本發明涉及一種識別過氧化氫（H₂O₂）的熒光探針，尤其涉及一種在純水體系內專一識別H₂O₂的咔唑類化合物熒光探針；屬于有機小分子熒光探針領域。

背景技術：

過氧化氫(H₂O₂) 在各種生理過程中發揮重要作用，H₂O₂水平異常與許多類型的疾病如癌癥、糖尿病、唐氏綜合癥和罕見病相關聯。近來，H₂O₂已證實是學術界與人類重大疾病相關的活性小分子?；诖耍隗w內和體外對H₂O₂的檢測也引起人們的高度重視。

目前，H₂O₂的檢測手段主要分為兩類：直接法和間接法。直接法是一類直接利用H₂O₂自身物理、化學性質對其進行分析檢測的方法，包括原子吸收、發射光譜法和離子選擇性電極法；間接法是一類利用H₂O₂的識別位點進行檢測，主要是通過設計合成光物理性質較好的熒光平臺，基于該平臺的熒光探針進行在體外和生物體內進行檢測。但是，綜合分析目前報道的H₂O₂熒光探針主要存在以下不足：第一，在純水體系內檢測H₂O₂ 依然很難，由于合成探針的本身具有較大的疏水性結構；第二，在純水體系內H₂O₂探針的選擇性不高，容易受到其他氧化應激分析物的干擾；基于此，開發新型熒光探針在純水體系內中專一識別過氧化氫（H₂O₂）的熒光探針，并給出檢測曲線判斷H₂O₂水平，有著重要的實際應用價值。

技術實現要素：

針對以上現有技術的不足，本發明提供了一種在純水體系中檢測H₂O₂的熒光探針并研究了其光譜性質。

本發明所述識別過氧化氫的熒光探針，其特征在于：所述熒光探針命名為CAI，其化學結構式如式（I）所示：

（）。

上述CAI制備方法是：

將化合物1與吡啶鹽2以乙醇做溶劑，哌啶作催化劑，在氮氣保護下回流反應。反應結束后，柱層層析得到CAI。

上述CAI的制備反應式如下：

本發明所述識別過氧化氫的熒光探針在純水體系內檢測H₂O₂。

上述的應用中：所述熒光探針是以熒光淬滅的方式實現對溶酶體中H₂O₂的識別。

相關實驗證實：檢測環境是水相時，本發明所述的熒光探針CAI在純水體系內熒光增強明顯，而在過氧化氫存在的條件下熒光淬滅，證明該探針可能是過氧化氫探針（圖1）。在H₂O₂選擇性試驗中，當用405nm光激發，只有H₂O₂發生10倍的淬滅（圖2）；在H₂O₂滴定實驗中（圖3），隨著過氧化氫的逐漸增加，探針CAI熒光逐漸淬滅。在探針的動力學研究中，在405nm氙燈連續照射半小時，探針在過氧化氫存在的條件下，探針熒光強度趨于緩慢淬滅狀態（圖4）。推斷，該探針在細胞內能檢測到細胞器的過氧化氫活性分子。

基于上述實驗結果，可以證明本發明所述的在存水體系內識別H₂O₂的熒光探針是一類新型的高選擇性熒光探針分子，該探針的識別機理是通關熒光團中過氧化氫的識別位點硼酸酯與過氧化氫發生氧化反應導致的熒光團的淬滅效應。其識別反應產物如（II）所示：

。

本發明提供的識別純水體系內的過氧化氫的咔唑類化合物熒光探針與其功能相近的傳統的過氧化氫熒光探針相比具有顯著優勢，且本發明所述咔唑類化合物在體外對活性小分子高選擇性檢測和合成手段也具有新穎性和簡便性。本發明的熒光探針在純水體系內通過熒光增強而為檢測過氧化氫熒光淬滅性提供熒光平臺，該探針及其研究為生物學成像應用奠定了理論基礎，預示該探針在活細胞內過氧化氫的檢測的實現提供重要工具。

附圖說明

圖1探針本身及其在過氧化氫存在下的熒光光譜。激發波長405 nm。

圖2探針對過氧化氫的選擇性。激發波長為405 nm；探針母液的濃度：10^-3M，選擇性離子的濃度為0.2 mM。

其中激發波長為405 nm；探針母液的濃度：10^-3M，選擇性離子的濃度為0.2 mM。

圖3 H₂O₂的滴定圖。

橫坐標：熒光強度，縱坐標：波長。

H₂O₂的滴定實驗；其中激發波長為405 nm；探針母液的濃度:10^-3M，取5μL探針母液稀釋3ml進行，加入不同量的H₂O₂滴定。

圖4：探針加入H₂O₂后的動力學變化圖

橫坐標：相對熒光強度，縱坐標：時間。

其中激發波長為405 nm；探針的濃度:10^-3M；時間1800s。

具體實施方式

實施例1

CAI的合成：

將0.35g(1mmol)化合物1，0.25g(1.1mmol) 化合物2，溶于20mL乙醇中, 滴入兩滴哌啶做催化劑，在氮氣保護下回流反應。反應結束。用流動相CH₂Cl₂/CH₃OH=70:1過硅膠柱得到CAI。

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 8.93 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 8.62 (s, 1H), 8.27 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 8.06-8.05 (d, J = 4.0 Hz, 2H), 7.99-7.96 (m, 1H), 7.92 (s, 1H), 7.81 – 7.79 (m,1H), 7.40-7.42 (dd, J = 8.0 Hz, J1 = 8.0 Hz, J1 = 8.0 Hz, 2H), 7.18-7.14 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 4.77-4.82 (q, J = 20.0 Hz, 2H), 4.51 (q, J = 16.0 Hz, 2H), 1.72-1.69 (t, J = 12.0 Hz, 6H), 1.42 (s, 12H).

實施例2

CAI在純水體系內對過氧化氫的響應：

預先準備1份10 mL的10^-3 M本發明的探針N, N-二甲基甲酰胺溶液，然后分別取5μL加入兩個相同的5mL容量瓶中，其中一個瓶中加入過氧化氫當量為探針當量的22倍，用PBS的溶液稀釋到3mL，然后進行熒光檢測（λ_Ex= 405nm），結果見圖1。

結論： 表明該探針在在純水體系內響應。

實施例3

CAI對過氧化氫的選擇性(見圖2)：

其中：激發波長為405 nm；探針母液的濃度：10^-3M，選擇性離子的濃度為0.2mM。取5μL探針母液稀釋3ml進行，后取3mL的上述稀釋液，加入各種離子進行光譜測試,其中各種離子濃度均為0.2mM。探針的測試環境均為PBS緩沖溶液。

結論：測試結果表明，探針CAI對過氧化氫具有高選擇性。加入過氧化氫后，探針響應倍數為10倍左右。

實施例 4

過氧化氫的滴定：

配制10 mL濃度為0.2mM H₂O₂的水溶液及本發明的探針母液（濃度為10^-3M）作為備用。

將過氧化氫濃度從0當量滴定到22當量并進行熒光檢測（λ_Ex= 405nm, λ_Em= 575nm），計算各體系中熒光強度，建立熒光強度與過氧化氫濃度標準曲線 (見圖3)。

結論：隨著過氧化氫的加入，探針的熒光強度趨于下降至平衡的趨勢。

實施例5

過氧化氫的動力學實驗：

為了研究探針的動力學，配置探針的濃度為10-3M，在405nm氙燈連續照射半小時，檢測探針在過氧化氫存在的條件下，熒光強度趨于緩慢淬滅狀態。建立熒光強度與時間的標準曲線(見圖4)。

結論：隨著時間的延長，探針的熒光強度趨于下降至平衡的趨勢，該探針在細胞內能檢測到細胞器的過氧化氫活性分子。