專利名稱：肽基精氨酸脫亞胺酶(pad)抑制劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及醫學領域，特別是涉及自身免疫性疾病并且最特別是涉及類風濕性關 節炎(RA)的預防和治療。本發明還涉及酶學領域。本發明涉及開發酶抑制劑的方法，并且 公開了肽基精氨酸脫亞胺酶(EC 3.5.3. 15)的有效抑制劑。這些PAD抑制劑可以用于制備 治療自身免疫性疾病，尤其是治療RA、牛皮癬和多發性硬化(MQ的藥物。
背景技術：
RA是常見的自身免疫性疾病，流行于約的全世界人口中。它是多種因素引起 的并且表現為關節滑膜發炎，從而導致關節腫脹和疼痛。發炎過程通常導致軟骨破壞以及 不可逆的骨質侵蝕。抗CCP的自身抗體在RA的發作和永存中起著重要作用。首先，已證實抗CCP的 抗體對RA是高特異性的。多項研究結果顯示對這些抗體呈現血清陽性反應的每個個體不 是已經患有RA就是在將來會發展這種疾病。抗CCP抗體的存在(尤其是當存在高滴定度 時)是侵蝕性疾病結果的前兆{Nijenhuis et al.，2004}。最后，已證實抗CCP抗體是在炎 癥位點局部產生的。在RA患者的滑膜物質中發現的抗CCP抗體與總IgG的比例看起來比 在相同患者血清中的要明顯高得多{Masson-BessiAre et al，2000，Reparon-Schuijt et al，2001}。滑膜中產生抗CCP的血漿細胞的存在預示著在炎癥位點CCP特異性B細胞的抗 原驅動的化膿。抗CCP抗體在關節炎產生中的作用的支持來自對Fc y RIIB敲除小鼠的研 究。已證實，源于患有活性RA患者的血漿或血清的免疫球蛋白可在這些小鼠中引起炎癥和 組織學損害{Petkova et al，2006}。在膠原誘發的關節炎模型中，據報道，抗瓜氨酸化蛋 白的抗體可加重組織損傷，證實了這些抗體在自身免疫性關節炎的發病機制上的直接作用 {Kuhn et al，2006}。在最近的一片文章中，Hill及其同事報道了瓜氨酸化纖維蛋白原可 以在DR4-IE轉基因小鼠中引起關節炎，表現為滑膜增生隨后關節強直。T細胞表位掃描和 抗體微陣列分析鑒定出瓜氨酸特異性反應的獨特模式，這在用未修飾的纖維蛋白原免疫的 DR4-IE轉基因小鼠中或在用瓜氨酸化纖維蛋白原免疫的野生型C57BL/6小鼠中均未發現。 這些觀察結果直接暗示著瓜氨酸化纖維蛋白原對于RA相關的MHC II型分子是致關節炎的 {Hill et al，2008}。與抗原驅動的機制一致，已證實瓜氨酸化蛋白在發炎的RA滑膜中存在。據報道 纖維蛋白α-和β-鏈的瓜氨酸化形式不僅僅存在于RA患者的滑膜中{Masson-Bessigre et al，2001}。M抗原的分子特征將M鑒定為瓜氨酸化波形蛋白。M抗原可被RA自身抗 體特異性地定向，據報道它存在于發炎的滑膜中。源自單核細胞的巨噬細胞中的鈣流入導 致波形蛋白的瓜氨酸化，該巨噬細胞在發炎的滑膜中大量存在，并且巨噬細胞響應促炎信 號通分泌波形蛋白這一事實與瓜氨酸化波形蛋白在RA發生中的作用是一致的IVossenaar and van Venrooi j, 2004} 0除了纖維蛋白和波形蛋白，其他瓜氨酸化自身抗原可在發炎的 關節中產生。通過使用蛋白質組學方法，在RA患者的滑膜組織鑒別出13種自身抗原性瓜 氨酸化蛋白，包括纖維蛋白原{Matsuo et al，2006}。據報道，瓜氨酸化酶PAD4 (見下)在 瀕死的粒細胞中被激活，并且這會導致核蛋白的瓜氨酸化{Nakashima et al.，2002}。很可能的是在發炎的滑膜中，凋亡的粒細胞不被完全清除，這是先前在系統性紅斑狼瘡患者身 上觀察到的現象{Ren et al，2003}，并且作為結果瓜氨酸化蛋白可能暴露于免疫系統下。瓜氨酸化是精氨酸殘基翻譯后轉化為瓜氨酸殘基，這是由肽基精氨酸脫亞胺酶 (PAD)催化的。肽基精氨酸脫亞胺酶(PAD ；EC 3. 5. 3. 15)催化蛋白中的精氨酸殘基轉化為 瓜氨酸殘基。沒有tRNA是為瓜氨酸存在的，瓜氨酸殘基在蛋白中的存在無一例外地是翻 譯后修飾的結果。在哺乳動物中(人類、小鼠和大鼠)，鑒定出五種PAD同型(PAD1-PAD6; ‘PAD4，和‘PAD5，用于相同的同型)，每種由不同的基因編碼{Vossenaar et al, 2003b} 所有的這些酶的活性極度依賴于Ca2+的存在，并且不能將游離的L-精氨酸轉化為游離的 L-瓜氨酸。真核細胞中的一氧化氮合酶(EC 1. 14. 13. 39)或細菌中的精氨酸脫亞胺酶(EC 3.5.3.6)可以將游離的L-精氨酸轉化為游離的L-瓜氨酸。這些酶是非Ca2+依賴性的。高同源性的PAD酶之間最顯著的不同在于它們的組織特異性表達。在表皮中，在 角化細胞分化的最后階段，PADl (同物異名PAD I、I型PAD)參與角蛋白絲的瓜氨酸化，這 對角質化包膜的重組是重要的。在表皮中另一個瓜氨酸化位點是毛囊，其含有PAD3(同物 異名PAD III、III型PAD)及其天然底物毛透明蛋白(THH)。THH是內根鞘細胞以及毛囊 和較小程度上的其他分化的上皮細胞的髓質層的主要結構蛋白。最近鑒定出的PAD同型 PAD6(同物異名ePAD)被發現存在于在早期胚胎形成中起重要作用的小鼠卵母細胞的細 胞質層中。發現它的人直系同源物(orthologue)的表達局限于卵巢、睪丸和末梢血白細胞 {Chavanas et al.，2004}。最初，該PAD同型被命名為ePAD，但是基于其他PAD的系統編號 方式，該同型被重命名為PAD6 {Vossenaar et al. , 2003b} 0最廣泛表達的同型PAD2 (同物 異名PAD II、II型PAD、PAD-H19)存在于許多不同的組織中，如骨骼肌、腦、脾、分泌腺和巨 噬細胞。盡管具有廣泛的表達模式，但是只有髓鞘堿性蛋白(MBP)和波形蛋白被鑒定為天 然底物。MS患者能產生抗MBP的自身免疫性應答。MBP是髓鞘中的大量蛋白，并且其瓜氨酸 化發生于中樞神經系統的發育過程中。在鈣離子載體誘導的人和小鼠巨噬細胞的凋亡中， 觀察到波形蛋白的瓜氨酸化，并且如上所述，顯示瓜氨酸化波形蛋白是RA特異性的抗Μ自 身抗體的靶標。與如上所討論的主要位于細胞的細胞質中的PAD相反，PAD4同型(同物異 名=PAD IV、IV 型 PAD、HL-60PAD、PAD V、V 型 PAD、PAD 14)位于細胞核中。發現 PAD4 的核 定位信號存在于該蛋白的N端區。PAD4主要在末梢血粒細胞和單核細胞中表達。PAD4在 細胞核中的底物是組蛋白核心蛋白(H2A、H3和H4)和核磷蛋白/B23，核磷蛋白/B23是在 核糖體組裝、核與質的轉運以及中心體的復制中發揮功能的核仁蛋白。基于這些表達特征，兩種PAD同型即PAD2和PAD4，是在與RA中免疫應答相關的蛋 白瓜氨酸化中發揮作用的瓜氨酸化酶的候選物。PAD2和PAD4存在于單核細胞、巨噬細胞和 粒細胞中，這些細胞大量存在于發炎的滑膜中{Chapuy-Regaud et al.，2003}。PAD通常作為無活性的酶存在于細胞溶質或核質中，因為該位點鈣離子濃度低于 激活它們所需要的濃度。然而，在細胞死亡中，質膜的完整性喪失，導致Ca2+從細胞外空間 流入(細胞外Ca2+濃度為 1(Γ3Μ，足夠使PAD激活)并隨后激活細胞內PAD。選擇性地或 同時地，激活的PAD酶可以從瀕死的細胞中滲出并催化細胞外蛋白的瓜氨酸化。人PAD4蛋白的晶體結構在多年前已有描述{Arita et al.，2004}。存在和不存在 鈣離子以及帶有和不帶結合底物的催化上無活性的突變體的PAD4晶體結構的比較，揭示 了 5個Ca2+結合位點，并且顯示Ca2+的結合誘發構象變化從而產生活性位點裂口(cleft)。結構數據確定了催化三聯體Cys-His-Glu/Asp定位于活性位點裂口中，在先前，部分基于 其他精氨酸修飾酶的結構信息而認為其存在催化位點的中心。基于這一保守模式以及底 物結合模式與其他精氨酸轉化酶的底物結合模式是相似的這一假設，提出了該催化機制 {Shirai et al.，2001}，其他精氨酸轉化酶如二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶和L-精氨酸 脫亞胺酶。主要起作用的是Cys-645和His-471，Cys-645對精氨酸胍基的碳原子發動親核 攻擊，His-471的作用是通用堿基。 如上所述，越來越多的證據支持抗CCP抗體及其抗原靶標在RA病理生理學中的作 用。瓜氨酸化肽和RA相關的HLA單倍型的瓜氨酸依賴性相互作用進一步支持了瓜氨酸化 蛋白在RA的病因學上的作用{Hill et al，2003}。如上所述，同一個團隊的近期數據顯示， 在DR4-IE轉基因小鼠中關節炎確實是由瓜氨酸化纖維蛋白原誘發的{Hill et al，2008}。 總之，這些數據表明，抗CCP抗體在RA中的特異性產生是在瓜氨酸化抗原暴露于免疫系統 和/或瓜氨酸化抗原被免疫系統識別的水平上介導的。一旦產生抗CCP抗體，在滑膜中與 瓜氨酸化蛋白的免疫復合物的形成，可以引發發炎過程的進展。對患有RA的患者進行的B 淋巴細胞消減實驗的結果支持了抗CCP抗體在RA發病機制中的作用{Cambridge et al., 2003}。已知PAD酶及其產物瓜氨酸化蛋白在多種其他人類疾病中發揮作用，尤其是在諸 如牛皮癬、MS和系統性紅斑狼瘡的自身免疫性疾病中。在牛皮癬中，角質細胞增生非常快并且僅僅約四天就從基底層轉移到表面。皮膚 不能足夠快地脫落這些細胞因而它們積聚成粗厚干燥的斑點或斑塊。在正常的角質細胞 中，角蛋白Kl在最后的分化中被PADl瓜氨酸化。這一過程使角蛋白纖維變得更緊密，這是 表皮正常角質化進程是必需的。牛皮癬患者過度增生斑塊中的角質細胞不含有瓜氨酸化角 蛋白KlUshida-Yamamoto et al.，2000}。尚未清楚的是，是增強的細胞增生阻止了 PAD 進行足夠的瓜氨酸化還是PAD的失活允許角質細胞過度增生和積聚。雖然這一機制尚未清 楚，但牛皮癬患者表皮中的異常瓜氨酸化明顯與PADl相關。MS是CNS的慢性炎癥病癥，表現為自身免疫性介導的髓鞘的破壞。髓鞘細胞圍繞 軸突形成多組雙層結構，軸突由脂質蛋白復合物以約3 1的比例組成。兩種主要的蛋白 即MBP和蛋白脂質蛋白，占蛋白成分的85%。MBP是高陽離子蛋白，能與帶負電荷的磷脂如 磷脂酰絲氨酸形成很強的相互作用。在健康成人的約18%的MBP分子中，6個(19個中的) 精氨酸被瓜氨酸化{Wood et al. ,1989, Wood et al.，1996}。剩余的MBP分子不包含瓜氨 酸。在MS患者中，MBP-cit6的比例增至總MBP的45%。MBP_cit6的減少的凈正電荷引起 MBP分子的部分未折疊并且使其與磷脂的相互作用減弱{Boggs et al. , 1999,Pritzker et al.，2000}。雖然MBP-Cit6能比非瓜氨酸化MBP更快地形成脂質復合物，但是所形成的復 合物堆積不如非瓜氨酸化MBP形成的堆積濃密{Boggs et al, 1999,Beniac et al，2000}。 MBP-cit6比非瓜氨酸化MBP被組織蛋白酶D降解要快4倍{Cao et al.，1999}。在急性 爆發性MS的罕見案例中(馬爾堡型(Marburg type))，80 %的MBP分子被高度瓜氨酸化 (MBPcit 18) {Wood et al.，1996}。嚴重未折疊的MBPcitl8比正常MBP被組織蛋白酶D降 解要快45倍{Cao et al.，1999}。關于紫杉醇的臨床試驗正在進行中，紫杉醇是抗癌藥物 泰素(taxol)的活性成分{O'Connor et al.，1999}。低劑量的紫杉醇可以在體外抑制MBP 被PAD2瓜氨酸化{Pritzker et al.，1998}。用紫杉醇進行治療削弱了臨床癥狀并且促使損傷的髓鞘進行髓鞘再生{Moscarello et al.，2002}，從而強調了 PAD作為脫髓鞘性疾病 中的候選因素的可能的重要性{Moscarello et al.，20022x}。發明詳述干擾與瓜氨酸化蛋白(水平的改變)相關的自身免疫性疾病的一個潛在的靶標是 PAD。阻斷瓜氨酸化蛋白在炎癥位點例如在RA發炎的滑膜中的產生，會阻止免疫復合物的 形成并且因此預計將抑制受侵襲的關節發炎過程的進展。因為瓜氨酸化蛋白在滑膜中沒有 明顯的生理學作用，所以預計干擾它們的產生不會引起嚴重的副作用。因此，優選在不必要的自身免疫性反應位點例如在發炎的滑膜中，旨在特異性抑 制PAD活性的治療干預對RA患者的關節破壞過程是高度特異性的。與RA相似，在患有MS的患者中，也可以通過給予PAD抑制劑從而阻止髓鞘堿性蛋 白(MBP)的過度或異常瓜氨酸化，這會導致髓鞘層中的脂質復合物更濃密地堆積、MBP更好 地折疊以及使MBP被組織蛋白酶D降解的敏感性降低。目前，在臨床試驗中，用低劑量的紫 杉醇抑制MBP被PAD2瓜氨酸化。用紫杉醇進行治療削弱了臨床癥狀并且誘發損傷的髓鞘 進行髓鞘再生{Moscarello et al.，2002}。然而，紫杉醇是一種帶有許多不利副作用的高 毒性藥物，即使在低劑量下。紫杉醇和泰素化合物不是PAD抑制性分子特異性的。目前，沒有特異性的PAD抑制劑被公開是適合于治療其他自身免疫性病癥，如RA、 MS、SLE或牛皮癬。本發明的目標是提供可以可逆或優選不可逆地抑制PAD酶，尤其是人 PAD2和PAD4酶的分子。苯甲酰-L-精氨酸乙酯(BAEE)已廣泛用作確定PAD活性的底物。一種相關的化 合物即苯甲酰-L-精氨酸酰胺，被用作確定PAD4底物復合物的晶體結構的底物。這表明， 雖然PAD不將游離的L-精氨酸轉化為L-瓜氨酸，但是與BAEE化學相關的化合物可能適合 活性位點裂口并且競爭結合底物分子。在這方面尤其感興趣的是半胱氨酸，它是催化三聯 體的一部分，并且認為其在親核催化反應中起必不可少的作用。通過穩定催化裂口的四面 體絡合物，可以阻止瓜氨酸化產物的形成。因此，本發明提供了 PAD抑制劑，其基于對活性 位點半胱氨酸的共價修飾從而成功地實現抑制，優選以低劑量的抑制劑。公開的抑制劑可 以以可逆的方式抑制PAD，但是優選不可逆地和/或共價地結合于PAD酶，最優選結合于活 性位點催化的半胱氨酸殘基上。化合物在第一方面，本發明提供了能抑制肽基精氨酸脫亞胺酶(PAD)的新分子或化合 物。PAD的抑制在本文中定義為通過使用實施例4、5、6和/或7中的任一個所提供的測定 在體外抑制PAD活性的化合物的能力。術語“抑制”是本領域公認的并且指下調或抑制PAD 的活性(PAD2和/或PAD4的活性)，不是兩者聯合就是分別地。通過使用最低濃度為優選 最少 0. OOOOOOlmM 或 0. 000001,0. 00001,0. 0001,0. 001,0. 01,0. 1,0. 5、1、2、5 或 IOmM 的上 述化合物，這種抑制優選指抑制最少5 %的不帶有上述化合物的上述酶的最初活性。被檢測 的PAD酶的活性在實施例6中有描述。更優選地，抑制是指抑制至少10%，甚至更優選地 至少20 %、至少30 %、至少0 %、至少50 %、至少70 %、至少90 %、至少95 %或更多。最優選 地，沒有PAD2和/或沒有PAD4的活性被測定出來。本文所定義的本發明的任一化合物，如本文所述，能抑制PAD的活性，預期其能作 為用于預防、治療和/或延緩自身免疫性病癥癥如RA的藥物而發揮功能。
本發明的化合物優選能抑制PAD的活性，更優選能抑制PAD2和/或PAD4的活性。 該化合物優選包含肽部分和親電子基團，優選氨基酸Ω所攜帶的巰基活性親電子基團，其 中(a)該肽包含至少約5個氨基酸但不多于約20個氨基酸，該肽的部分包含至少基序(bl)、(b2)、(b3)或(b4)中的一個(bl)G/S/T-D/S-Ω-D/G/S-G/S(b2)H/K/F/L/ff-S/D/H-Ω-D/E-H/Y/F/ff(b3)Y/A/K/H/L-F/Y/H-Ω-N/G/H/Y—K/A/F(b4)Y-D/S-Ω-D/G/S-G/S其中Ω代表攜帶親電子基團的氨基酸，優選巰基活性親電子基團。(c)任選地肽序列的N-末端和/或C-末端被修飾。肽部分由肽的序列代表。因此本發明所包括的肽序列可以包含或組成為帶有如上 定義的(bl)、(b2)、(b3)和/或(b4)基序的序列。因此本發明所包括的肽的序列可以是并 列的兩個或三個或更多個(bl)、(b2)、(b3)和(b4)基序。然而，優選的肽的序列包含或組 成為(bl)或( )或(b!3)或(b4)基序更優選單個(bl)或( )或(b!3)或(b4)基序。更 優選的肽的序列包含或組成為(bl)或( )或(b4)基序。優選的化合物包含或組成為SEQ ID NO :12_21，107-143，優選20_21、120、122、 127-143，更優選 20、21、127、128、136-143，甚至更優選為 138、141、142、143。包含(bl)基序或由其組成的更優選的肽序列可見于實施例1 參見表2的所有肽 序列，除了 Ll用作對照(SEQ ID NO 1-10以及Ll為SEQ ID NO :11)。在該表的每個肽序列 中，為了獲得如上定義的本發明的相應抑制劑，應該將R取代為Ω。因此，優選的肽的序列 包含或組成為SEQ ID N0:l-10，其中R被Ω取代。優選的抑制劑進一步見于實施例1 (SEQ ID NO :12-20)。因此優選的抑制劑包含或組成為SEQ ID NO 12-20、SEQ ID NO :126,127, 142。更優選的抑制劑包含或組成為SEQ ID NO :20、127、142。甚至更優選的抑制劑包含SEQ ID NO :20或由其組成，其中C-末端通過添加酰胺而被修飾。最優選的抑制劑包含SEQ ID NO :142或由其組成。包含( )基序或由其組成的優選的肽序列在表5中被鑒定出并且預期其形成特 異性抑制至少PAD4的化合物參見表5中的所有肽序列(SEQ ID NO :47-71)。在該表的每 個肽序列中，為了獲得如上定義的本發明的相應抑制劑，應將R取代為Ω。因此，優選的肽 序列包含或組成為SEQ ID N0:47-71，其中R被Ω取代。優選的抑制劑包含或組成為SEQ ID Ν0107-125、129-141。更優選的抑制劑包含或組成為 SEQ ID NO 120、122、129-141。甚 至更優選的抑制劑包含或組成為SEQ ID NO :136、137、138、139、140。最優選的抑制劑包含 SEQ ID NO 138或由其組成。包含(b!3)基序或由其組成的優選的肽序列在表9中被鑒定出并且預期其形成特 異性抑制至少PAD2的化合物參見表9中的所有肽序列，除了 Ll用作對照(SEQ ID NO 92-106以及SEQ ID NO :11作為對照Li)。在該表的每個肽序列中，為了獲得如上定義的本 發明的相應抑制劑，應該將R取代為Ω。因此，優選的肽的序列包含或組成為SEQ ID NO 92-106，其中R被Ω取代。預期在表10中所鑒定出的優選的肽序列(選自表5和9中已鑒定出的那些)形成特異性抑制PAD2和PAD4的化合物參見表10中的所有肽序列，除了 Ll和L2用作對照。 在該表的每個肽序列中，為了獲得如上定義的本發明的相應抑制劑，應將R取代為Ω。優選的抑制劑包含肽部分，所述肽部分包含(b4)基序或由其組成，并且由包含或 組成為SEQ ID NO :21、128、143的序列代表。更優選的抑制劑由包含SEQ ID NO :143或由 其組成的序列代表。甚至更優選的抑制劑包含SEQ ID NO :21或由其組成，其中C-末端已 通過添加酰胺而被修飾。該抑制劑是優選的，因為已證明它在體內動物模型中表現出顯著 的抑制活性(參見實施例10)。本發明優選的化合物在它們的(bl)基序中具有兩個D殘基。相應的肽的序列包 含G/S/T-D-Q-D-G/S或由其組成。本發明其他優選的化合物在它們的(b2)基序中具有兩個D殘基。相應的肽序列 包括 H/K/F/L/W-D- Ω -D-H/Y/F/W 或由其組成。更優選的化合物是那些在表4、5、9或10的任一個中被鑒定出來的肽序列(參見 這些表中的所有肽序列，除了用作對照的Ll和L2之一。在該表的每個肽序列中，為了獲得 如上定義的本發明的相應抑制劑，應將R取代為Ω。更優選的化合物是那些在表11、12或15的任一個中被鑒定出來的化合物(除了 來自用作對照的L2的一個化合物)。表15的抑制劑由SEQ IDNO :107-111代表。優選的 抑制劑包含或包括SEQ ID NO: 107-111。每個這些化合物已被明確表征為PAD2和/或PAD4抑制劑。本發明的化合物包含至少約5個但不多于約35個，優選不多于約25、20、15、10、 9、8、7個氨基酸的肽部分，能與PAD酶相互作用，并且其親和力(Km)可以為InM到ImM，優 選為InM到100 μ M，優選為InM到10 μ Μ。在本發明中，我們明確地證實了 7個氨基酸的長 度足以賦予化合物特異性(只有PAD酶，優選PAD2和/或PAD4可以被抑制而其他酶類不 行)并且是有效的PAD2和/或PAD4抑制劑。這種長度是非常有吸引力的，因為這類化合 物可以很容易地被化學合成。因此，本發明的化合物包含至少約5個但不多于約35個，優 選不多于約 34、33、32、31、30、四、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、 12、11、10、9、8、7個氨基酸的肽部分，并且該化合物可以與本文所定義的PAD酶相互作用。 優選的化合物包含肽部分，所述肽部分包含7個氨基酸的長度。本文描述了肽序列，其從左 向右閱讀，氨基(N-)末端位于左側，而羧基(C-)末端位于右側。親電子基團本發明的化合物優選包含親電子基團，更優選巰基活性親電子基團，任選地通過 間隔子部分連接于肽部分。親電子基團是具有低電子密度的部分(也稱為親電體)，其能與 另一種具有高電子密度的部分(也稱為親核體)反應。在本文中，具有低電子密度的部分 可以表示，該部分具有比有高電子密度部分低的電子密度。因此，帶有高電子密度的部分可 以表示其是帶有比具有低電子密度部分更高的電子密度的部分。本申請的巰基活性親電子 基團優選氟脒(fluoroamidine)或氯脒(chloroamidine)的結構和性質是這樣的在室溫 下(或在37°C下)抑制劑的巰基活性親電子基團和PAD酶的活性中心之間的化學反應是可 能的，從而產生共價偶聯的酶-抑制劑復合物。親電子基團或優選巰基活性親電子基團，優選由如在本發明的化合物中鑒定出來 的氨基酸Ω攜帶。Ω可以是任何氨基酸。Ω可以是修飾的氨基酸。預期本發明的化合物能與PAD酶相互作用，優選PAD2和/或PAD4，并且優選但不限于能通過與PAD酶的催化位 點(或裂口)上的半胱氨酸殘基的巰基部分相互作用或結合而抑制它們的活性。該抑制已 經在本申請的實例中被廣泛證實。巰基活性親電子基團或親電子基團或親電子阱(electrophilic trap)任選地通 過間隔基團或部分與分子的肽部分相連，并且可以是本領域已知的可以被技術人員輕易選 出的任何巰基活性親電子基團。在下文中，巰基活性親電子基團是指，在生理學PH值的水 溶液條件下能與巰基(SH)基團尤其是半胱氨酸的巰基基團形成共價鍵的任何基團。優選 地巰基活性親電子基團選自鹵甲基酮、α，β -不飽和酮、α，β -不飽和酯、α，β -不飽和 砜、α，β -不飽和酰胺、α ,β-不飽和磺胺、α ,β-不飽和氰、乙烯基膦酸酯、乙烯基膦酸、 環乙亞胺、馬來酰亞胺、二氮甲基酮、環氧化物和脒的基團。在更優選的實施方案中，巰基活性或親電子基團是鹵脒基團。在本文中術語鹵脒 是指擁有結構元件-NH-C( = NH)-CH2-X的基團，其中X是鹵素。因此，O(FA)或氟脒是指 帶以下側鏈的氨基酸-CH2-CH2-CH2-NH-C( = NH)-CH2-F,并且O(CA)或氯脒是指帶以下側 鏈的氨基酸-CH2-CH2-CH2-NH-C( = NH)-CH2-Cl0鹵脒基團可以是氟脒、氯脒、碘脒或溴脒。 用氟脒可獲得最佳結果。在更優選的實施方案中，巰基活性親電子基團由本文所鑒定的氨基酸Ω攜帶。最 優選地，Ω是鳥氨酸。因此，在最優選的化合物中，鳥氨酸攜帶親電子基團或阱，該親電子基 團或阱是鹵脒基團，該鹵脒基團是氟脒、氯脒、碘脒或溴脒。甚至更優選的為這樣的化合物， 其中所述鳥氨酸攜帶氟脒或氯脒。最優選的是這樣的化合物，其中所述鳥氨酸攜帶氟脒。技術人員將間隔子連接于肽上是其工作范圍，例如將間隔子偶聯于肽上常見的羧 酸、羥基、巰基和胺基團上是常規的工作。通常游離的胺基團是非常適合連接間隔子。同樣 將間隔子偶聯于親電子基團，優選將間隔子偶聯于能與巰基反應的巰基活性親電子基團， 將僅僅包含常規實驗，并且在這此不需要進一步詳述。將本發明的PAD抑制性分子的肽部分連接于親電子基團，優選連接于巰基活性親 電子基團的間隔子，可以代表一種連接基團，該基團由含有1-12個碳原子的線性的或分支 的、飽和的或(多)不飽和的鏈組成；其中任選地，4-6個原子一起可形成飽和的環或芳香 環；和/或其中任選地，1-6個原子可能已被1-4個N-、0-或S原子或其組合取代。更優選 地，間隔子是由含有3-8個碳原子的分支的或線性的飽和或(多)不飽和的鏈組成；其中任 選地，4-6個原子一起可形成飽和的環或芳香環；和/或其中任選地，1-3個原子可能已被 1-3個N-、0-或S原子或其組合替代。在優選的實施方案中，肽骨架和親電子阱或親電子基團或巰基活性親電子基團之 間的間隔子是包含3-6個碳原子的線性飽和的脂肪鏈。為了確保能在體外和體內抑制PAD活性的本發明分子的足夠的半衰期，分子的肽 部分優選被修飾從而確保生物降解性降低和生物有效性足夠。或者肽可以被環化從而避免 例如肽酶在末端降解。同樣，非自然存在的氨基酸和/或通常不存在于人體內的氨基酸， 或肽擬似物，可以用于分子的肽部分，來阻止降解和/或增強化學或生物穩定性和生物有 效性。PAD抑制性分子的肽部分可以包含D-氨基酸、β-氨基酸、α-甲基氨基酸和/或 α -烯基氨基酸，從而在給予待治療的個體化合物后，阻止、延緩或抑制生物降解。肽部分的C-或N-末端的修飾
在本發明的化合物中，可以用保護基團修飾或延伸肽的羧基末端，保護基團可防 止酶促降解和/或提高在水溶液中的化學穩定性和/或可溶性。本發明的化合物可以包含 C-末端保護基團，該基團是線性的或分支的烷基、芳香基或烷基芳香基基團，任選地含有 N、0、S或鹵素取代的部分，總共包含3到約25個原子。優選地，C-末端保護基團選自以下基團NH2、NH-NH2、NffiV8、NH-Mffin CH2CN、隊-8、 O-RnCHUnCR^IVJUNRhRH和CH2-NIV8IV8,其中對于每個隊_8，獨立地選擇如下所 述的隊到化之一，并且其中-R1代表含有1-12個碳原子的分支的或線性的飽和或(任選多)不飽和的鏈；-R2代表含有1-12個碳原子的烷基基團，其中4-8個碳原子形成環狀部分；-R3代表隊或R2，其中多達1-4個碳原子已被N-、0_或S-原子或其組合取代；-R4代表含有6-12個成環碳原子的芳香基、雙芳香基或融合的芳香基基團；- 代表R4，其中1-4個碳原子已被N-、0-或S-原子或其組合取代；- 代表烷基芳香基基團，其中烷基部分是線性的、分支的或環狀的，并且由1-6個 碳原子組成，而芳香基部分由6個碳原子組成；-R7代表&，其中烷基部分的1-3個原子和/或芳香基部分的1-4個原子已被N-、 0-或S-原子或其組合取代；并且，-R8代表被1-4個另外的取代基取代的隊到R7,該取代基選自以下基團(C1-C6) 烷基、(C3-C6)環烷基、(C1-C6)烯基、(C1-C6)炔基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)硫代烷氧基、硝 基、鹵素和帶有4-6個成環原子的雜環基團，該成環原子中1-5個是碳原子而1-3個是N-、 0-或S-原子或其組合。本發明的化合物的肽部分也可以在肽的氨基末端受到保護。可以用保護基團修飾 或延伸肽的氨基末端，其中N-末端保護基團可以是線性的或分支的烷基、芳香基或烷基芳 香基基團，任選地含有N、0、S或鹵素取代的部分，總共包含3到約25個原子。優選地，N-末 端保護基團選自以下基團=I^8-C(O)、I^8-O-C(O)、隊_8，IV8-SO2，或可以存在相同或不同的 兩個這類保護基團中，其中對于每個IV8，獨立地選擇如下所述的R1到&之一，其中-R1代表含有1-12個碳原子的分支的或線性的飽和或(任選多)不飽和的鏈；-R2代表含有1-12個碳原子的烷基基團，其中4-8個碳原子形成環狀部分；-R3代表Rl或R2，其中多達1_4個碳原子已被N-、0_或S-原子或其組合取代；-R4代表含有6-12個成環碳原子的芳香基、雙芳香基或融合的芳香基基團；優選 R4-SO2或2-萘磺酰基基團，其中R4是帶有10個碳原子的芳香基基團(例如，萘基)；- 代表R4，其中1-4個碳原子已被N-，0_或S-原子或其組合取代；- 代表烷基芳香基基團，其中烷基部分是線性的、分支的或環狀的，并且由1-6個 碳原子組成，而芳香基部分由6個碳原子組成；-R7代表&，其中烷基部分的1-3個原子和/或芳香基部分的1-4個原子已被N-、 0-或S-原子或其組合取代；并且，-R8代表被1-4個另外的取代基取代的隊到R7,該取代基選自以下基團(C1-C6) 烷基、(C3-C6)環烷基、(C1-C6)烯基、(C1-C6)炔基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)硫代烷氧基、硝 基、鹵素和帶有4-6個成環原子的雜環基團，該成環原子中1-5個是碳原子而1-3個是N-、 0-或S-原子或其組合。
作為優選的實施方案，本發明的化合物是這樣的，用乙酰基基團修飾肽序列的 N-末端被和/或將C-末端修飾為酰胺。發現這些化合物作為抑制劑的穩定性得到提高。作為另一個優選實施方案，本發明的化合物是這樣的，通過添加2-萘磺酰基基團 修飾肽序列的N-末端。這類化合物有引人注目的特性，因為它們作為抑制劑的穩定性得到 提高，并且出人意料地發現它們作為PAD2和PAD4的抑制劑抑制活性或效力得到改善(參 見實施例9)。本發明優選的化合物包含肽部分，所述肽部分包含或組成為實施例9的表23 所鑒定的序列SEQ ID NO 115或119。作為另一個優選實施例，本發明的化合物是這樣的，通過添加D-氨基酸修飾肽序 列的C-末端。這類化合物有引人注目的特性，因為它們作為抑制劑的穩定性得到提高，并 且出人意料地發現它們具有的抑制劑活性不受該修飾的影響(參見實施例9)。本發明的優 選的化合物包含肽部分，所述肽部分包含或組成為實施例9的表沈所鑒定的序列SEQ ID NO :120-127。作為更優選的實施例，本發明的化合物是這樣的，通過添加2-萘磺酰基基團修飾 肽序列的N-末端，并且通過添加D-氨基酸修飾肽序列的C-末端。本發明優選的化合物包 含肽部分，所述肽部分包含或組成為實施例9的表觀所鑒定的序列SEQ ID N0:U8-135。當存在幾個非極性氨基酸時肽部分可能會不充分溶解，為了提高肽部分的可溶 性，可以通過添加可溶性增強極性基團尤其是在肽部分的N-和/或C-末端，來修飾肽部 分。可溶性基團優選為位于肽部分的N-和/或C-末端和N或C末端的保護基團之間的間 隔子部分。在最優選的實施例中，可溶性基團代表帶有NH-(CH2-CH2-O-)m-(CH2)n-C(0)結構 的極性間隔子部分，其中m = 1-6而η = 0、1或2。 雖然PAD活性可在胞外空間被抑制，但是PAD的抑制也可以發生于胞內，例如抑制 組蛋白和其他底物的瓜氨酸化，例如來改變基因表達。為了促進或增強細胞攝取本發明的 PAD抑制性分子，在另一個實施方案中，抑制性肽分子可以融合于蛋白轉導結構域或細胞滲 透肽上。幾個蛋白和小肽具有轉導穿過生物膜的能力，而不依賴于典型的受體或內吞作用 介導的通路。這些蛋白的實例包括HIV-ITAT蛋白、單純皰疹病毒I(HSV-I)DNA結合蛋白 VP22和果蠅觸角足基因(Antp)同源轉錄因子。源自這些蛋白的小蛋白轉導結構域(PTDs) 可以融合于其他大分子、肽或蛋白，從而成功地將它們轉運到細胞內，包括本說明書的多肽 和修飾的多肽。轉導結構域的序列比對顯示了高堿性氨基酸含量(Lys和Arg)，這可以促進 這些區域與膜上帶負電荷的脂質相互作用。二級結構分析顯示所有這三個結構域之間沒有 一致的結構。本發明的化合物能在體外和/或體內、在胞內和/或胞外抑制PAD酶。PAD2和/ 或PAD4是最優選的，因為這些酶是參與自身免疫性相關瓜氨酸化過程的酶。組合物在另一個方面，本發明提供了包含本文所早先定義的化合物個至少一種賦形劑的 組合物，所述組合物優選為用于治療和/或預防優選人的自身免疫性病癥的藥物組合物或 藥物。所述組合物或化合物也可以用于延緩這類病癥的發展。自身免疫性病癥是這樣的 疾病，其中，免疫系統靶向內源性抗原，從而對組織造成損傷，異常的瓜氨酸化通常在個體 的免疫系統識別自身抗原中發揮作用。涉及本發明的化合物或組合物可以用于制備用來 治療或預防PAD相關的和/或瓜氨酸化相關的疾病或病癥或PAD惡化的疾病或病癥的藥物。尤其是，本發明的PAD抑制性化合物或組合物可以用于制備用于治療自身免疫性病癥 的藥物，所述自身免疫性病癥如但不限于RA、MS、牛皮癬、系統性紅斑狼瘡(SLE)、橋本氏甲 狀腺炎(Hashimoto’ s thyroiditis)、甲狀腺機能亢進(Graves，s disease)、系統性硬化 (硬皮病)、新生兒狼瘡綜合征、特發性炎性肌病、青少年慢性關節炎、牛皮癬關節炎、自身 免疫性肝炎、混合性結締組織病(MCTD)、干燥綜合癥(Sj0gren’s syndrome)和韋格納肉芽 月中(Wegener， s granulomatosis)。本發明的化合物可以用藥物可接受的賦形劑配制。因此本發明的組合物包含本發 明的化合物和至少一種賦形劑。配制適合于多種給藥模式(非腸道或口服)的藥物組合 物是在本領域內是已知的，并且在多種教科書中有所描述，如Remmington Pharmaceutical Sciences (雷明頓藥物學)，Mack publishing co.，1989。對于本發明給定的化合物，和/ 或對于待治療的自身免疫性病癥，和/或對于體內給藥/定位模式，可以適當調整藥物組合 物。可以優選的是，將藥物組合物或制劑中的本發明的PAD抑制性化合物與其他活性化合 物聯合，其他活性化合物如免疫抑制性試劑和/或炎癥抑制性試劑。可以與本發明的PAD 抑制性分子聯合使用的免疫抑制性化合物的優選實例是咪唑硫嘌呤(依木蘭(Imuran))、 環孢霉素(A)、巰基嘌呤(巰基嘌呤，6-MP)，炎癥抑制性試劑的優選實例是NSAIDs (非固醇 類抗炎藥物)或如強的松龍的皮質類固醇。在優選的實施方案中，本發明的藥物組合物是用于治療RA的組合物，并且是用于 非腸道優選局部給藥的諸如藥膏或存儲制劑(cbpository formulation)的組合物，其可局 部應用于發炎的關節。最優選的這類組合物包含賦形劑，該賦形劑允許經皮給予PAD抑制 性化合物，例如脂質體制劑。在另一個優選的實施方案中，本發明的組合物是用于治療RA 的組合物，并且是這樣的組合物，其用于通過注射到受RA侵襲的和/或發炎的關節，優選直 接注射到關節的滑液中，或任選地替換關節的滑液而非腸道優選局部給藥，單個劑量的每 次注射濃度為1 μ g到0. 1,0. 5、l、2、5、10mg，這取決于化合物的親和力和活性、個體關節的 大小和炎癥的嚴重性。然而，鑒于本發明抑制性分子或化合物的高特異性，預期會產生極少 副作用，并且通過口服攝取或靜脈內或肌肉內注射來進行PAD抑制劑的全身給藥是其他可 行的給藥途徑。尤其是，如前文所述，本發明的藥物可以用于治療和/或預防個體優選人的自身 免疫性疾病的方法中，并且最優選用于治療RA和MS的方法中。在本發明的內容中，待治療的生物或個體(individual)或個體(subject)可以是 動物或人類。優選地，生物是人類。優選地，被治療的生物體因為例如潛在的遺傳傾向和/ 或個體的年齡和/或個體的生活方式(例如營養習慣和/或缺乏身體活力)而疑似具有產 生諸如RA自身免疫性病癥的高風險性。術語“預防”應當理解為包括完全防止、預防以及降低個體患有上述疾病或情況的 風險。該術語也應當理解為包括緩解已經發生的癥狀。本文所用的術語“延緩”是指將化合物給予生物，即處于待治療的病癥前期的患 者，本領域已知的方法在該患者中診斷了相應病癥的前期形式(pre-form)。優選地，將疾病 癥狀的意外出現延緩至少數月至一年或更長。術語“治療(treatment)”或“治療(treating) ”被理解為為了抵抗疾病/病癥或 失調癥而管理以及護理病人。
本文所定義的本發明的每種化合物適用于預防、延緩和/或治療本文所定義的自 身免疫性病癥。因此在優選的實施例中，本發明的化合物或組合物用作本文早先所定義的藥物。在本公開及其權利要求書中，動詞“包含”及其詞形變化以其非限制性含義使 用，意指包括在該詞之后的項目，但是并不排除沒有特意提及的項目。此外，用不定冠 詞"a(—個)"或"an(—個)"提及要素并不排除該存在多于一個該要素的可能性，除 非文本中明確規定有一個并且只有一個該元素。因此不定冠詞"a"或"an"通常意指 “至少一個”。此外動詞“由……組成”可以用“主要由……組成”取代，意指除了所具體限定的 那些外，本文所定義的化合物或組合物還可以包含其他化合物，所述其他化合物不改變本 發明的獨特性質。在本發明的文本中，當在關于化合物的內容中使用時，單詞“約”(即約5 個氨基酸)意指有5-6個氨基酸。將本說明書所引用的所有的專利和文獻資料通過引用整體并入本文。以下實施例 僅為了例證性目的而提供，并非意圖以任何方式限制本發明的范圍。附圖簡要說明

圖1.將表達人PAD2或PAD4蛋白的C0S-1細胞的裂解液在IOmMCaCl2存在下于 37°C孵育30分鐘。裂解液中蛋白的瓜氨酸化可通過SDS-PAGE/western印跡觀察到，之后 修飾瓜氨酸殘基并且與抗修飾的瓜氨酸抗體一起孵育(1和4泳道)。使用Ra3 scFv抗體 (3和6泳道)和作為陰性對照0和5泳道)的無關的scFv (針對GST)，通過免疫親和純 化，從裂解液中分離瓜氨酸化蛋白。圖2.用鏈霉親和素堿性磷酸酶顯影的印跡通過SDS-PAGE凝膠電泳分析不同量的生物素化的抑制劑肽(生物素-Ahx-D-S-K -K-H-D-O(FA)-D-F-L-Y-S-D-酰胺，O(FA)=鳥氨酸氟脒，Ahx = 6-氨基己酸)和固定量的 His標記的PAD4的混合物。將蛋白轉移至PVDE膜上，并且用鏈霉親和素堿性磷酸酶結合物 顯影，隨后用NBT/BCIP可視化。在表18中對樣品進行了詳細說明。圖3.用小鼠抗His —抗、羊抗小鼠堿性磷酸酶二抗顯影的印跡。通過SDS-PAGE凝膠電泳分析不同量的生物素化的抑制劑肽(生物素-Ahx-D-S-K -K-H-D-O(FA)-D-F-L-Y-S-D-酰胺，O(FA)=鳥氨酸氟脒，Ahx = 6-氨基己酸)和固定量的 His標記的PAD4的混合物。將蛋白轉移至PVDE膜上并且用小鼠抗His抗體作用，隨后用羊 抗小鼠堿性磷酸酶結合物顯影，之后用NBT/BCIP可視化。在表18中對樣品進行了詳細說 明。圖4.通過比色測定使用DAMO和安替比林來修飾苯甲酰瓜氨酸乙酯，確定多種化 合物抑制所述的PAD將苯甲酰精氨酸乙酯轉化為苯甲酰瓜氨酸乙酯的能力。在不存在任何 抑制性化合物的情況下，將BAEE的轉化設定為100%。圖5.該圖闡明所觀察到的 PAD 介導的肽 D-S-K-K-F-H-R-G-F-L-Y-S-D (0708-33， MH22+calc = 800. 39,MH3s+calc = 533. 93)轉化為其瓜氨酸變體(ΔΜ = 0. 98Da)的質譜數據。A 底物肽 D-S-K-K-F-H-R-G-F-L-Y-S-D (上圖)和被 PAD 100 % 轉化的產物肽 D-S-K-K-F-H-Cit-G-F-L-Y-S-D(下圖)的質譜。B :3+-信號的放大。
C :2+-信號的放大。圖6.使用膠原蛋白抗體誘發的關節炎(CALA)模型(MQR ；18. 101)測試PAD抑制 劑CXP5.7-011(SEQ ID NO 143)的治療效果。在第0天，用2，8mg抗膠原蛋白抗體腹腔注 射小鼠。在第3天，通過腹腔注射給予LPS(25 μ g/小鼠)。從第3天到第11天(除了第9 天)，每天給予抑制劑(含有20mM磷酸鈉的200 μ 1 PBS中的0. 5mg CXP5. 7-011)或作為 安慰劑的200 μ 1含有20mM磷酸鈉的PBS。每天對動物的炎癥程度進行評分直至第14天。 在每個時間點標記每個實驗組(5只小鼠)的平均關節炎評分。
實施例實施例1 基于天然底物的抑制劑已在蛋白水平上鑒定出PAD的多個底物。已證明，在體內尤其是蛋白中的精氨酸 可以轉化成瓜氨酸(Cit)，然而其他的精氨酸看起來是完全抵抗轉化為瓜氨酸。由這些觀 察報告來看，顯然精氨酸殘基的化學環境決定它的底物特性。為了研究在被PAD酶轉化的 精氨酸的周圍最常被發現的側翼氨基酸的特性，將編碼PAD2和PAD4的cDNA克隆入帶有編 碼VSV-G標簽的序列的真核表達載體pCI-NE0(Promega，Leiden, The Netherlands)的框 內。用產生的構建體轉染培養的C0S-1或HEK293細胞，并且通過免疫印跡，使用轉染48小 時后制備的細胞提取物和在兔子中產生的單特異性抗PAD抗血清來檢驗PAD在這些細胞中 的表達。結果顯示PAD2和PAD4在這些細胞中均有效表達。用抗修飾的瓜氨酸抗體(AMC) 分析這些細胞的提取物，在用修飾肽基瓜氨酸的試劑進行western印跡處理之后{Senshu et al.，1992}，如基于細胞中的低鈣濃度所預期的，表明未能測定到瓜氨酸化蛋白。為了使 細胞蛋白發生瓜氨酸化，將細胞在含有PH 7. 4的20mM Tris-HCl、10mMβ -巰基乙醇、IOOmM NaCl、10%甘油和無EDTA的蛋白酶抑制劑的緩沖液中裂解，隨后在添加氯化鈣至終濃度為 IOmM后，將裂解液于37°C孵育30分鐘。作為對照，在5mM EDTA存在的情況下平行孵育裂 解液。在用化學修飾混合物處理電轉移到增強的硝酸纖維素膜上的蛋白之后，用AMC抗體 進行的免疫印跡分析顯示，這一過程導致裂解液中多種細胞蛋白的鈣-和PAD-依賴性瓜氨 酸化(圖1)。重要的是，在針對不同PAD酶而獲得的瓜氨酸化蛋白形式中，觀察到差異，這表明 差異存在于PAD2和PAD4的底物特異性中。隨后，通過免疫親和純化，使用RA3單鏈抗體片 段(scFv)，將瓜氨酸化蛋白從細胞裂解液中分離出來，RA3單鏈抗體片段對瓜氨酸化表位 是特異性的{Raats et al.，2003}。在用胰蛋白酶消化純化的蛋白之后，通過串聯質譜確 定所得肽的氨基酸序列。基于質譜數據，鑒定含有瓜氨酸化殘基的肽。在源自表達PAD2和 PAD4的C0S-1細胞的蛋白中，分別鑒定出總共90和57種瓜氨酸化肽，從PAD2和PAD4的 HEK-293細胞材料中，分別獲得107和38種瓜氨酸化肽。在瓜氨酸化殘基的N-末端5個 殘基和C-末端5個殘基之間的每個位點的氨基酸頻率源自這些位點的組合序列并且在表 1中顯示。基于這些數據，合成PAD2-和PAD4-特異性的13-mer (單元單體)肽，其在中心 位置含有精氨酸(表幻。通過將這些肽與細菌表達的、His6標記的、IMAC純化的重組酶一 起孵育，之后用MALDI-T0F和ESI-Q-TOF質譜分析產物，研究人PAD2和PAD4酶將這些肽瓜 氨酸化的效率。這些肽瓜氨酸化的效率列于表2。91
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權利要求
1.能抑制PAD活性的化合物，包含肽部分和由氨基酸Ω攜帶的巰基活性親電子基團，其中(a)所述肽部分包含至少約5個氨基酸而不多于約20個氨基酸；(b)所述肽包含基序(bl)、(b2)、(b3)或(b4)中的至少一個 (bl)G/S/T-D/S-Ω-D/G/S-G/S(b2)H/K/F/L/ff-S/D/H-Ω-D/E-H/Y/F/ff (b3)Y/A/K/H/L-F/Y/H-Ω-N/G/H/Y-K/A/F (b4)Y-D/S-Ω-D/G/S-G/S 其中Ω代表攜帶巰基活性親電子基團的氨基酸(c)任選地所述肽序列的N-末端和/或C-末端是修飾的。
2.如權利要求1所述的化合物，其中所述巰基活性親電子基團是鹵脒基團，優選是氟 脒或氯脒。
3.如權利要求1或2所述的化合物，其中Ω是鳥氨酸。
4.如權利要求1-3中任一項所述的化合物，其中(bl)所定義的基序為G/S/ T-D-Q-D-G/S，和(b2)所定義的基序為 H/K/F/L/W-D-Ω-D-H/Y/F/W。
5.如權利要求1-3中任一項所述的化合物，其中所述基序是(b4)。
6.如權利要求1-5中任一項所述的化合物，其中所述肽序列包含7個氨基酸或由其組成。
7.如權利要求1-6中任一項所述的化合物，其中用乙酰基基團修飾所述肽序列的N-末 端和/或將所述C-末端修飾為酰胺。
8.如權利要求1-6中任一項所述的化合物，其中所述肽序列的N-末端通過添加2-萘 磺酰基基團來修飾和/或任選地所述C-末端通過添加D-氨基酸來修飾。
9.如權利要求1-7中任一項所述的化合物，其中所述肽序列包含或組成為在表4、5、9 或10中任一個中所鑒定的肽序列，即SEQ ID NO :47-71，92-106，其中R被Ω取代。
10.如權利要求1-9中任一項所述的化合物，其中化合物如在表11、12或15中任一 個中或實施例1中所鑒定的，除了源自對照肽序列L2的化合物，所述化合物優選包含或組 成為 SEQ ID NO :12-21,107-143，優選 20-21、120、122、127-143，更優選 20、21、127、128、 136-143，甚至更優選 138、141、142、143。
11.如權利要求1-8中任一項所述的化合物，其中所述肽部分包含或組成為實施例9中 的表28所鑒定的序列SEQ ID NO 128-1350
12.包含權利要求1-11中任一項所定義的化合物和至少一種賦形劑的組合物，優選所 述組合物適用于局部給藥，優選在關節注射或局部經皮給藥。
13.如權利要求12所述的組合物，還包含免疫抑制劑和/或炎癥抑制性試劑。
14.如權利要求1-11中任一項所述的化合物或權利要求12-13中任一所述的組合物， 作為藥物的用途，其中所述藥物優選用于預防、延緩和/或治療自身免疫性病癥，優選其中 所述自身免疫性病癥為RA。
15.如權利要求1-11中任一項所述的化合物或權利要求12-14中任一所述的組合物在 制備用于預防和/或治療自身免疫性病癥的藥物中的用途，優選其中所述自身免疫性病癥 為RA0
全文摘要
本發明涉及PAD抑制劑，其適宜用作抗自身免疫性疾病例如RA的藥物。
文檔編號A61K38/17GK102105486SQ200980129510
公開日2011年6月22日 申請日期2009年6月15日 優先權日2008年6月16日
發明者宙斯弗·瑪麗亞·亨德瑞克·拉茨, 弗勞瑞斯·佩特魯斯·約翰尼斯·澤歐德路斯·陸特耶斯, 格拉爾德烏斯·宙斯弗·瑪麗亞·普瑞京, 理查德·翰恩瑞克·布拉奧弗, 簡·沃特·德瑞杰福特 申請人:智拉力克斯公司, 莫迪奎斯特公司, 萊頓教學醫院