本發(fā)明涉及一種提高吡咯喹啉醌產(chǎn)量的方法，屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：吡咯喹啉醌(Pyrroloquinolinequinone，PQQ)，化學(xué)名稱為4，5-二氫-4，5-二氧化-1-氫吡咯(2，3f)醌-2，7，9一三羧酸，別名Methaxatin，是1979年由Salisbury等人發(fā)現(xiàn)的，最初描述是在細(xì)菌細(xì)胞中作為膜結(jié)合脫氫酶的氧化還原輔因子。目前，在許多不同生物體內(nèi)都發(fā)現(xiàn)存在PQQ，它可以防止活細(xì)胞被體內(nèi)或體外的氧損傷；還可作為營養(yǎng)因子和維生素促進(jìn)細(xì)胞生長和提高細(xì)菌在極端條件下的耐受性；哺乳動物細(xì)胞分化中誘導(dǎo)蛋白激酶的產(chǎn)生；通過增加不溶性磷酸鹽的可利用性和作為生物防治劑來提高作物生產(chǎn)力；利用氧化還原特性應(yīng)用于生物傳感器；眾多發(fā)現(xiàn)已經(jīng)將PQQ具有異常高的氧化還原循環(huán)能力和它在抗神經(jīng)細(xì)胞衰老、抗癌、藥劑、作為信號分子等方面的潛力關(guān)聯(lián)起來，其應(yīng)用一旦成功，PQQ將發(fā)揮不可替代的重要作用。總之，吡咯喹啉醌有多種功能，作為營養(yǎng)因子或維生素參與多種生命活動，在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、輕工業(yè)和食品業(yè)等方面具有重要的開發(fā)價值。目前，化學(xué)法生產(chǎn)PQQ步驟繁雜、產(chǎn)率低、副產(chǎn)物多、提取純化步驟多，并用到有毒化學(xué)試劑，污染嚴(yán)重且后續(xù)處理困難。微生物發(fā)酵法具有降低生產(chǎn)成本，清潔低碳、溫和可控等優(yōu)勢；同時發(fā)酵法一般以甲醇為唯一碳源，培養(yǎng)基以無機(jī)鹽為主，這有利于產(chǎn)品的提取。迄今發(fā)現(xiàn)的能過量產(chǎn)生PQQ的野生菌包括：無色桿菌屬、交替單胞菌屬、彎桿菌屬、生、甲烷單胞菌屬、甲基菌屬、甲基單胞菌屬、嗜甲基菌屬、甲基桿菌屬、微環(huán)菌屬、枝動菌屬、假單胞菌屬、精朊桿菌屬、原單胞菌屬、硫桿菌、黃色桿菌屬，以及粘球菌屬和副球菌屬等。目前的微生物產(chǎn)吡咯喹啉醌的研究，主要集中在高產(chǎn)野生菌的篩選、基因工程菌的構(gòu)建等方面，而少有對產(chǎn)吡咯喹啉醌營養(yǎng)因子的研究。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了克服上述問題，本發(fā)明提供了一種提高吡咯喹啉醌產(chǎn)量的方法，通過控制培養(yǎng)基中特定氨基酸含量以及維生素含量，有效地提高了吡咯喹啉醌的產(chǎn)量。在一種實(shí)施方式中，所述方法包括控制培養(yǎng)基中纈氨酸含量為150～200mg/L。在一種實(shí)施方式中，所述方法還包括控制培養(yǎng)基中維生素B2含量為4～8mg/L。在一種實(shí)施方式中，所述培養(yǎng)基中還含有氮源1～5g/L，硫酸鎂0.3～2.4g/L，磷酸二氫鉀1.4～2.8g/L，磷酸氫二鈉3～6g/L，氯化錳5～10mg/L，葉酸0.05～0.5mg/L，甲醇7～50g/L；初始pH6.5～7.2。在一種實(shí)施方式中，所述氮源可以是氯化銨、硫酸銨、硝酸銨、硝酸鉀。在一種實(shí)施方式中，所述培養(yǎng)基具體是：硫酸銨3g/L，硫酸鎂0.8g/L，磷酸二氫鉀2g/L，磷酸氫二鈉4g/L，氯化錳6mg/L，葉酸0.25mg/L，甲醇9g/L，纈氨酸175mg/L，維生素B2含量為6mg/L；初始pH7.0。在一種實(shí)施方式中，所述方法是以淺綠黃假單胞菌(Pseudomonasviridiflava)為發(fā)酵菌株進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)。在一種實(shí)施方式中，所述淺綠黃假單胞菌可以是以下任意一種：CGMCC1.3319、CGMCC1.3198、CGMCC1.3118。在一種實(shí)施方式中，所述發(fā)酵生產(chǎn)是在35℃、200rpm下發(fā)酵生產(chǎn)72h。本發(fā)明還要求保護(hù)按照上述方法發(fā)酵生產(chǎn)得到的吡咯喹啉醌及其在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、輕工業(yè)和食品業(yè)方面的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明通過對淺綠黃假單胞菌產(chǎn)吡咯喹啉醌的營養(yǎng)因子進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)通過控制培養(yǎng)基中特定氨基酸含量以及維生素含量，能夠有效地提高吡咯喹啉醌的產(chǎn)量。采用本發(fā)明的方法，能夠使菌株產(chǎn)吡咯喹啉醌產(chǎn)量提高15％～89％。此外，本發(fā)明方法簡便、易控，適合工業(yè)化應(yīng)用。具體實(shí)施方式吡咯喹啉醌的純化與提取：純化儀器如AKTAavant蛋白純化儀，將發(fā)酵上清液膜慮后以1mL/min流速經(jīng)過DEAE陰離子交換柱，接著用2～5倍柱體積的檸檬酸鈉緩沖液(pH5.5)洗滌平衡，再以含有l(wèi)MNaCl的檸檬酸鈉緩沖液(pH5.5)進(jìn)行梯度洗脫，洗脫體積為10～20CV，得到初步純化后的呈紅色的PQQ產(chǎn)物。吡咯喹啉醌分析方法：(1)NBT－Gly化學(xué)法：見《3種檢測吡咯喹啉醌的方法比較》(生物技術(shù)通訊,2011,22(4):544-547.)。(2)HPLC分析：流動相為12.5mM磷酸二氫鉀溶液：甲醇＝85：15(v/v)；進(jìn)樣量10～20μL；流速0.8～1.2mL/min；檢測波長254nm；柱溫30℃；檢測器為DAD；色譜柱為WatersSunFireTMC18反向柱(5μm，4.6mm×250mm)。(3)紫外吸收光譜分析：利用紫外-可見光分光光度計(jì)，對PQQ標(biāo)準(zhǔn)品和純化后的PQQ溶液直接進(jìn)行220-400nm的波長掃描，測定二者的紫外吸收光譜是否一致。實(shí)施例1將淺綠黃假單胞菌CGMCC1.3198、CGMCC1.3118，分別活化后，分別接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)PQQ，其中發(fā)酵的條件是：在35℃、200rpm下發(fā)酵72h。發(fā)酵結(jié)束后測定上清液中PQQ含量。發(fā)酵培養(yǎng)基中含有：硫酸銨3g/L，硫酸鎂0.8g/L，磷酸二氫鉀2g/L，磷酸氫二鈉4g/L，氯化錳6mg/L，葉酸0.25mg/L，甲醇9g/L，纈氨酸含量為150mg/L，維生素B2含量為8mg/L；初始pH7.0。結(jié)果顯示，CGMCC1.3198、CGMCC1.3118的發(fā)酵上清中PQQ含量分別為30.96mg/L、20.25mg/L，比以不添加纈氨酸和維生素B2的發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)得到的PQQ含量分別提高了72％、35％。實(shí)施例2將淺綠黃假單胞菌CGMCC1.3198、CGMCC1.3118，分別活化后，分別接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)PQQ，其中發(fā)酵的條件是：在35℃、200rpm下發(fā)酵72h。發(fā)酵結(jié)束后測定上清液中PQQ含量。發(fā)酵培養(yǎng)基中含有：硫酸銨3g/L，硫酸鎂0.8g/L，磷酸二氫鉀2g/L，磷酸氫二鈉4g/L，氯化錳6mg/L，葉酸0.25mg/L，甲醇9g/L，纈氨酸含量為200mg/L，維生素B2含量為4mg/L；初始pH7.0。結(jié)果顯示，CGMCC1.3198、CGMCC1.3118的發(fā)酵上清中PQQ含量分別為32.04mg/L、19.80mg/L，比以不添加纈氨酸和維生素B2的發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)得到的PQQ含量分別提高了78％、32％。實(shí)施例3將3株淺綠黃假單胞菌CGMCC1.3319、CGMCC1.3198、CGMCC1.3118，分別活化后，分別接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)PQQ，其中發(fā)酵的條件是：在35℃、200rpm下發(fā)酵72h。發(fā)酵結(jié)束后測定上清液中PQQ含量。基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中含有：硫酸銨3g/L，硫酸鎂0.8g/L，磷酸二氫鉀2g/L，磷酸氫二鈉4g/L，氯化錳6mg/L，葉酸0.25mg/L，甲醇9g/L；初始pH7.0。實(shí)驗(yàn)組是在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上額外添加一定終濃度的氨基酸和/或維生素：A組：不添加；B組：175mg/L纈氨酸；C組：6mg/L維生素B2；D組：175mg/L纈氨酸、6mg/L維生素B2；E組：100mg/L纈氨酸；F組：250mg/L纈氨酸；G組：175mg/L蘇氨酸；H組：6mg/L維生素B1；I組：2mg/L維生素B2。表1不同培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)對PQQ產(chǎn)量的影響CGMCC1.3319CGMCC1.3198CGMCC1.3118A組21mg/L18mg/L15mg/LB組12.9％8.3％7.2％C組5％12.8％9.8％D組15％89％45％E組9.4％8.1％6.5％F組13.1％8.2％7.0％G組4.3％2.9％7.1％H組6.2％3.3％10.8％I組8.0％10.8％6.7％注：B組～G組數(shù)據(jù)，為相應(yīng)菌株相對于A組的PQQ產(chǎn)量提高的質(zhì)量百分比。由表1數(shù)據(jù)可知，纈氨酸和維生素B2組合使用能夠有效提高淺綠黃假單胞菌發(fā)酵生產(chǎn)PQQ的產(chǎn)量，而且對CGMCC1.3198的提高作用要明顯強(qiáng)于其他兩株菌。雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。當(dāng)前第1頁1 2 3