGTATGATCCAACTCACTTCAAGGAGAAGATCAGCATGTGGAAGATCTATGAAGAAGATCAGAAGGCTGTGTTCAAGGAGTTGAAGTCTGATTGAAACAGTGCAAAGGCTTGTCCTCATGTCTGGAAGCTTCCACTGACAAGGAAGAACATTCCAGAGGGTTCTCACAAGACCAGTTTGAGTACGAGCAAGTGCACTCGGAGCCCACTAAAGCAGGACGTATGCAAGACAAAGCAGGTCTAGAAGAAGTAGAAGTAACCTGAACCCAGATGCAAGGACTGCGAGTACCAGCAGAAGAATCTCAGCCAGAGTCCT1AAGTGGTGGACTGGACTAGAGAAGCAGGTGCTACATCAACTCAAGTGCTGGTTCCTATTCCTCAACGATGACCTCAACAACGTCAATCCTGCTCCAAGGCTCACCAAGCTGGAGTTCATGTTGGTGM艦AAGCTGCTCTCAGTGTGGTGCAAGGAGAATACACACATCACAAAGGATACACTCCACAGACAGAAGACCAGGAAGCAGAAGCAC層wAAGCAGGAAGCTTATGAGCAGAAGCAGCTGGAACACAGGAGGAACTGGTTCTGCAAGGAGCAGAAGTCAACCAGCCAAGGCAGGAATCTGTCTGTGTTCAGACAGAAGCTCAGTTCTACACTCTGCAACCTGTGTCAGTGGACAAGGAAGCAGTACTATGAGCAATCCAAGTACCTGCTGGAGGAGTGGAAGCTGCATCACCACCTGCACAAGACAGACTTCAGAGGCATGAACCTACAGCATGAAGAGCTAAAGCATGGAAACATCCACTTGAAGCAATGAAGCCAGAGGAGCAAGCTGGCCAAGAACATACTGAACCTCAGGAGTCTGACACAGAAGACATGTTCTACCTGCAAGAACGTGAACTTGAGGATGATG柳iVAACCAGGATCCTTCAAGGTCGAAGGTCGATACTGCAAGCAAC，C3AAGCAGGCCACTCCTTACATCAAGACGAGAGACTCAGGAACTGciAAGCACAGTGCTGAGAAGGAGAACGTCATCAACTGCAACTTCAAGGTGTCGATGTGGTCTATGAAGTATCAAGCAGCCATGAGC2)siRNA模版的制備與磷酸化1將合成的單鏈DNA稀釋至lpg4iL。2取正義鏈、反義鏈各22.5pL，加入5pL10x退火緩沖液。3加熱至94。C，反應(yīng)5min，隨后自然冷卻至室溫，單鏈DNA即退火形成雙鏈siRNA模板。4退火的雙鏈siRNA模板lpL，濃度l嗎/^L;10xT4磷酸酶緩沖液lpL;T4磷酸激酶lpL，濃度10u4iL;ATPlpL，濃度10mmol/L;并加雙蒸水(ddwater)至終體積lOpL,37。C下反應(yīng)30min。5反應(yīng)完成之后，加熱體系至7(TC終止反應(yīng)，然后自然冷卻至室溫。3)特異性的siRNA表達(dá)載體構(gòu)建1將磷酸化的siRNA模板與線性化siRNA表達(dá)載體100ng用T4連接酶進(jìn)行連接。216'C反應(yīng)12h之后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞￡.^//￡)//56(。3利用Amp抗性在含有Amp，濃度50昭&L，的1%的LB瓊脂糖平板上挑選陽性轉(zhuǎn)化子。4每個(gè)平板隨機(jī)挑選10個(gè)陽性轉(zhuǎn)化子，菌落PCR對(duì)陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行鑒定，上游引物5，-CTGGGAAATCACCATAAACGTGAA-3，；下游引物5，-GCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCG-3，。PCR反應(yīng)程序94°C4min;94°C30s，55°C30s,72°C60s，重復(fù)25個(gè)循環(huán)；72°C2min。陽性轉(zhuǎn)化子電泳時(shí)只存在186bp左右的帶。5提取篩選得到的陽性轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒，多個(gè)基因的siRNA表達(dá)載體質(zhì)粒就組成了細(xì)胞增殖相關(guān)的siRNA干涉文庫。圖2是對(duì)隨機(jī)挑選的陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR鑒定的結(jié)果，從電泳圖中可以看出1,2,5,7,8,9,12，13，14,15,17，19泳道片段的大小為lOOObp左右，是未酶切完全的假陽性菌落；3,4,6,10,11,16,18,20泳道的片段大小為186bp左右，均為siRNA模板正確連接的陽性克隆。(2)文庫功能鑒定1)HEK293T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染1細(xì)胞轉(zhuǎn)染參照Lipofectamine2000說明書，取對(duì)數(shù)生長期HEK293T細(xì)胞，接種于6孔培養(yǎng)板，每孔接種細(xì)胞5xl05個(gè)。2培養(yǎng)24h后進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，并設(shè)未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞和轉(zhuǎn)染等量空白質(zhì)粒(不耙向任何基因，只表達(dá)綠色熒光蛋白的質(zhì)粒)pNKRY-GFP作為對(duì)照。圖3是轉(zhuǎn)染了SOCS特異性siRNA表達(dá)載體pNKRY-siSOCS3、以及其空白對(duì)照質(zhì)粒pNKRY-GFP的熒光顯微鏡照片。由于siRNA表達(dá)載體pNKRY-siSOCS3上具有綠色熒光蛋白，因此轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞在紫外激發(fā)光下會(huì)表現(xiàn)出熒光。從圖片中我們可以看出，pNKRY-siSOCS3以及其空白對(duì)照質(zhì)粒pNKRY-GFP對(duì)HEK293T細(xì)胞有較高的轉(zhuǎn)染率。3轉(zhuǎn)染48h之后，按照Trizol說明書，提取各組細(xì)胞的總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄RT-PCR檢測(cè)特定基因的沉默效果。上游引物SOCS3:5，-ATGGTAGCACGCAACCAGG-3，，GAPDH:5'-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACGGATTTGGC-3，；下游引物SOCS3:5，-TCAGATCTGGAAGGGGAAG-3',GAPDH:5，-CATCGAAGGTGGAAGAGTGGGAGTTGCTGT-3，。圖4是提取的各組細(xì)胞總RNA的電泳圖以及反轉(zhuǎn)錄RT-PCR結(jié)果的電泳圖。A:各組細(xì)胞總RNA的電泳結(jié)果，從結(jié)果可以看出各組RNA完整，均沒有降解。B:利用SOCS3的引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄RT-PCR的電泳結(jié)果。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了SOCS3特異性siRNA表達(dá)載體pNKRY-WSOCW在轉(zhuǎn)染細(xì)胞48小時(shí)之后，能夠在mRNA水平上有效地沉默SOCS3的表達(dá)。4按照按照哺乳動(dòng)物裂解試劑盒說明書，裂解細(xì)胞，取全蛋白進(jìn)行SDS-PAGE。5將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，室溫下以5%脫脂奶粉阻斷1h，兔抗人SOC^抗體孵育1h,辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG孵育1h。6ECL法顯色，暗室曝光顯影成像。圖5是對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行Western-Blotting檢測(cè)SOCS3在蛋白質(zhì)水平被沉默的情況，結(jié)果顯示以"-actin作為內(nèi)參，我們構(gòu)建的SOCS3特異性siRNA表達(dá)載體pNKRY-^SOCW在轉(zhuǎn)染細(xì)胞48小時(shí)之后，能夠在蛋白質(zhì)水平上有效地沉默SOCS3的表達(dá)。綜合圖4、圖5的結(jié)果，我們用于構(gòu)建siRNA干涉文庫的載體pNKRY在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平都能夠有效地沉默目的基因的表達(dá)，因此利用該載體pNKRY組建的siRNA干涉文庫能夠用于功能基因的掃描與研究。(3)高通量功能基因掃描1)WST-1高通量細(xì)胞增殖分析1將用含10%FCS的D-MEM培養(yǎng)基在5%二氧化碳溫箱中培養(yǎng)狀態(tài)良好的HeLa細(xì)胞鋪96于孔板中，每孔2xlO"Cells。212小時(shí)后將siRNA干涉文庫中同一個(gè)基因的兩個(gè)質(zhì)粒混合后利用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染。每個(gè)基因轉(zhuǎn)染3個(gè)復(fù)孔。3轉(zhuǎn)染48小時(shí)后在450nm下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行WST-1檢領(lǐng)lj。WST-1是一種類似于MTT的化合物，在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成橙黃色的formazan細(xì)胞增殖越多越快，則顏色越深；細(xì)胞增殖越慢，則顏色越淺。4取第4個(gè)小時(shí)的各基因數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)(雙側(cè))，根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果選出變化顯著的基因，其T值〉1.645或者T值<一1.645。并計(jì)算同轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒數(shù)據(jù)的比率。圖6是我們利用WST-1分析進(jìn)行高通量掃描的部分結(jié)果，從該結(jié)果中可以看出，沉默aV^5i^基因能夠HeLa細(xì)胞的增殖，其增殖比率19%±2.82%。表2是我們對(duì)所有掃描結(jié)果進(jìn)行T檢驗(yàn)(雙側(cè))之后，得到的T值表，從表中可以看出，CA^5i3基因在3次的掃描結(jié)果中，其T值都有顯著性差異，因此我們推測(cè)CA^SiW基因可能在細(xì)胞增殖過程中具有重要的作用。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>8.077166-3.903271.418239FZJ707"-7.32529CAKS73.3183281.7092638.0516635.806449膠7-1.34391五CfflW-0,53111MGC76柳13.479085TV腦710.85947F贏"5fi8.357141.125599CffiTO8.917596iM朋6G11.76496-0.34628FA/B尸/丄8.800268-0.08505l.l卯lOlLS7W23.469364-3.16814Z)CC7-1.202947bw7i^-2.4038C7》/720,6322388.801389-1.09648TM服WS-0.17787Fos/2-4.44138-1.75173-9.03723iMMX550,2191370.70363贏Z)i/D71.1362952.620133CC￡C/〃-0.14420.568993MV571.093806-0.204732,5450,084297-2.4442TM蘊(yùn)，3.149189GmD/-2.41335iZ)爐DJ0.963547M^5-ZF-0.86381S腦7,9235662.02468C70or兩-1.74968柳C3-3.48886GCOM/-1.69101MS艦0細(xì)34-0.91857-1.220750.740056-6,2885-2.309780.6426231.3823451細(xì)9170.4763421,77791(4)CA^9i3基因的克隆按照Trizol使用說明書，從HEK293T細(xì)胞中提取TotalRNA。利用CA^SW弓|物通過Invitrogen公司提供的RT-PCR試劑盒，按照該公司提供的實(shí)驗(yàn)步驟擴(kuò)增CiV^Si3基因，通過Invitrogen膠提取試劑盒提取擴(kuò)增的CA^5及3基因片段。然后通過Invi加gen公司提供的pcDNA3jHis/V5ToPo載體，根據(jù)該公司提供的實(shí)驗(yàn)步驟將CWiCSi^基因克隆到pcDNA31His/V5TOPO載體。最后，通過測(cè)序確定RGS1序列克隆了aVATS/3基因，并將其連入pcDNA3.1V5表達(dá)載體中，構(gòu)建了CW/Si3基因的表達(dá)載體pcDNA-V5-CA^5i丄CJVX5i3的基因序列見序列表所示。(5)對(duì)篩選的細(xì)胞增殖相關(guān)基因CA^SiJ基因功能進(jìn)一步鑒定1)GFP細(xì)胞比例改變程度分析CA^5i3基因?qū)?xì)胞增殖能力的影響如果OViSi^基因?qū)?xì)胞增殖存在影響的話，那么轉(zhuǎn)染了CA^SiJ特異性siRNA表達(dá)載體pNKRY-w'CA^Si3的細(xì)胞會(huì)由于CA^SW3被沉默，而與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞、以及轉(zhuǎn)染了空白對(duì)照載體pNKRY-GFP的細(xì)胞相比，其增殖能力是不同的。由于先期的研究發(fā)現(xiàn)，沉默CA^S/^的表達(dá)會(huì)促進(jìn)細(xì)胞的增殖，因此轉(zhuǎn)染了siRNA表達(dá)載體pNKRY-w'CA^Wj的細(xì)胞較其他未轉(zhuǎn)染細(xì)胞、以及轉(zhuǎn)染了空白對(duì)照載體pNKRY-GFP的細(xì)胞會(huì)增殖的更快。由于轉(zhuǎn)染了siRNA表達(dá)載體pNKRY-WCA^S/3的細(xì)胞本身具有熒光且增殖更快，因此熒光細(xì)胞的比率會(huì)隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長而增力口；反之轉(zhuǎn)染了空白對(duì)照載體pNKRY-GFP的細(xì)胞中熒光細(xì)胞的比率隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長而變化不大。圖7是我們通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞中表達(dá)綠色熒光的細(xì)胞比率。從結(jié)果中可以看出，培養(yǎng)48小時(shí)之后，轉(zhuǎn)染siRNA表達(dá)載體pNKRY-w'CA^5i^的細(xì)胞中的綠色熒光細(xì)胞的比率明顯增加，而轉(zhuǎn)染了空白對(duì)照載體pNKRY-GFP的細(xì)胞中熒光細(xì)胞的比率則變化不大。說明沉默了CA^^3確實(shí)能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖。1)WST-1檢測(cè)CA^SiJ基因?qū)?xì)胞增殖功能的影響將pcDNA3.1-OV尤Si^,pNKRY-w'CW尤SiJ以及他們的對(duì)照質(zhì)粒pcDNA3.1，pNKRY-GFP轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，并通過WST-1方法檢測(cè)CiViffii3基因?qū)ζ湓鲋彻δ艿挠绊憽D8是我們通過WST-1檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖能力，cellalone:未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞；pcDNA-V5:轉(zhuǎn)染了空白對(duì)照載體pcDNA3.1-V5的細(xì)胞；pcDNA-V5-CA^SiJ轉(zhuǎn)染了CW^^3基因表達(dá)載體pcDNA-V5-CiV^57J的細(xì)胞；pNKRY-GFP:轉(zhuǎn)染了siRNA表達(dá)載體對(duì)照載體pNKRY-GFP的細(xì)胞；pNKRY-^GVA:Si3:轉(zhuǎn)染了CA^5iU基因的siRNA表達(dá)載體pNKRY-w'a^S/3的細(xì)胞。從結(jié)果中可以看到，CA^iSi3過量表達(dá)會(huì)抑制細(xì)胞的增殖，而沉默av^s/3的表達(dá)則促進(jìn)細(xì)胞的增殖。1)細(xì)胞計(jì)數(shù)分析CA^/3基因?qū)?xì)胞增殖能力的影響WST-1檢測(cè)細(xì)胞增殖完成之后，我們又將各組的細(xì)胞用胰酶消化下來，臺(tái)盼蘭染色之后，計(jì)數(shù)各組的細(xì)胞，分析CA^^3基因?qū)?xì)胞增殖能力的影響。圖9是我們統(tǒng)計(jì)了細(xì)胞計(jì)數(shù)之后的結(jié)果，cellalone:未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞；pcDNA-V5:轉(zhuǎn)染了空白對(duì)照載體pcDNA3.1-V5的細(xì)胞；pcDNA-V5-CA^Si轉(zhuǎn)染了CA^M3基因表達(dá)載體pcDNA-V5-CA^Si3的細(xì)胞；pNKRY-GFP:轉(zhuǎn)染了siRNA表達(dá)載體對(duì)照載體pNKRY-GFP的細(xì)胞；pNKRY-w'aV^Si^:轉(zhuǎn)染了GV尤M3基因的siRNA表達(dá)載體pNKRY-w'GViffii3的細(xì)胞。同圖8的結(jié)果類似，我們從圖9的結(jié)果中可以看出CA^SW過量表達(dá)會(huì)抑制細(xì)胞的增殖，而沉默CA^S7J的表達(dá)則促進(jìn)細(xì)胞的增殖。2)BrdU滲入檢測(cè)CA^SiU基因?qū)?xì)胞增殖能力的影響B(tài)rdU是一種核苷類似物能夠特異性地滲入進(jìn)入S期的細(xì)胞。因此在新增殖的細(xì)胞合成的DNA中會(huì)滲入BrdU。用PE標(biāo)記的抗BrdU特異性的抗體，就能夠標(biāo)記出新增殖的細(xì)胞，利用FACS分析細(xì)胞的增殖能力。在轉(zhuǎn)染了各組質(zhì)粒細(xì)胞的培養(yǎng)液中加入BrdU,培養(yǎng)48小時(shí)之后，按照BrdUFlowKits提供的說明書進(jìn)行染色，然后FACS分析各組細(xì)胞的情況。我們用PE-anti-BrdU標(biāo)記新增殖的細(xì)胞，用FITC-anti-V5標(biāo)記轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1-CA^SiJ-K5以及對(duì)照空白載體pcDNA3.1-V5的細(xì)胞，用siRNA表達(dá)載體自帶的綠色熒光標(biāo)記轉(zhuǎn)染了pNKRY-w'OV^5i^以及pNKRY-GFP的細(xì)胞。圖10是我們用流式細(xì)胞儀分析各組細(xì)胞的增殖結(jié)果，cellalone:未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞；pcDNA-V5:轉(zhuǎn)染了空白對(duì)照載體pcDNA3.1-V5的細(xì)胞；pcDNA-V5-CM^i3轉(zhuǎn)染了CiVX5/^基因表達(dá)載體pcDNA-V5-OVXSiW的細(xì)胞；pNKRY-GFP:轉(zhuǎn)染了siRNA表達(dá)載體對(duì)照載體pNKRY-GFP的細(xì)胞；pNKRY-w'CA^SiU:轉(zhuǎn)染了CA^Si3基因的siRNA表達(dá)載體pNKRY-w'CMS/W的細(xì)胞。從結(jié)果中可以看出CA^9i3過量表達(dá)會(huì)抑制細(xì)胞的增殖，而沉默CWi^iJ的表達(dá)則促進(jìn)細(xì)胞的增殖。序列表<110>南開大學(xué)<120>細(xì)胞增殖相關(guān)基因CNKSR3與篩選方法及其應(yīng)用<160>1<210〉1<211>1668<212>DNA<213>人禾中(Homosapiens)<400>1atggaacccgtgaccaagtggagccccaaacaagtggtggactggactagagggttggat6061gactgcctgcaacaatatgtccacaagtttgaacgagagaagatcaacggcgagcagctg120121ctgcagatttcccatcaggacctggaggagctgggggtcacacggattggacaccaggag180181cttgtgttggaggctgtggaccttctctgtgcactgaattatggcctcgaaactgataac240241atgaagaacttggttctgaaactgagagcatcttcccacaatttacagaattacataagt300301agccgacggaaaagteccgcttacgatggcaacacctcccgcaaggcccccaatgagttc360361ctgacctcggtggtggagctcatcggcgccgccaaggccctgctggcgtggctggaccgg420421gctccgtttacagggatcactgatttctcagtcacgaagaacaaaattatccagctttgc480481ttggacctgaccactacagtccagaaggattgctttgtagcggaaatggaggataaagtt540541ttaactgtggtcaaggttttaaatggcatctgtgacaaaacaatccgatctaccacagat600601cctgtgatgagccagtgtgcatgtctggaggaagttcacttaccaaacattaaacctggg660661gaaggcctgggcatgtacatcaaatcaacctatgatgggttacacgtgattactggaacc720721acagaaaattctcctgcagacagatctcagaagattcatgctggtgacgaagtcattcaa780781gttaatcagcaaactgtggtgggatggcagctgaaaaatctggtgaagaaattgagagag840841aatcccaccggagttgtgttactgcttaagaagcgccccaccgggtctttcaactttact900901cctgctcccctgaaaaacctacggtggaagccatcctcttgtacagacctcacctccaccc960961gcgacaacccagtcccctgaaagcactatggatacctcactgaagaaggagaagtcagcc10201021atcctggatctttatattcctcctccgcctgctgttccctactctccccgggatgagaat10801081ggcagttttgtttatggagggtccagtaagtgcaaacaaccattgcctggtcctaagggt11401141tcagagtecccgaattccttcttggaccaggaaagccggagacgaagattcaccattgca12001201gactcggatcagttgcctgggtactcggtggaaaccaacattctgcccacaaaaatgaga12601261gagaaaacaccatcttatggcaagccacggcctttgtccatgcctgctgatgggaactgg13201321atggggattgtggacccttttgccagacctcgaggtcatggcaggaaaggggaggatgcc13801381ctttgccggtatttcagtaacgagcggattcctccgatcattgaagagagctcctctccc14401441ccataccggttctccagacccacgaccgagcggcatctggtccggggtgcggactacatc15001501cgaggaagcaggtgctacatcaactcagatctccacagcagcgccacgattccattccag15601561gaggaagggaccaaaaagaaatctggctcctcagctacgaagtcctcgtccacagaaccg16201621tccctcctggtcagctggtttacgcgcctcaaactgttgactcactga1668權(quán)利要求1、一種細(xì)胞增殖相關(guān)基因CNKSR3，其核苷酸序列如序列表所示。2、一種權(quán)利要求1所述的細(xì)胞增殖相關(guān)基因CNKSR3的篩選方法，其特征在于包括下述歩驟第l、限制性siRNA干涉文庫的構(gòu)建第l.l、候選基因的挑選、siRNA模版的設(shè)計(jì)與合成第l丄l、根據(jù)美國斯坦福大學(xué)2004年公布的關(guān)于干細(xì)胞發(fā)育過程中基因芯片(http:〃smd-www.stanford.edu/cgi-bin/source/sourceResult.html)的結(jié)果，從中挑選在干細(xì)胞發(fā)育過程中表達(dá)量發(fā)生明顯變化，即變化值>2倍的基因作為候選基因；第1丄2、根據(jù)PUBMED數(shù)據(jù)庫，檢索上步候選基因的cDNA序列；第1.1.3、根據(jù)Ambion公司(http:〃www.ambion.com/techlib/misc/siRNAfinder.html)所提供的在線軟件尋找SiRNA作用的靶序列；第1丄4、根據(jù)siRNA靶序列設(shè)計(jì)siRNA模板，并交由試劑公司合成；第1.2、siRNA模版的制備與磷酸化第1.2.1將合成的單鏈DNA稀釋至lpg4iL;第1.2.2取正義鏈、反義鏈各22.5pL，加入5pL10x退火緩沖液；第1.2.3加熱至94。C，反應(yīng)5min，隨后自然冷卻至室溫，單鏈DNA即退火形成雙鏈siRNA模板；第1.2.4退火的雙鏈siRNA模板lpL,濃度l嗎/^iL;T4磷酸酶緩沖液l(aL;T4磷酸激酶lpL，濃度10u/pL;ATP:lpL，濃度10mmol/L;并加雙蒸水至終體積10pL;37。C下反應(yīng)30min;第1.2.5反應(yīng)完成之后，加熱體系至70'C終止反應(yīng)，然后自然冷卻至室溫；第1.3、特異性的siRNA表達(dá)載體構(gòu)建第1.3.1將磷酸化的siRNA模板與線性化siRNA表達(dá)載體，質(zhì)量100ng;用T4連接酶進(jìn)行連接；第1.3.216'C反應(yīng)12h之后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞￡.^//￡>//5;第1.3.3利用Amp抗性在含有Amp，濃度50ngL的1%的LB瓊脂糖平板上挑選陽性轉(zhuǎn)化子；第1.3.4每個(gè)平板隨機(jī)挑選10個(gè)陽性轉(zhuǎn)化子，菌落PCR對(duì)陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行鑒定,上游引物5'-CTGGGAAATCACCATAAACGTGAA-3，；下游引物5'-GCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCG-3，；PCR反應(yīng)程序94°C4min;94°C30s，55°C30s，72°C60s，重復(fù)25個(gè)循環(huán)；72°C2min;陽性轉(zhuǎn)化子電泳時(shí)只存在186bp條帶；第1.3.5提取篩選得到的陽性轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒組成細(xì)胞增殖相關(guān)的siRNA干涉文庫；第2、文庫功能鑒定第2.1、HEK293T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染第2丄1細(xì)胞轉(zhuǎn)染參照Lipofectamine2000說明書，取對(duì)數(shù)生長期HEK293T細(xì)胞，接種于6孔培養(yǎng)板，每孔接種細(xì)胞5xl()5個(gè)；第2丄2培養(yǎng)24h后進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，并設(shè)未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞和轉(zhuǎn)染等量空白質(zhì)粒——不耙向任何基因，只表達(dá)綠色熒光蛋白的質(zhì)粒——pNKRY-GFP作為對(duì)照；第2丄3轉(zhuǎn)染48h之后，按照Trizol說明書，提取各組細(xì)胞的總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄RT-PCR檢測(cè)特定基因的沉默效果，上游引物SOCS3:5'-ATGGTAGCACGCAACCAGG-3',GAPDH:5'-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACGGATTTGGC-3，；下游引物SOCS3:5'-TCAGATCTGGAAGGGGAAG-3'，GAPDH:5"-CATCGAAGGTGGAAGAGTGGGAGTTGCTGT-3';第2丄4按照哺乳動(dòng)物裂解試劑盒說明書，裂解細(xì)胞，取全蛋白進(jìn)行SDS-PAGE;第2丄5將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，室溫下以5%脫脂奶粉阻斷1h，兔抗人SOGSJ抗體孵育1h，辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG孵育1h;第2丄6ECL法顯色，暗室曝光顯影成像；第3、高通量功能基因掃描第3.1、WST-1高通量細(xì)胞增殖分析第3丄1將用含10%FCS的D-MEM培養(yǎng)基在5%二氧化碳溫箱中培養(yǎng)狀態(tài)良好的HeLa細(xì)胞鋪96于孔板中，每孔2xl04/Cells;第3丄212小時(shí)后將siRNA干涉文庫中同一個(gè)基因的兩個(gè)質(zhì)粒混合后利用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染；每個(gè)基因轉(zhuǎn)染3個(gè)復(fù)孔；第3丄3轉(zhuǎn)染48小時(shí)后在450nm下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行WST-1檢測(cè)；WST-1是一種類似于MTT的化合物，在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成橙黃色的formazan細(xì)胞，增殖越多越快，則顏色越深；細(xì)胞增殖越慢，則顏色越淺；第3丄4取第4個(gè)小時(shí)的各基因數(shù)據(jù)進(jìn)行雙側(cè)t檢驗(yàn)，根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果選出變化顯著的基因，T值>1.645或者T值<一1.645;并計(jì)算同轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒數(shù)據(jù)的比率；經(jīng)對(duì)50個(gè)未知功能基因均進(jìn)行了掃描，實(shí)驗(yàn)顯示CA^Si3，NMJ73515;HomosapiensCNKSRfamilymember3(CiV^Si3)，T值=8.051663>1.645，能夠影響HeLa細(xì)胞的增殖能力，沉默CA^5ij基因能夠促進(jìn)HeLa細(xì)胞的增殖，增殖比率=19%±2.82%;第4、CA^SiJ基因的克隆按照Trizol使用說明書，從HEK293T細(xì)胞中提取TotalRNA;利用GV《Si3引物正義鏈5'-atggaacccgtgaccaagtggagcccca-3，；反義鏈5'-gtgagtcaacagtttgaggcgcgta-3，；通過Itwitrogen公司提供的RT-PCR試劑盒，按照該公司提供的實(shí)驗(yàn)步驟擴(kuò)增CA^Si^基因，通過Invitrogen膠提取試劑盒提取擴(kuò)增的CMCS73基因片段；然后通過Invitrogen公司提供的pcDNAuHis/V5ToPo載體，根據(jù)該公司提供的實(shí)驗(yàn)步驟將CA^Si3基因克隆到pcDNAuHis/V5TOPO載體，最后，通過測(cè)序確定RGS1序列克隆了CASi基因，并將其連入pcDNA3.1V5表達(dá)載體中；第5、對(duì)篩選的細(xì)胞增殖相關(guān)基因CA^Si3基因功能進(jìn)一步鑒定第5.1、GFP細(xì)胞比例改變程度分析CA^Si3基因?qū)?xì)胞增殖能力的影響基因?qū)?xì)胞增殖存在影響，轉(zhuǎn)染了成功的細(xì)胞與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞、以及轉(zhuǎn)染了空白對(duì)照載體的細(xì)胞相比，增殖能力存在差異，培養(yǎng)一段時(shí)間之后會(huì)造成轉(zhuǎn)染的陽性細(xì)胞比率的改變；第5.2、WST-1檢測(cè)aV《Si3基因?qū)?xì)胞增殖功能的影響將pcDNA3.1-C7^:Si3,pNKRY-^C7V^9i^以及他們的對(duì)照質(zhì)粒pcDNA3.1，pNKRY-GFP轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，并通過WST-1方法檢測(cè)CA^SW基因?qū)ζ湓鲋彻δ艿挠绊懀坏?.3、細(xì)胞計(jì)數(shù)分析CA^Si3基因?qū)?xì)胞增殖能力的影響WST-1檢測(cè)細(xì)胞增殖完成之后，我們又將各組的細(xì)胞用胰酶消化下來，臺(tái)盼蘭染色之后，計(jì)數(shù)各組的細(xì)胞，分析CiV^S73基因?qū)?xì)胞增殖能力的影響；第5*4、BrdU滲入檢測(cè)GV《Si^基因?qū)?xì)胞增殖能力的影響B(tài)rdU是一種核苷類似物能夠特異性地滲入進(jìn)入S期的細(xì)胞，因此在新增殖的細(xì)胞合成的DNA中會(huì)滲入BrdU，用PE標(biāo)記的抗BrdU特異性的抗體，就能夠標(biāo)記出新增殖的細(xì)胞，利用FACS分析細(xì)胞的增殖能力；在轉(zhuǎn)染了各組質(zhì)粒細(xì)胞的培養(yǎng)液中加入BrdU，培養(yǎng)48小時(shí)之后，按照BrdUFlowKits提供的說明書進(jìn)行染色，然后FACS分析各組細(xì)胞的情況。3、如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于該方法將應(yīng)用于大規(guī)模功能基因的篩選及功能基因的研究。4、權(quán)利要求1所述的細(xì)胞增殖相關(guān)基因CNKSR3的應(yīng)用，該基因用于抗腫瘤藥物以及影響細(xì)胞增殖藥物的制備中。全文摘要一種細(xì)胞增殖相關(guān)基因CNKSR3與篩選方法及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的細(xì)胞增殖相關(guān)基因CNKSR3，其核苷酸序列如序列表所示。本發(fā)明通過構(gòu)建特異性的siRNA表達(dá)載體，組建siRNA干涉文庫，在人宮頸癌細(xì)胞株HeLa細(xì)胞中進(jìn)行高通量WST-1細(xì)胞增殖能力掃描，發(fā)現(xiàn)沉默CNKSR3基因?qū)?xì)胞增殖功能具有促進(jìn)作用。在隨后的研究中，當(dāng)CNKSR3基因或靶向該基因的siRNA轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞系，眾多的分析結(jié)果都顯示過量表達(dá)CNKSR3基因會(huì)抑制細(xì)胞的增殖(附圖1A1，A2，B1，B2)，而沉默該基因的表達(dá)則促進(jìn)細(xì)胞的增殖(附圖1C1，C2，D1，D2)，說明該基因在細(xì)胞的增殖過程中具有重要的作用。該基因基因在細(xì)胞增殖與分化、腫瘤治療以及抗腫瘤藥物的研發(fā)等方面有著巨大的潛在應(yīng)用價(jià)值。文檔編號(hào)A61P35/00GK101348788SQ200810054129公開日2009年1月21日申請(qǐng)日期2008年8月15日優(yōu)先權(quán)日2008年8月15日發(fā)明者彬曾,楊榮存申請(qǐng)人:南開大學(xué)