本發明涉及環境微生物領域，尤其是涉及一株具有溶藻活性的赤潮藻裂解細菌YWL1及其應用。

背景技術：

在海洋和淡水水體中，由于富營養化程度的加劇，藻類過量繁殖形成赤潮和水華，從而影響和改變水體的理化性質，并且能直接或間接引起食藻動物的大量死亡。傳統的治理方法如機械除藻，高頻電磁脈沖以及利用除草劑等方法，常受到成本和環境安全性問題等諸多因素的限制。相比之下，生物控藻技術成本低、安全性好，其中溶藻細菌因其較高的除藻性能，成為防治赤潮和水華的一個新方向。

所謂溶藻細菌（algae-lysing bacteria），是一類以直接或間接方式抑制藻類生長、或殺死藻類、溶解藻細胞的細菌的統稱。1924年，Ceitler報道一種黏細菌Polyangium parasitium寄生在剛毛藻（Cladophora）上，使其死亡。國內外文獻中報道的溶藻細菌有：黏細菌、噬胞菌屬、弧菌、腐生螺旋體屬、假單胞菌、鞘氨醇單胞菌屬、交替單胞菌、交替假單胞菌等。溶藻細菌的作用方式一般分為兩種：①直接溶藻，即直接進攻宿主，它需要細菌與溶藻細胞直接接觸，甚至侵入藻細胞內；②間接溶藻，即間接進攻宿主，主要包括細菌同藻競爭有限營養或細菌分泌胞外物質溶藻。

作為水生生態系統中生物種群結構和功能的一個重要組成部分，溶藻細菌對赤潮和水華的控制、維持藻類生物量的平衡具有非常重要的作用，它們對浮游植物的溶解作用也可能是調節水生生態系統中初級生產力的一個重要因素。赤潮和水華的突然消亡可能與溶藻細菌的感染有關。溶藻細菌作為赤潮和水華防治的生物，能夠作為一種高效溶藻微生物控制甚至殺死藻細胞，恢復生態平衡，具有巨大的開發價值。

溶藻菌對藻的抑制和溶藻作用具有宿主特異性，針對我國海域特有赤潮藻株分離溶藻菌具有重要的現實和科學意義。中肋骨條藻Skeletonema costatum是在全球近岸海域分布極廣的廣溫廣鹽性的浮游硅藻，是我國赤潮的優勢種，在黃、東、南海均有該種赤潮記錄。中肋骨條藻SCXMBO2株和SKSPXS0711株分別是中國東海寧波海域和廈門海域赤潮優勢藻。迄今，尚無有關此兩株藻的溶藻菌的分離及應用的報道。產毒圓海鏈藻（Thalassiosira rotula）和塔瑪亞歷山大藻（Alexandrium tamarense）是廣泛存在于海洋中的產毒藻，亦是我國沿海重要的赤潮原因藻。獲得能夠同時裂解赤潮原因藻中肋骨條藻、產毒圓海鏈藻和塔瑪亞歷山大藻的細菌，對于赤潮的生物防治非常重要。迄今，尚無能夠同時裂解這三種赤潮原因藻的細菌的報道。

技術實現要素：

本發明所要解決的技術問題是提供一株可安全、高效、快速、特異抑制海水中中肋骨條藻（SCXMBO2和SKSPXS0711）、產毒圓海鏈藻和塔瑪亞歷山大藻的赤潮藻裂解細菌YWL1及其應用，該裂解細菌使中肋骨條藻SCXMBO2藻葉綠素a濃度減少率達76.14%、使產毒圓海鏈藻和塔瑪亞歷山大藻藻液的OD680減少65.38%和57.25%。

本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為：一株赤潮藻裂解細菌，該細菌為YWL1株，分類命名為海桿菌（Marinobacter sp.），于2015 年5 月25 日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.10857。

該菌的生物學特征如下：該細菌為過氧化氫酶陽性，不可以利用蔗糖、麥芽糖、淀粉作為碳源，無運動性，菌體形態為棒狀，有鞭毛，無芽孢，菌落為淡黃色半透明，表面光滑濕潤，邊緣規則，無暈環，直徑約1 mm；該菌株在UV下處理30分鐘后死亡，其最高耐受溫度為40℃，最適生長條件為：pH=6.0-8.5，溫度20-40℃。

上述赤潮藻裂解細菌的應用，其對產毒圓海鏈藻（Thalassiosira rotula）、塔瑪亞歷山大藻（Alexandrium tamarense）和東海赤潮優勢藻中肋骨條藻SCXMBO2、SKSPXS0711具有強溶藻作用。

與現有技術相比，本發明的優點在于：本發明公開了一株赤潮藻裂解細菌及其應用，將其用于控制在特定環境下由于中肋骨條藻、圓海鏈藻或塔瑪亞歷山大藻爆發性增值或高度聚集而引起的赤潮，此裂解細菌可用于抑制中肋骨條藻(SCXMBO2、SKSPXS0711)、產毒圓海鏈藻（Thalassiosira rotula）和塔瑪亞歷山大藻（Alexandrium tamarense）的生長，并殺死這些赤潮藻。具有成本低，經濟效益高；對生態環境無破壞；培養大量赤潮藻裂解細菌YWL1株較為容易，操作簡單。權衡社會、經濟和環境效益等綜合因素，是一種新型的治理赤潮的技術，具有良好的發展前景。

綜上所述，本發明提供一株赤潮藻裂解菌YWL1及其應用，該YWL1可高效、快速降解海水中中肋骨條藻，產毒圓海鏈藻和塔瑪亞歷山大藻，該菌10天能使中肋骨條藻藻葉綠素a濃度減少76.14%；使產毒圓海鏈藻和塔瑪亞歷山大藻藻液的OD680減少率達65.38%和57.25%。

附圖說明

圖1為Marinobacter sp. YWL1負染圖；

圖2為UV以及不同pH、溫度對Marinobacter sp. YWL1的影響；

圖3為Marinobacter sp. YWL1最適儲存溫度圖；

圖4為中肋骨條藻SCXMBO2培養液。右為被YWL1感染10 d后的藻液；左為未添加YWL1的同期藻液；

圖5為顯微鏡下Marinobacter sp. YWL1對中肋骨條藻、產毒圓海鏈藻、塔瑪亞歷山大藻的溶藻作用。a：被YWL01感染的中肋骨條藻SKSPXS0711；b：未添加YWL1的中肋骨條藻SKSPXS0711；c：被YWL01感染的產毒圓海鏈藻；d：未添加YWL01的產毒圓海鏈藻；e：被YWL1感染的塔瑪亞歷山大藻；f：未添加YWL01的塔瑪亞歷山大藻；

圖6為Marinobacter sp. YWL1對中肋骨條藻SCXMBO2葉綠素a濃度的影響。

具體實施方式

以下結合附圖實施例對本發明作進一步詳細描述。

一、實驗方法

藻葉綠素a濃度測定方法

取5 mL 藻液，6000 g離心15 min后去上清，加入5 mL 體積分數為90%的乙醇水溶液或者體積分數為90%的丙酮水溶液，在4℃冰箱內避光放置。24 h后7000 g 離心10 min，上清液用分光光度計檢測在663nm和645 nm時的吸光度，用體積分數為90%的乙醇水溶液或者體積分數為90%的丙酮水溶液調零。藻葉綠素a濃度利用以下公式計算得到：

a=(12.7D₆₆₃-2.59D₆₄₅)*V/A

a 代表藻葉綠素a濃度，V為加入的體積分數為90%的乙醇水溶液或者體積分數為90%的丙酮水溶液體積，A為藻細胞重量(g)。藻細胞裂解，藻葉綠素a濃度下降。

二、具體實施例

實施例1

Marinobacter sp. YWL1的分離與鑒定

現場采集寧波赤潮高發海域表層海水。配制固體海水LB培養基，取上述水樣劃線分離細菌，得到多株純菌。將分離到的純菌分別接種于液體海水LB培養基中擴大培養，培養溫度為37℃。固體海水LB培養基的成分為：10 g/L胰化蛋白胨，5g/L酵母提取物，15g/L瓊脂，加人工海水至1L，調pH7.0，121℃高壓蒸汽滅菌30min。液體海水LB培養基配方則不加瓊脂。

擴大培養的純菌經5000 ×g離心20min得到細菌沉淀，用加30 mg/L硅酸鹽的f/2培養基清洗細菌三次，最后用等體積的含30 mg/L硅酸鹽的f/2培養基重懸細菌。菌懸液分別與指數生長期的中肋骨條藻NMBguh004-2共培養7天（菌液：藻液的體積比為1:4），培養溫度為20℃，光照強度2500 LX，光暗比(L/D)12 h:12 h，得到新鮮菌液。將含30 mg/L硅酸鹽的f/2培養基與處于指數生長期的中肋骨條藻SCXMBO2株藻液按菌液：藻液的體積比1:4混合后作為對照組。分別用肉眼、光學顯微鏡、藻葉綠素a濃度變化和電鏡觀察藻生長情況，判斷所分離的細菌是否具有裂解中肋骨條藻的能力，最后得到一株中肋骨條藻高效裂解菌YWL1，該菌16S rDNA與海桿菌HP15的16S rRNA基因序列的相似性最高，為97.63%，其基因序列如SEQ ID NO.1所示。 將其命名為海桿菌（Marinobacter sp.）YWL1，于2015 年5 月25 日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.10857，保藏單位地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號，郵編100101。

其中f/2培養基的成分為：硝酸鈉75 mg/L，磷酸二氫鈉 5mg/L，六水合三氯化鐵3.15 mg/L，EDTA - Na₂ 4.36 mg/L，五水硫酸銅10 mg/L，七水硫酸鋅22 mg/L，六水氯化鈷10 mg/L，四水氯化錳18 mg/L，二水鉬酸鈉6.3 mg/L，維生素B₁₂ 1 mg/L，維生素H 1 mg/L，維生素B₁ 200 mg /L，加人工海水至1L。

實施例2

用電子顯微鏡觀察Marinobacter sp. YWL1的形態

取實施例1所分離純化的YWL1菌液滴于銅網格上，以2wt%乙酸鈾酰溶液（W/V）進行負染，再置于電子顯微鏡（日立H-7650）下觀察中肋骨條藻裂解細菌的形態。結果如圖1所示，YWL1為棒狀（58 nm × 229 nm），有鞭毛，無芽孢。

實施例3

紫外線以及不同pH、溫度對Marinobacter sp. YWL1的影響

（1）紫外線UV對Marinobacter sp. YWL1穩定性的影響

取實施例1分離純化得到的YWL1新鮮菌液，經5000 ×g離心20min得到細菌沉淀，用含30 mg/L硅酸鹽的f/2培養基清洗細菌三次，最后用含30 mg/L硅酸鹽的f/2培養基重懸細菌。取上述菌懸液在UV（300 LX）下處理30分鐘。用實施例1中所述的對照組作為對照。在實驗組、對照組中分別取100μL菌液涂布于固體海水LB培養基中培養，培養條件同實施例1。24小時后，分別對實驗組和對照組的菌落數計數。

結果表明，如圖2所示，YWL1菌液在強UV下照射30分鐘，菌落數減少率為100%。說明細菌在強UV下照射30分鐘后，可使細菌死亡，然而，自然界紫外線正常情況下不會到達此強度。

（2）Marinobacter sp. YWL1的耐受溫度及最適儲存溫度的探究

取實施例1分離純化得到的含中肋骨條藻裂解細菌YWL1的新鮮菌液，經5000 ×g離心20min得到細菌沉淀，用含30 mg/L硅酸鹽的f/2培養基清洗細菌三次，最后用含30 mg/L硅酸鹽的f/2培養基重懸細菌。取上述菌懸液分別在40℃、45℃水浴鍋中處理30分鐘，在-80℃、-40℃、-20℃、4℃、20℃、37℃冰箱內放置7天。用實施例1中所述的對照組作為對照，實驗組和對照組均無需黑暗處理。在實驗組、對照組中分別取100μL菌液涂布于固體海水LB培養基中培養，培養條件同實施例1。24小時后，分別對實驗組和對照組的菌落數計數。

結果表明，如圖2所示，菌懸液分別至于40℃、45℃水浴鍋中處理30分鐘后，菌落數減少率分別為6.67%、98.89%。說明該細菌在40℃環境下其活性均較穩定，在45℃下無法正常生存。如圖3所示菌液分別在-80℃、-40℃、-20℃、4℃、20℃、37℃冰箱內放置7天后，菌落數減少率分別為97.44%、100%、100%、12.30%、14.87%、95.38%。說明該細菌的最適儲存溫度為4℃、20℃。

（3）不同pH對Marinobacter sp. YWL1穩定性的影響

取實施例1分離純化得到的含中肋骨條藻裂解細菌YWL1的新鮮菌液，經5000 ×g離心20min得到細菌沉淀，用含30 mg/L硅酸鹽的f/2培養基清洗細菌三次，最后用含30 mg/L硅酸鹽的f/2培養基重懸細菌。測菌液原始pH值并記錄，隨后用NaOH和HCl將菌液相應調制pH 4.5、pH 5、pH 6、pH 8.5、pH 10、pH 10.5并分別處理30分鐘作為實驗組，30分鐘后將實驗組菌液pH調回原始pH。用實施例1中所述的對照組作為對照，實驗組和對照組均無需黑暗處理。在實驗組、對照組中分別取100μL菌液涂布于固體海水LB培養基中培養，培養條件同實施例1。24小時后，分別對實驗組和對照組的菌落數計數。

結果表明，如圖2所示，菌懸液在pH 4.5、pH 5、pH 6、pH 8.5、pH 10、pH 10.5處理30 min后菌落減少率分別為98.89%、93.33%、11.67%、13.33%、95.56%、98.89%。說明該細菌無法在強酸強堿環境下生存，在pH 6、pH 8.5環境下其活性均較穩定。

實施例4

Marinobacter sp. YWL1溶藻范圍測試

選用19株海洋藻種（表1）進行溶藻細菌YWL1的溶藻范圍分析。取處于指數生長期的藻種按4:1的體積比分別與溶藻細菌YWL01共培養，培養條件同上述實施例1，設置三個平行組。對照組為不含細菌YWL01 的藻液。共培養第0、4、10 d均搖勻取樣，測藻液的OD₆₈₀值。同時，每天用照相機記錄實驗組和對照組藻液顏色變化情況以及光學顯微鏡下觀察藻細胞形態。14 d后，與對照組比較，若無明顯變化，則基本判定細菌YWL01無法感染該藻。該實驗重復三次進行。

結果，YWL1可以感染中肋骨條藻SCXMBO2、SKSPXS0711、產毒圓海鏈藻（Thalassiosira rotula）和塔瑪亞歷山大藻（Alexandrium tamarense）（表1）。感染后，與對照組相比，藻細胞裂解明顯，無完整的細胞結構，光合色素變少。感染期間，對照組藻液OD₆₈₀值一直處于上升狀態，實驗組藻液OD₆₈₀值雖然感染初期高于對照組（這是由于加入了菌懸液，導致實驗組藻OD₆₈₀初始值比對照組高），但是感染后期藻液OD₆₈₀值逐漸下降，最終均低于對照組。

如圖4所示，中肋骨條藻SCXMBO2培養液。右為被YWL1感染10 d后的藻液；左為未添加YWL1的同期藻液，被感染的藻液顏色明顯淡于同期對照藻液；如圖5所示，顯微鏡下Marinobacter sp. YWL1對中肋骨條藻、產毒圓海鏈藻、塔瑪亞歷山大藻的溶藻作用。a：被YWL01感染的中肋骨條藻SKSPXS0711；b：未添加YWL1的中肋骨條藻SKSPXS0711；c：被YWL01感染的產毒圓海鏈藻；d：未添加YWL01的產毒圓海鏈藻；e：被YWL1感染的塔瑪亞歷山大藻；f：未添加YWL01的塔瑪亞歷山大藻。圖4b、d、f分別顯示未感染YWL01的中肋骨條藻、產毒圓海鏈藻和塔瑪亞歷山大藻具有完整的、輪廓清晰的細胞形態；而圖4a、c、e分別顯示感染YWL01的中肋骨條藻、產毒圓海鏈藻和塔瑪亞歷山大藻的細胞裂解、破碎。

而其他15株赤潮藻無論從藻細胞形態還是從藻液OD₆₈₀值來看，均無溶藻現象。

表1藻種與溶藻結果

Tab. 3.1 Susceptibility of algealgal blooming

注：“+”為有溶藻現象， “-”為無溶藻現象。

實施例5

Marinobacter sp. YWL1的生化鑒定

（1）過氧化氫酶實驗

取1 ml新鮮培養的YWL1細菌菌液（實施例1提供），使用CAT可見光試劑盒（南京建成生物工程研究所）按說明提取過氧化氫酶。若提取到過氧化氫酶，則說明該菌可以利用過氧化氫，無則反之。結果表明，如表2說明所示該細菌存在過氧化氫酶，利用過氧化氫。

（2）淀粉酶實驗

取1 ml新鮮培養的YWL1細菌菌液（實施例1提供），使用二糖酶（淀粉酶）試劑盒（南京建成生物工程研究所）按說明提取淀粉酶。若提取到淀粉酶，則說明該菌可以利用淀粉，無則反之。結果表明，如表2所示，說明該細菌不存在淀粉酶，不可以利用淀粉。

（3）麥芽糖酶實驗

取1 ml新鮮培養的YWL1細菌菌液（實施例1提供），使用二糖酶(麥芽糖酶)試劑盒（南京建成生物工程研究所）按說明提取麥芽糖酶。若提取到麥芽糖酶，則說明該菌可以利用麥芽糖，無則反之。結果表明，如表2所示，說明該細菌不存在麥芽糖酶，不可以利用麥芽糖。

（4）蔗糖酶實驗

取1 ml新鮮培養的YWL1細菌菌液（實施例1提供），使用二糖酶(蔗糖酶)試劑盒（南京建成生物工程研究所）按說明提取蔗糖酶。若提取到蔗糖酶，則說明該菌可以利用蔗糖，無則反之。結果表明，如表2所示，說明該細菌不存在蔗糖酶，不可以利用蔗糖。

（5）革蘭氏染色測定實驗

染液: 結晶紫染色液、脫色液、95%乙醇、沙黃復染液、稀石碳酸復紅液（均由本實驗室提供）。

染色方法：在涂片上滴加一滴蒸餾水，用接種環將YWL1細菌涂于水滴中，并輕輕攪勻，酒精燈烘干；再將涂片固定于酒精燈火焰上方，滴加結晶紫染色液，染1min，水洗；滴加革蘭氏碘液，作用1min后，水洗；接著滴加95wt%酒精水溶液脫色，約30s，或將酒精滴滿整個涂片，立即傾去，再用酒精滴滿整個涂片，脫色10s，水洗；滴加復染液，復染1min，水洗，待干，鏡檢。若所染菌呈紅色則為革蘭氏陰性菌，若所染菌呈紫色則為革蘭氏陽性菌。結果表明，表2所示，說明該細菌為革蘭氏陰性菌。

表2 Marinobacter sp. YWL1的生化特性

注：“+”: 陽性; “-“: 陰性。

實施例6

Marinobacter sp. YWL1對中肋骨條藻、產毒圓海鏈藻和塔瑪亞歷山大藻藻華的抑制應用

取實施例1所分離純化的Marinobacter sp. YWL1菌液按1：4的比例分別添加到中肋骨條藻、產毒圓海鏈藻和塔瑪亞歷山大藻藻華液中，對照組添加含有30 mg/L硅酸鹽的f/2培養基。在第0、4、10 d分別取5 mL 藻液提取葉綠素a，檢測實驗組和對照組的葉綠素a濃度或OD680值的變化。

對于中肋骨條藻，結果如圖4所示，與對照組相比，裂解液的藻葉綠素a濃度在第10天具有顯著性影響 (P < 0.05)。對照組藻葉綠素a濃度從0.096 mg/L 穩定上升至 0.285 mg/L。而實驗組，前四天緩慢上升至0.186 mg/L，隨后到第10天下降至0.068 mg/L，與對照組相比下降了76.14%，對中肋骨條藻具有很好的裂解作用。

通過相同實驗方法得到Marinobacter sp. YWL1使產毒圓海鏈藻和塔瑪亞歷山大藻藻液的OD680減少65.38%和57.25%，控藻效果明顯。

綜上所述，上述赤潮藻裂解菌海桿菌YWL1株可用于特異性地抑制東海赤潮優勢藻中肋骨條藻和產毒赤潮藻圓海鏈藻、塔瑪亞歷山大藻的生長并殺死這些藻。其對中肋骨條藻（SCXMBO2和SKSPXS0711）具有強裂解作用，使藻液由褐色變成白色；對產毒赤潮藻圓海鏈藻和塔瑪亞歷山大藻均具有強烈裂解作用，使藻液顏色變淡至無色。

上述說明并非對本發明的限制，本發明也并不限于上述舉例。本技術領域的普通技術人員在本發明的實質范圍內，作出的變化、改型、添加或替換，也應屬于本發明的保護范圍，本發明的保護范圍以權利要求書為準。

序 列 表

<110> 寧波大學

<120> 一株赤潮藻裂解細菌YWL1及其應用

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1266

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 中肋骨條藻高效裂解菌YWL1基因

<400> 1

GGGCTGGCGG CAGCTTACAC ATGCAGTCGA GCGGTAACAG GGGGTGCTTG CACCCCGCTG

ACGAGCGGCG GACGGGTGAG TAATGCATAG GAAACTGCCC AGTAGTGGGG GATAGCCCGG

GGAAACCCGG ATTAATACCG CGTACGCCCT TCGGGGGAAA GCAGGGGATC TTCGGACCTT

GCGCTATTGG ATGTGCCTAT GTCGGATTAG CTAGTTGGTG GGGTAAAGGC CTACCAAGGC

GACGATCCGT AGCTGGTCTG AGAGGATGAT CAGCCACATC GGGACTGAGA CACGGCCCGA

ACTCCTACGG GAGGCAGCAG TGGGGAATAT TGGACAATGG GGGCAACCCT GATCCAGCCA

TGCCGCGTGT GTGAAGAAGG CTTTCGGGTT GTAAAGCACT TTCAGTGAGG AGGAAAACTC

TGCGACTAAT ACTCGTAGGG CTTGACGTTA CTCACAGAAG AAGCACCGGC TAACTCCGTG

CCAGCAGCCG CGGTAATACG GAGGGTGCAA GCGTTAATCG GAATTACTGG GCGTAAAGCG

CGCGTAGGTG GTTTGATAAG CGAGATGTGA AAGCCCCGGG CTTAACCTGG GAACGGCATT

TCGAACTGTC AGGCTAGAGT ATGGTAGAGG GTAGTGGAAT TTCCTGTGTA GCGGTGAAAT

GCGTAGATAT AGGAAGGAAC ACCAGTGGCG AAGGCGGCTA CCTGGACCAA TACTGACACT

GAGGTGCGAA AGCGTGGGGA GTAAACAGGA TTAGATACCC TGGTAGTCCA CGCCGTAAAC

GATGTCTACT AGCCGTTGGG ACTCTTGAAG TCTTAGTGGC GCAGCTAACG CACTAAGTAG

ACCGCCTGGG GAGTACGGCC GCAAGGTTAA AACTCAAATG AATTGACGGG GGCCCGCACA

AGCGGTGGAG CATGTGGTTT AATTCGACGC AACGCGAAGA ACCTTACCTG GCCTTGACAT

GCAGAGAACT TTCCAGAGAT GGATTGGTGC CTTCGGGAAC TCTGACACAG GTGCTGCATG

GCGTCGTCAG CTCGTGTCGT GAGATGTTGG GTAAGTCCCG TACGAGCGCA ACCCCTATCC

CTAGTGCTAG CAGTTCGGCT GAGAACTCTA GGGAGACTGC CGTGACAACC GGAGAAGGTG

GGGGGATGAA CGTCAGGTCA TCATGACTTA CGGCCAGGCT ACCCACTGGC TCAATGGTGG

CCAAGCGTCA ACCCGAGGGG ACACTCATAC ACTGTATCCG ATGCACTGCA ACTGACTGCG

TGGACT 1266