本發明涉及L-色氨酸生產領域，尤其是一種清液發酵培養基及提高L-色氨酸產量的方法。

背景技術：

L-色氨酸是人體和動物生命活動中必需的氨基酸之一，對人和動物的生長發育、新陳代謝起著重要的作用，由于其不可替代的生理作用，而被譽為第二必需氨基酸。近年來，由于L-色氨酸商業價值得到越來越多的認可，已廣泛應用于醫藥、食品和飼料等方面,逐漸成為國際市場上發展前景良好、中國市場需求較大的產品。尤其是從二十世紀初開始，這種需求呈現年穩定增長的態勢，統計顯示：2003年全球L-色氨酸需求量為1180噸，2011年為5600噸，年均復合增長率為21.5％。2003年國內L-色氨酸的總使用量大約為300噸，2011年國內需求總量約為1200噸，年均復合增長率在18.9％。2014年全球L-色氨酸需求量為20000噸，年均復合增長率為53.85％；2015年國內L-色氨酸的總使用量大約為6000噸，同比增長9.1％。L-色氨酸雖已實現工業化生產，但目前產量仍不能滿足需要。因此，進一步優化L-色氨酸的生產工藝具有重要意義。與國外先進水平相比，我國L-色氨酸生產存在發酵產酸低、轉化率低且副產物多等問題。

目前，L-色氨酸的生產方法主要有：蛋白質水解法、化學合成法、發酵法及酶法。早期主要依靠蛋白質水解法和化學合成法生產L-色氨酸，蛋白質水解法對生產設備要求簡單，成本低，但存在污染嚴重、產品得率低、雜質較多等缺點。化學合成法受到原料來源的限制，并且合成步驟復雜，除需考慮合成工藝條件外，還要考慮異構體的拆分與D-色氨酸異構體的消旋作用，不利于工業化生產。隨著科學技術的不斷進步，微生物法生產L-色氨酸已經走向實用并且處于主導地位。微生物法大體上可以分為酶法、微生物轉化法和直接發酵法。酶法利用微生物中色氨酸生物合成酶系的催化功能生產色氨酸，包括色氨酸酶、色氨酸合成酶、絲氨酸消旋酶等；該法既可以直接加入細胞壁溶解酶使細胞破壁后再使用，也可以將所需的酶固定化后再使用，一般由菌體的培養、菌體的分離洗滌、固定化和反應幾個階段組成；微生物轉化法使用葡萄糖作為碳源，同時添加合成色氨酸所需的前體物如鄰氨基苯甲酸、吲哚等，利用微生物的色氨酸合成酶系來合成色氨酸；直接發酵法以葡萄糖、甘蔗糖蜜等廉價原料為碳源，利用優良的色氨酸生產菌種來生產色氨酸。隨著重組DNA技術在微生物育種中的應用，為優良的色氨酸生產菌株的篩選和產酸水平的提高提供了可靠的技術保障，使微生物直接發酵法生產L-色氨酸成為一種主流的工業化生產方法。

目前，L-色氨酸發酵產酸及轉化率仍處于較低水平。原因之一是在發酵前期底物葡萄糖同時用于合成L-色氨酸和菌體。細胞生長和L-色氨酸合成之間存在著對碳源和能源的競爭，過高的生物量必然會導致糖酸轉化率下降。原因之二是在發酵后期由于細胞比生長速率下降，細胞合成乙酸等副產物，抑制L-色氨酸的合成。原因之三是在發酵中后期，菌體酶活下降較快，導致后期產酸速率下降。

酵母粉成分復雜且存在不穩定因素，導致發酵過程中存在產酸波動及一些不穩定營養成分的抑制現象。此外，酵母粉中含色素等雜質，在后期提取過程中難以去除，直接影響產品質量。以各類氨基酸及核苷對酵母粉進行替代發酵，不穩定營養成分大幅減少，使發酵液趨于穩定，產量波動降低。

技術實現要素：

本發明所要解決的技術問題在于提供一種清液發酵培養基。

本發明所要解決的另一技術問題在于提供一種應用上述清液發酵培養基來提高L-色氨酸產量的方法。

為解決上述技術問題，本發明的技術方案是：

一種清液發酵培養基，組分如下：葡萄糖10g/L，(NH₄)₂SO₄ 1-5g/L，肌苷0.1-1g/L，鳥苷0.1-1g/L，腺苷0.01-1g/L，甘氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、胱氨酸、纈氨酸、亮氨酸和絲氨酸各0.1-1g/L，異亮氨酸、蘇氨酸、丙氨酸和苯丙氨酸各0.2-2g/L，谷氨酸和賴氨酸各0.5-2g/L，檸檬酸0.1-2g/L，KH₂PO₄·3H₂O 4-8g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5-3g/L，FeSO₄·7H₂O 1-50mg/L，V_B1 1-10mg/L，V_B3 1-5mg/L，V_B5 1-5mg/L，微量元素溶液0.5-2mL/L，生物素1-10mg/L，氯化膽堿0.1-2g/L，其中，所述微量元素溶液為含有4.5g/L MnSO₄·H₂O、6.4g/L ZnSO₄、4.9g/L Co(NO₃)₂·6H₂O、0.6g/L CuSO₄·5H₂O的混合溶液；pH至7.0。

上述清液發酵培養基用NaOH溶液和/或稀鹽酸調pH至7.0，滅菌條件：0.1MPa濕熱滅菌20min。

一種提高L-色氨酸產量的方法，采用色氨酸生產菌經上述清液發酵培養基發酵獲得L-色氨酸。

優選的，上述提高L-色氨酸產量的方法，將大腸桿菌按接種量為10％接入上述清液發酵培養基發酵獲得L-色氨酸。

優選的，上述提高L-色氨酸產量的方法，具體步驟為：在37℃、pH為7.0和溶氧為20％-30％條件下，按10％的接種量接入含有清液發酵培養基的30L自動控制發酵罐中,于自動控制發酵罐中培養至對數中后期，通入適當空氣，調節適當攪拌轉速，控制溶氧為30-50％，通過自動流加25％的氨水控制pH在6.7-7.0，通過流加適量泡敵消泡，并通過流加濃度為800g/L的葡萄糖溶液將殘糖控制在15％左右，發酵38h結束，即得。

優選的，上述提高L-色氨酸產量的方法，在所述清液發酵培養基中額外隨糖流加2g/L氯化膽堿，10g/L KH₂PO₄·3H₂O，2g/L精氨酸，2g/L賴氨酸。

優選的，上述提高L-色氨酸產量的方法，在所述清液發酵培養基中額外隨糖流加2g/L檸檬酸，5g/L KH₂PO₄·3H₂O，2g/L精氨酸，2g/L賴氨酸。

優選的，上述提高L-色氨酸產量的方法，所述色氨酸生產菌為保藏編號CGMCC NO.11073的大腸桿菌菌種。

本發明結構有如下有益效果：

上述提高L-色氨酸產量的方法，具有如下技術效果：

氨基酸及核苷不含色素等成分，為后續提取工藝及產品色澤及質量提供優勢。基于該原理，本技術通過去除發酵培養基中酵母粉，添加各類氨基酸及核苷來提高L-色氨酸發酵產率。

以各類氨基酸及核苷對酵母粉進行替代發酵，不穩定營養成分大幅減少，使發酵液趨于穩定，產量波動降低。而且氨基酸及核苷不含色素等成分，為后續提取工藝及產品色澤及質量提供優勢。基于該原理，本技術通過去除發酵培養基中酵母粉，添加各類氨基酸及核苷來提高L-色氨酸發酵產率及產酸穩定性。

此方法在不增加額外設備和的情況下，實現了整個發酵周期的穩定性和L-色氨酸產量的提高，及后期提取工藝的簡化，適合于工業化生產。

本發明以各類氨基酸及核苷對酵母粉進行替代發酵，不穩定營養成分大幅減少，使發酵液趨于穩定，產量波動降低。而且氨基酸及核苷不含色素等成分，為后續提取工藝及產品色澤及質量提供優勢。基于該原理，本技術通過去除發酵培養基中酵母粉，添加各類氨基酸及核苷達到提高L-色氨酸發酵穩定產率的目的。

保藏信息

分類名詞：大腸埃希氏菌Escherichia coli

保藏單位名稱：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心

保藏單位地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號

保藏日期：2015年7月14日

保藏號：CGMCC NO.11073

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明所述技術方案作進一步的說明。

實施例1

一種清液發酵培養基，組分如下：

葡萄糖10g/L(分消，0.075MPa濕熱滅菌15min)，(NH₄)₂SO₄ 1.8g/L，肌苷0.1g/L，鳥苷0.1g/L，腺苷0.1g/L，甘氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、胱氨酸、纈氨酸、亮氨酸、絲氨酸各0.1g/L，異亮氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸各0.2g/L，谷氨酸、賴氨酸各0.5g/L，檸檬酸2g/L，KH₂PO₄·3H₂O 7.5g/L，MgSO₄·7H₂O 1.5g/L，FeSO₄·7H₂O 6mg/L，V_B1 5mg/L，V_B3 2mg/L，V_B5 2mg/L，微量元素溶液1.2mL/L，生物素3mg/L，氯化膽堿0.5g/L，其中，所述微量元素溶液為含有4.5g/L MnSO₄·H₂O、6.4g/L ZnSO₄、4.9g/L Co(NO₃)₂·6H₂O、0.6g/L CuSO₄·5H₂O的混合溶液。

上述清液發酵培養基中各組分按組方量混合后用NaOH溶液和/或稀鹽酸調pH至7.0，0.1MPa濕熱滅菌20min，即得。

實施例2

一種清液發酵培養基，組分如下：

葡萄糖10g/L，(NH₄)₂SO₄ 1g/L，肌苷0.1g/L，鳥苷0.1g/L，腺苷0.01g/L，甘氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、胱氨酸、纈氨酸、亮氨酸和絲氨酸各1g/L，異亮氨酸、蘇氨酸、丙氨酸和苯丙氨酸各2g/L，谷氨酸和賴氨酸各2g/L，檸檬酸0.1g/L，KH₂PO₄·3H₂O 4g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，FeSO₄·7H₂O 1mg/L，V_B1 1mg/L，V_B3 1mg/L，V_B5 1mg/L，微量元素溶液0.5mL/L，生物素1mg/L，氯化膽堿0.1g/L，其中，所述微量元素溶液為含有4.5g/L MnSO₄·H₂O、6.4g/L ZnSO₄、4.9g/L Co(NO₃)₂·6H₂O、0.6g/L CuSO₄·5H₂O的混合溶液。

上述清液發酵培養基中各組分按組方量混合后用NaOH溶液和/或稀鹽酸調pH至7.0，0.1MPa濕熱滅菌20min，即得。

實施例3

一種清液發酵培養基，組分如下：

葡萄糖10g/L，(NH₄)₂SO₄ 5g/L，肌苷1g/L，鳥苷1g/L，腺苷1g/L，甘氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、胱氨酸、纈氨酸、亮氨酸和絲氨酸各0.1g/L，異亮氨酸、蘇氨酸、丙氨酸和苯丙氨酸各0.2g/L，谷氨酸和賴氨酸各0.5g/L，檸檬酸2g/L，KH₂PO₄·3H₂O 8g/L，MgSO₄·7H₂O 3g/L，FeSO₄·7H₂O 50mg/L，V_B1 10mg/L，V_B3 5mg/L，V_B5 5mg/L，微量元素溶液2mL/L，生物素10mg/L，氯化膽堿2g/L，其中，所述微量元素溶液為含有4.5g/L MnSO₄·H₂O、6.4g/L ZnSO₄、4.9g/L Co(NO₃)₂·6H₂O、0.6g/L CuSO₄·5H₂O的混合溶液。

上述清液發酵培養基中各組分按組方量混合后用NaOH溶液和/或稀鹽酸調pH至7.0，0.1MPa濕熱滅菌20min，即得。

實施例4

一種清液發酵培養基，組分如下：

葡萄糖10g/L，(NH₄)₂SO₄ 3g/L，肌苷0.5g/L，鳥苷0.5g/L，腺苷0.5g/L，甘氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、胱氨酸、纈氨酸、亮氨酸和絲氨酸各0.5g/L，異亮氨酸、蘇氨酸、丙氨酸和苯丙氨酸各1g/L，谷氨酸和賴氨酸各1.5g/L，檸檬酸1g/L，KH₂PO₄·3H₂O 6g/L，MgSO₄·7H₂O 2g/L，FeSO₄·7H₂O 10mg/L，V_B1 3mg/L，V_B3 2mg/L，V_B54mg/L，微量元素溶液1mL/L，生物素5mg/L，氯化膽堿1g/L，其中，所述微量元素溶液為含有4.5g/L MnSO₄·H₂O、6.4g/L ZnSO₄、4.9g/L Co(NO₃)₂·6H₂O、0.6g/L CuSO₄·5H₂O的混合溶液。

上述清液發酵培養基中各組分按組方量混合后用NaOH溶液和/或稀鹽酸調pH至7.0，0.1MPa濕熱滅菌20min，即得。

實施例5

一種提高L-色氨酸產量的方法，具體步驟如下：

采用的大腸埃希氏菌(保藏于中國普通微生物菌種保藏中心，保藏編號：CGMCC NO.11073)；培養基為清液發酵培養基[葡萄糖10g/L(分消，0.075MPa濕熱滅菌15min)，(NH₄)₂SO₄ 1.8g/L，肌苷0.1g/L，鳥苷0.1g/L，腺苷0.1g/L，甘氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、胱氨酸、纈氨酸、亮氨酸、絲氨酸各0.1g/L，異亮氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸各0.2g/L，谷氨酸、賴氨酸各0.5g/L，檸檬酸2g/L，KH₂PO₄·3H₂O 7.5g/L，MgSO₄·7H₂O 1.5g/L，FeSO₄·7H₂O 6mg/L，V_B1 5mg/L，V_B3 2mg/L，V_B5 2mg/L，微量元素1.2mL/L(微量元素為含有4.5g/L MnSO₄·H₂O、6.4g/L ZnSO₄、4.9g/L Co(NO₃)₂·6H₂O、0.6g/L CuSO₄·5H₂O的混合溶液)，生物素3mg/L，氯化膽堿0.5g/L，用NaOH和鹽酸調pH至7.0。滅菌條件：0.1MPa濕熱滅菌20min]；培養方法：將菌種接入種子培養基[葡萄糖40g/L，(NH₄)₂SO₄ 3g/L，肌苷0.1g/L，鳥苷0.1g/L，腺苷0.1g/L，甘氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、胱氨酸、纈氨酸、亮氨酸、絲氨酸各0.1g/L，異亮氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸各0.2g/L，谷氨酸、賴氨酸各0.5g/L，檸檬酸2g/L，KH₂PO₄ 6g/L，MgSO₄·7H₂O 1.6g/L，FeSO₄·7H₂O 10mg/L，V_B1 5mg/L，V_B3 2mg/L，V_B5 2mg/L，微量元素1mL/L，生物素2mg/L]，接種量為10％；在37℃、pH為7.0和溶氧為20％-30％條件下于5L自動控制發酵罐中培養12h至對數中后期，按10％的接種量接入含有上述清液發酵培養基的30L自動控制發酵罐中,通入適當空氣，調節適當攪拌轉速，控制溶氧為30-50％，通過自動流加25％的氨水控制pH在6.7-7.0，通過流加適量泡敵消泡劑消泡，并通過流加濃度為800g/L的葡萄糖溶液將殘糖控制在15％左右，發酵38h結束；進行兩批平行實驗。放罐時，L-色氨酸的產量分別為38.6g/L、38.2g/L，分別比對照實驗(兩批實驗)(L-色氨酸產量分別為34.2g/L、35.5g/L)提高了12.86％和7.61％，產酸穩定性較高，產量波動小。

實施例6

采用的菌株為大腸桿菌；培養基為清液發酵培養基(同實施例5)中隨糖流加2g/L氯化膽堿，10g/L KH₂PO₄·3H₂O，2g/L精氨酸，2g/L賴氨酸；培養方法同實施例5。進行兩批平行實驗。放罐時，L-色氨酸的產量分別為40.6g/L、41.0g/L，分別比對照實驗(兩批實驗)(L-色氨酸產量分別為34.2g/L、35.5g/L)提高了18.71％和15.49％，產酸穩定性較高，產量波動小。

實施例7

采用的菌株為大腸桿菌；培養基為清液發酵培養基(同實施例5)中隨糖流加2g/L檸檬酸，5g/LKH₂PO₄·3H₂O，2g/L精氨酸，2g/L賴氨酸；培養方法同實施例5。進行兩批平行實驗。放罐時，L-色氨酸的產量分別為41.6g/L、41.9g/L，分別比對照實驗(兩批實驗)(L-色氨酸產量分別為34.2g/L、35.5g/L)提高了21.64％和18.03％，產酸穩定性較高，產量波動小。

可見，通過去除現有培養基中的酵母粉，并在培養基中添加特定的氨基酸及核苷達到替代作用，使其在培養基中的濃度為0.1-0.5g/L，并在發酵中后期流加營養物質，最終獲得高產量的L-色氨酸，其中，

所述各類氨基酸包括：甘氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、胱氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸和賴氨酸；

所述各類核苷包括：鳥苷、肌苷、腺苷；

所述流加營養物質包括：檸檬酸、KH₂PO₄·3H₂O、精氨酸、賴氨酸。

以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。