本發明涉及一種金屬β-內酰胺酶的三肽抑制劑，尤其涉及該肽在制備抗菌藥物及預防、治療耐藥菌感染中的用途。

背景技術：

產生β-內酰胺酶是導致細菌尤其是革蘭氏陰性菌耐藥的重要機制之一，它們能水解β-內酰胺類抗生素的β-內酰胺環，導致抗生素失活。β-內酰胺酶可以分為絲氨酸β-內酰胺酶和金屬β-內酰胺酶(MBLs)。根據氨基酸序列的同源性以及對金屬Zn離子的依賴性，MBLs又進一步分為B1，B2和B3亞類。目前發現B1類有18個同源家族，B2類有3個同源家族，B3類有9個同源家族。由于金屬β-內酰胺酶能夠水解包括碳青霉稀類抗生素在內的幾乎所有β-內酰胺類抗生素，而且目前沒有有效的抑制劑上市，因此MBLs是目前臨床上抗感染治療的重大挑戰，受到了廣泛關注。

B1類MBLs中的IMP、VIM以及近幾年流行的NDM型金屬β-內酰胺酶臨床檢出率最高。2010年8月《柳葉刀-傳染病》雜志上報道了在印度、巴基斯坦和英國共分離得到180株含有blaNDM-1質?；虻募毦?，實驗發現，它們除了替加環素和多黏菌素以外，對其他所有抗生素都具有高度耐藥性。不斷進化的突變株使得臨床治療更加艱難，因此開發廣譜MBLs抑制劑成為醫學領域的一大挑戰。

技術實現要素：

本發明以多藥耐藥細菌所產生的金屬β-內酰胺酶為靶標，并針對該類酶催化水解抗生素的活性中心設計合成了一個三肽，本發明的三肽可聯合抗生素治療多藥耐藥細菌感染。

本發明的金屬β-內酰胺酶三肽抑制劑為廣譜金屬β-內酰胺酶抑制肽，其特征在于長度為3個氨基酸，拓撲結構為線性，化學結構式為：

本發明所涉及的金屬β-內酰胺酶三肽抑制劑用固相合成法制備，方法簡單，技術成熟，產物質量容易控制，能滿足大規模工業化生產的需要。

藥效學試驗證明本發明的三肽對典型的金屬β-內酰胺酶，如NDM-1、IMP-1和VIM-2等，具有明顯的抑制作用。

藥效學試驗證明本發明的三肽與β-內酰胺類抗生素具有良好的協同作用，能明顯抑制耐藥菌生產并且大幅度降低β-內酰胺類抗生素的最小抑菌濃度(MIC)。所述的β-內酰胺類抗生素優選頭孢呋辛鈉。

本發明的三肽也可以和藥學上可接受的鹽結合，同樣具有其藥效。這些鹽包括(但不局限于)與堿金屬或堿土金屬(如鈉、鉀、鈣或鎂)形成的鹽。其他鹽包括與如下無機酸形成的鹽：如鹽酸、硫酸、硝酸、磷酸，以及與有機酸形成的鹽，而有機酸則指乙酸、草酸、丁二酸、酒石酸、甲磺酸和馬來酸。藥學上可接受的鹽優選鈉鹽。

本發明公開了一種抗菌藥物組合物，其中含有該三肽或其藥學上可接受的鹽及藥學上可接受的載體。

上述藥物組合物可以制成注射劑、片劑、注射用無菌粉末、粉劑、顆粒劑、膠囊劑、口服液、膏劑、霜劑等多種劑型。上述各種劑型均可以根據藥學領域的常規方法制備。可以通過注射、口服、滴鼻、滴眼、物理或化學介導的方法導入肌肉、內皮、皮下、靜脈、粘膜組織，或是被其他物質混合或包裹后導入肌體。

一般地，本發明的三肽使用劑量在0.001～10克/天，也可以根據疾病的情況偏離這個劑量范圍。

下面是本發明的三肽的部分藥效學試驗及結果：

一、三肽對NDM-1型金屬β-內酰胺酶抑制活性(IC₅₀)的測定：

以頭孢呋辛鈉為報告底物，在274nm波長下測定NDM-1型金屬β-內酰胺酶水解底物后吸光度的變化。測定緩沖液為50mM HEPES，250mM NaCl，2μM ZnCl₂，pH＝7.25，溫度30℃。

(1)首先將金屬β-內酰胺酶(終濃度10μM)于緩沖液中孵育5min，使得Zn²⁺充分占據活性中心；

(2)加入10μL不同濃度的三肽抑制劑，30℃孵育5min，使抑制劑與酶充分結合；

(3)將體系轉入石英比色皿中，加入8μL頭孢呋辛鈉(終濃度160μM)的同時立即測定體系吸光度的變化，記錄數據。

由于底物頭孢呋辛鈉被酶水解后其吸光度下降，因而通過測定吸光度的變化可以表征底物的水解程度。計算不同濃度的三肽抑制劑對NDM-1水解底物的抑制率，以三肽抑制劑的濃度對抑制率擬合曲線，計算得到本發明的三肽分子對NDM-1型金屬酶的IC₅0值為86.46μM，表明其對NDM-1型金屬酶有較好的抑制作用。

二、三肽抑制劑對IMP-1型金屬β-內酰胺酶抑制活性(IC₅₀)的測定：

以頭孢呋辛鈉為報告底物，在274nm波長下測定IMP-1型金屬β-內酰胺酶水解底物后吸光度的變化。測定緩沖液為50mM HEPES，250mM NaCl，2μM ZnCl₂，pH＝7.25，溫度30℃。具體操作步驟同實施例1。計算不同濃度的三肽抑制劑對IMP-1水解底物的抑制率，以三肽抑制劑的濃度對抑制率擬合曲線，計算得到三肽分子對IMP-1型金屬酶的IC₅₀值49.6μM，說明此三肽分子對IMP-1型金屬酶有較好的抑制作用。

三、三肽分子與β-內酰胺類抗生素協同抗NDM-1型工程菌活性的測定：

為了能夠安全進行協同抗菌實驗，使用相對安全的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-NDM-1菌株作為耐藥菌株，將E.coli BL21(DE3)/pET28a菌株作為陰性對照。采用二倍稀釋法測定最小抑菌濃度(Minimum Inhibitory Concentration，MIC)，通過MIC值的變化反映抑制肽與抗生素的協同抗菌作用。

具體方法如下：

將超低溫冰箱中保存的工程菌菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a-NDM-1以及對照菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a分別接種于滅菌的Luria-Bertani(LB)固體培養基中，于37℃恒溫培養箱中倒置培養12小時。用接種環挑取單菌落分別轉接到滅菌的液體LB培養基中，于37℃，200rpm條件下震蕩培養至對數生長期。用紫外分光光度計測定600nm波長處菌液的吸光度值(OD₆₀₀)，根據1OD＝1×10⁹CFU/mL的換算關系，分別將表達金屬β-內酰胺酶的工程菌菌株以及對照菌株稀釋至終濃度1×10⁶CFU/mL。

對照組(1)：E.coli BL21(DE3)/pET28a菌。在無菌96孔板中加入依次倍比稀釋的終濃度為512～2μg/mL的抗生素頭孢呋辛鈉，然后向各孔中加入終濃度1×10⁶CFU/mL的菌液，混合均勻。

對照組(2)：表達金屬β-內酰胺酶的工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-NDM-1。在無菌96孔板中加入依次倍比稀釋的終濃度為512～2μg/mL的抗生素頭孢呋辛鈉，然后向各孔中加入終濃度1×10⁶CFU/mL的菌液，混合均勻。

對照組(3)：表達金屬β-內酰胺酶的工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-NDM-1。在無菌96孔板中加入終濃度1×10⁶CFU/mL的菌液和終濃度為200μM的三肽抑制劑，混合均勻。

實驗組均使用能表達金屬β-內酰胺酶的工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-NDM-1。

實驗組(1)：在無菌96孔板中加入依次倍比稀釋的濃度為512～2μg/mL的抗生素頭孢呋辛鈉，然后向各孔中加入終濃度1×10⁶CFU/mL的菌液和終濃度為200μM的三肽抑制劑，混合均勻。

實驗組(2)：在無菌96孔板中加入依次倍比稀釋的濃度為512～2μg/mL的抗生素頭孢呋辛鈉，然后向各孔中加入終濃度1×10⁶CFU/mL的菌液和終濃度為100μM的三肽抑制劑，混合均勻。

實驗組(3)：在無菌96孔板中加入依次倍比稀釋的濃度為512～2μg/mL的抗生素頭孢呋辛鈉，然后向各孔中加入終濃度1×10⁶CFU/mL的菌液和終濃度為50μM的三肽抑制劑，混合均勻。

實驗組(4)：在無菌96孔板中加入依次倍比稀釋的濃度為512～2μg/mL的抗生素頭孢呋辛鈉，然后向各孔中加入終濃度1×10⁶CFU/mL的菌液和終濃度為25μM的三肽抑制劑，混合均勻。

實驗組(5)：在無菌96孔板中加入依次倍比稀釋的濃度為512～2μg/mL的抗生素頭孢呋辛鈉，然后向各孔中加入終濃度1×10⁶CFU/mL的菌液和終濃度為12.5μM的三肽抑制劑，混合均勻。

實驗組(6)：在無菌96孔板中加入依次倍比稀釋的濃度為512～2μg/mL的抗生素頭孢呋辛鈉，然后向各孔中加入終濃度1×10⁶CFU/mL的菌液和終濃度為6.25μM的三肽抑制劑，混合均勻。

以上各組于37℃緩慢震蕩培養16小時，測定波長為600nm處的吸光度值。檢測不到細菌生長的孔中頭孢呋辛鈉的終濃度為最小抑菌濃度(MIC)，三肽分子Phe-Cys-Pro對含有NDM-1的耐藥菌株聯合抑菌效果如表1所示。

表1三肽Phe-Cys-Pro與頭孢呋辛鈉協同抗NDM-1工程菌的測定結果

^a-：三肽Phe-Cys-Pro本身無抗菌活性。

由表1結果可知，對照組(1)中頭孢呋辛鈉對敏感菌株E.coli BL21(DE3)具有良好的抑制作用(MIC＜2μg/mL)；對照組(2)為耐藥菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a-NDM-1，頭孢呋辛鈉幾乎不能抑制該菌株的生長(MIC＝256μg/mL)，同時也證明了該菌株為耐藥菌；對照組(3)中含有終濃度為200μM的Phe-Cys-Pro而不含抗生素，培養16小時后菌液十分渾濁，證明該三肽抑制劑本身無抗菌作用。

從實驗組(1)～(6)的MIC可以看出，當Phe-Cys-Pro與抗生素頭孢呋辛鈉聯合使用時，通過協同作用能明顯提高頭孢呋辛鈉的抗菌活性，當三肽抑制劑濃度為200μM時，頭孢呋辛鈉的抗菌活性(MIC值)提高了16倍(256/16)；當三肽抑制劑濃度為25μM時，頭孢呋辛鈉的抗菌活性(MIC值)提高了2倍(256/128)。

具體實施方式

實施例1

Phe-Cys-Pro的制備

1.稱取2.0g MBHA(4-甲苯氫胺)樹脂于潔凈干燥的反應管中，加入適量DMF(二甲基甲酰胺)，活化30min左右，然后稱取Fmoc(芴甲氧羰酰基)保護的Phe 1mmol，DMAP(4二甲氨基吡啶)150mg，加98％的DIC(N，N’-二異丙基碳二亞胺)1ml到反應管中，DMF做溶劑反應3h。反應完畢用DMF洗4～6次，加入適量吡啶和乙酸酐，體積比為1∶1，反應30min。反應完畢用DMF洗4～6次。然后用20％的哌啶溶液脫掉氨基酸的Fmoc，脫兩次共15min，10min+5min。再用DMF洗4次，甲醇洗2次，取出少量樹脂用茚三酮檢測試劑檢測，檢測為藍色，即可進行下一步反應。

2.稱取Fmoc保護的Cys 3mmol，HBTU(苯并三氮唑N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯)3mmol于反應管中，加入DIEA(N，N-二異丙基乙胺)0.5mL，反應40min，用DMF洗4～6次，取少量樹脂用茚三酮檢測試劑檢測，顯無色，然后加入20％的哌啶溶液脫Fmoc，10min+5min，然后用DMF洗4次，甲醇洗兩次，取出少量樹脂用茚三酮檢測試劑檢測，檢測為藍色，即可進行下一步反應。

3.稱取Fmoc保護的C端氨基酸Pro 3mmol，HBTU 3mmol于反應管中，加入DIEA 0.5mL，反應40min，用DMF洗4～6次，取少量樹脂用茚三酮檢測試劑檢測，顯無色，然后加入20％的哌啶溶液脫Fmoc，10min+5min，然后用DMF洗4次，甲醇洗兩次，取出少量樹脂用茚三酮檢測試劑檢測，檢測為藍色。

4.最后用三氟乙酸切割液切割2h，反應液抽濾，得多肽的三氟乙酸溶液，用乙醚沉淀，離心，然后再用乙醚洗3～5次，得白色固體，經C18反相制備柱脫鹽，凍干，取少量進行MS分析。HPLC測定三肽的純度為95.56％，MS鑒定其分子量為365.10，與理論分子量365.45基本一致。

實施例2

含Phe-Cys-Pro抑制肽的抗菌藥物組合物的制備(膠囊)

按照100個膠囊的用量，稱取以上各輔料分別研細過篩后混合均勻，然后用等量遞加法加入頭孢呋辛鈉和Phe-Cys-Pro，充分研磨，使其分散均勻，再過80目篩，然后灌制成膠囊。