一種可以增大電子傳遞的融合蛋白及其應(yīng)用的制作方法

文檔序號(hào)：12054547閱讀：371來源：國(guó)知局

導(dǎo)航： X技術(shù)> 最新專利>有機(jī)化合物處理,合成應(yīng)用技術(shù)

本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種可以增大電子傳遞的融合蛋白與其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

由于化石燃料日益枯竭并且燃燒后造成環(huán)境污染，所以尋找清潔能源是解決問題的關(guān)鍵。氫能是所有的能源中能量密度最大的能量源，且燃燒后形成水，不會(huì)污染環(huán)境。特別是在當(dāng)今環(huán)境問題已經(jīng)嚴(yán)重影響人們的生活情況下，發(fā)展可再生和環(huán)境友好性能源是解決經(jīng)濟(jì)發(fā)展瓶頸的關(guān)鍵要素之一。在生產(chǎn)氫的過程中，利用生物產(chǎn)氫是不占用耕地、不消耗糧食，藻類生物利用無機(jī)物合成有機(jī)物并可以生產(chǎn)氫氣，被認(rèn)為是最具吸引力的獲得氫氣的方式之一。但是，其中需要解決的關(guān)鍵問題是有效提高藻類產(chǎn)H₂量。其中，魚腥藻7120(Anabaena sp.PCC 7120)是絲狀藍(lán)藻，是廣泛用于光合作用與產(chǎn)H₂的重要模式藻種。因此，研究魚腥藻7120產(chǎn)氫過程中的相關(guān)問題，能夠更好的獲得更多的H₂，也為其他生物的產(chǎn)氫提高提供理論基礎(chǔ)。

近年來，人們將基因工程在藻類中應(yīng)用來提高H₂量，在此過程中基因元件是重要的基礎(chǔ)。開發(fā)具有能夠提高藻類產(chǎn)H₂能力的新蛋白，不僅可以為工程藻株的設(shè)計(jì)提供可利用的基因元件，也可以對(duì)發(fā)展提高藻類產(chǎn)H₂的新方法提供依據(jù)，并對(duì)促進(jìn)藻類能源資源的可持續(xù)發(fā)展有重要價(jià)值。

固氮酶將氫質(zhì)子和電子生成H₂，但是由于固氮酶是以復(fù)合體形式存在，調(diào)控其酶的表達(dá)量是很難做到的，所以產(chǎn)氫階段如何改變細(xì)胞中電子的流向，使之更多的流向固氮酶獲得更高的H₂產(chǎn)量是藻類產(chǎn)氫研究的重中之重，目前大量研究多集中在胞內(nèi)電子傳遞鏈阻斷和產(chǎn)氫環(huán)境的研究上(比如加入電子傳遞抑制劑、刪除非目的電子傳遞鏈上關(guān)鍵基因或利用缺硫培養(yǎng)環(huán)境等等)。但是，產(chǎn)氫過程中的關(guān)鍵酶是固氮酶，本發(fā)明擬對(duì)固氮酶及其所涉及的電子傳遞路徑做相關(guān)修飾以便提高H₂的產(chǎn)量。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明發(fā)現(xiàn)將魚腥藻7120的Fd蛋白與nifH蛋白連接形成融合蛋白(FNET1蛋白)，能夠顯著生產(chǎn)更多的H₂。不囿于任何理論的，發(fā)明人推測(cè)FNET1蛋白可以做為電子傳遞的元件在細(xì)胞中行使功能，傳遞電子至固氮酶反應(yīng)中心，能夠與固氮酶其余亞基形成新的復(fù)合體，消耗電子和質(zhì)子生成氫氣，所以FNET1蛋白能夠在具有固氮酶的宿主中傳遞電子后生成H₂的作用。

本發(fā)明的目的是提供一種增大電子傳遞的融合蛋白及其應(yīng)用。

本發(fā)明所涉及的蛋白命名為FNET1，其氨基酸序列為SEQ ID No:2所示，含有鐵硫簇。此蛋白可人工合成，也可先合成其編碼基因再進(jìn)行生物表達(dá)得到。因此，編碼所述蛋白的核酸分子也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA；所述核酸分子也可以是RNA、hnRNA或tRNA等。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述核酸分子具體為核苷酸序列如SEQ ID No:1所示的DNA分子。

具體地，該DNA分子由1191個(gè)核苷酸組成，第1至1191位為ORF，編碼氨基酸如SEQ ID No:2所示的FNET1蛋白。

含有上述核酸分子的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

所述重組載體可為重組表達(dá)載體，也可為重組克隆載體。

所述重組表達(dá)載體可用現(xiàn)有的載體構(gòu)建。所述生物轉(zhuǎn)運(yùn)載體包括運(yùn)載質(zhì)粒，如pRL271、pRL277等或其它衍生載體(Javier et al.Role of a Microcin-C-like biosynthetic gene cluster in allelopathic interactions in marine Synechococcus，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，2013；Jeff et al.Reduction of conjugal transfer efficiency by three restriction activities of Anabaena sp.strain PCC 7120，J.Bacteriol.，1997)。使用所述基因構(gòu)建重組載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前加上一種增強(qiáng)型、組成型、組織特異性或誘導(dǎo)性啟動(dòng)子，例如銅離子啟動(dòng)子PpetE，光誘導(dǎo)啟動(dòng)子PpsbAII等等。此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建重組載體時(shí)，啟動(dòng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用重組載體進(jìn)行加工，加入具有抗抗生素的基因等，以便獲得轉(zhuǎn)化株。

本發(fā)明中，所述重組載體中啟動(dòng)所述fnet1基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子為銅離子誘導(dǎo)型啟動(dòng)子PpetE(在本文中有時(shí)也簡(jiǎn)寫為啟動(dòng)子P，例如在質(zhì)粒圖1中)。

更為具體的，所述構(gòu)建重組載體的起始載體是pRL271，最終的運(yùn)載質(zhì)粒是fnet1-pRL271。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述的重組克隆方法是SLIC。

所述表達(dá)盒有能夠啟動(dòng)所述fnet1基因表達(dá)的啟動(dòng)子，所述fnet1基因，以及轉(zhuǎn)錄終止序列組成。

所述FNET1蛋白，或所述核酸分子fnet1，或所述重組載體、表達(dá)盒或重組菌任一的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：

(a1)調(diào)控魚腥藻7120的產(chǎn)氫量；

(a2)電子傳遞鏈的重新構(gòu)建；

(a3)選育產(chǎn)氫量提高的魚腥藻7120種株。

在本發(fā)明中，所述調(diào)控魚腥藻7120的產(chǎn)氫量具體體現(xiàn)在：在所述魚腥藻7120體內(nèi)，若fnet1轉(zhuǎn)錄表達(dá)，則所述轉(zhuǎn)基因藻株的產(chǎn)氫量會(huì)被提高。

在上述獲得的陽性轉(zhuǎn)基因藻株中，將攜帶有fnet1基因(FNET1的編碼基因)的重組載體導(dǎo)入所述目的藻中，具體可為：通過三親結(jié)合轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化魚腥藻7120(Anabaena sp.PCC 7120)細(xì)胞，從而獲得魚腥藻7120的FNET1過表達(dá)藻株。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種電子傳遞鏈修改的方法。因?yàn)镕NET1蛋白含有鐵硫簇，為電子載體，可以傳遞電子。電子從光系統(tǒng)I被FNET1接收后直接傳遞至固氮酶反應(yīng)中心。

本發(fā)明所提供的修改電子傳遞鏈的方法，包括如下步驟：

a)將本發(fā)明所述的FNET1蛋白的編碼基因?qū)媵~腥藻7120中獲得到轉(zhuǎn)基因魚腥藻7120藻株，并將其置于適合所述編碼基因轉(zhuǎn)錄、表達(dá)的條件下；和

b)從步驟a)所得轉(zhuǎn)基因藻株中選出與野生型魚腥藻7120藻株相比產(chǎn)氫量提高的轉(zhuǎn)基因陽性藻株。

在此基礎(chǔ)上，可通過如下步驟驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因藻株的產(chǎn)氫量是由于FNET1蛋白的作用所引起：

c)將步驟b)獲得的陽性轉(zhuǎn)基因魚腥藻7120藻株和野生型同時(shí)放置于缺銅培養(yǎng)基中培養(yǎng)；和

d)當(dāng)所述藻株生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期，光厭氧條件下測(cè)定H₂產(chǎn)量。

如野生型與轉(zhuǎn)基因藻株的產(chǎn)氫量相當(dāng)，則證明轉(zhuǎn)基因藻株的產(chǎn)氫量是由于FNET1蛋白的作用所引起的。

上述獲得的陽性轉(zhuǎn)基因藻株中，其細(xì)胞內(nèi)的電子傳遞鏈?zhǔn)潜恍薷牡?，F(xiàn)NET1可以接受PSI的電子直接傳遞到反應(yīng)中心生成H₂。

所述FNET1蛋白的編碼基因具體可通過含有所述FNET1蛋白的編碼基因的重組載體導(dǎo)入所述目的魚腥藻中或整合至基因組上，并且所述FNET1蛋白的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)是受銅離子誘導(dǎo)，所以在有銅離子的環(huán)境中，轉(zhuǎn)基因株氫氣的產(chǎn)量是高于野生株。當(dāng)所述轉(zhuǎn)基因株放置于缺銅培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，啟動(dòng)子是不工作的，所以在缺少銅離子的培養(yǎng)環(huán)境中，F(xiàn)NET1蛋白不被表達(dá)，產(chǎn)H₂總積累量與野生型相當(dāng)，從而說明提高H₂的產(chǎn)量是FNET1的作用。

附圖說明

圖1為pPT27質(zhì)粒示意圖。

圖2為fnet1-pPT27質(zhì)粒構(gòu)建示意圖，箭頭方向代表著基因的轉(zhuǎn)錄方向。

圖3為SLIC克隆方法構(gòu)建pPT27運(yùn)載質(zhì)粒的流程示意圖。

圖4為野生株和轉(zhuǎn)基因藻株的產(chǎn)氫積累量圖。其中wt代表野生型魚腥藻7120；FNET1代表轉(zhuǎn)基因株。

圖5為野生株和轉(zhuǎn)基因藻株培養(yǎng)在缺銅環(huán)境中光誘導(dǎo)條件下，測(cè)定的產(chǎn)氫積累量。

圖6a和6b分別為野生株和轉(zhuǎn)基因藻株在誘導(dǎo)產(chǎn)H₂階段，反應(yīng)中心亞基nifD和nifK的轉(zhuǎn)錄量變化。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

魚腥藻7120(Anabaena sp.PCC 7120，簡(jiǎn)稱野生型藻株或wt株)，從中科院水生所購(gòu)得。

三親結(jié)合轉(zhuǎn)化的初始質(zhì)粒RP4或pIncP、pRL623、pRL271由Wolk教授提供。

下述實(shí)施例中所用的培養(yǎng)基：

(1)BGII₀培養(yǎng)基：NaCl 1.03g/L，K₂HPO₄ 0.04g/L，MgSO₄ 0.075g/L，CaCl₂·2H₂O 0.036g/L，檸檬酸0.006g/L，檸檬酸鐵0.006g/L，Na₂EDTA 0.001g/L，Na2CO3 0.02g/L，A₅液(A₅液:H₃BO₃ 2.86g/L，MnCl₂·4H₂O 1.81g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.222g/L，Na₂MoO₄·H₂O 0.39g/L，CuSO4·5H₂O 0.079g/L，Co(NO₃)₂·6H₂O 0.0494g/L)1mL,pH為8.0。

(2)固體BGII₀培養(yǎng)基：在BGII₀培養(yǎng)基中加入1.5％的瓊脂粉。

(3)缺銅BGII₀培養(yǎng)基：NaCl 1.03g/L，K₂HPO₄ 0.04g/L，MgSO₄ 0.075g/L，CaCl₂·2H₂O 0.036g/L，檸檬酸0.006g/L，檸檬酸鐵0.006g/L，Na₂EDTA 0.001g/L，Na2CO3 0.02g/L，A₅液(A₅液:H₃BO₃ 2.86g/L，MnCl₂·4H₂O 1.81g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.222g/L，Na₂MoO₄·H₂O 0.39g/L，F(xiàn)eSO4·7H₂O 0.088g/L，Co(NO₃)₂·6H₂O 0.0494g/L)1mL,pH為8.0。

下述實(shí)施例中，關(guān)于作為實(shí)驗(yàn)材料的魚腥藻7120的培養(yǎng)具體如下：配制培養(yǎng)基溶液，121℃高溫滅菌20min。待培養(yǎng)基溫度降至室溫后再使用，用接種針從固體培養(yǎng)基上挑取單克隆至液體培養(yǎng)基中光照培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度是30度。固體培養(yǎng)時(shí)，將單克隆轉(zhuǎn)到固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)。

實(shí)施例一魚腥藻7120FNET1基因的獲得

1.魚腥藻7120總DNA提取

100mg材料，加入1mL預(yù)熱CTAB提取液(100mmol/L Tris，100mmol/L EDTA，1.4mol/L NaCI，2％CTAB)，使用前加入2％β巰基乙醇和0.1ml玻璃珠用震蕩器破碎，隨后65℃水浴l h，其間每隔5min振蕩混勻。加入等體積的苯酚-氯仿-異戊醇(25:24:1)混合振蕩20min，10000rpm離心10min，取上清，加入0.35倍體積的無水乙醇和0.2體積的5mol/L的KAc混勻，離心后取上清加入半體積異丙醇，-20℃冷凍30min，10000rpm離心10min，吹干后加入400μM NaCl和1.5μl RNase，37℃水浴30min消解RNA。加入預(yù)冷的無水乙醇沉淀，-20℃靜置10min后離心，沉淀用70％酒精洗滌，晾干后溶于200μl TE中。

2.FNET1基因序列的擴(kuò)增

以步驟一提取的總DNA為模板，分別使用片段一上下游引物和片段二上下游引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)程序：98℃預(yù)變性5分鐘；98℃變形10s，60℃退火15s，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。引物由生工生物工程股份有限公司合成，序列如下:

片段一上游引物：

CAGGTTAGGAGAACGCCGTCGACATGGCTAGCTACCAAGTTAG(SEQ ID No:9)

片段一下游引物：

CTAATGTTTTCGTCAGTCATGGTACCAGCAAGGTACGGTTCTTG(SEQ ID No:10)

片段二上游引物：

GGTACCATGACTGACGAAAACATTAG(SEQ ID No:11)

片段二下游引物：

CCAATATTTTAATGATTTCAAGTCTAGACTATTTGGTAGCTTCTGCGG(SEQ ID No:12)

將通過上述PCR得到的片段一和片段二利用融合PCR的方法(將上述片段一和片段二在95度變性30秒，再迅速降低至55度15秒，72度延伸1分45秒，并做30個(gè)循環(huán)回收)連接為一個(gè)片段，即fnet1，并連接至T載體上進(jìn)行序列測(cè)序?qū)嶒?yàn)，測(cè)序結(jié)果為SEQ ID No：1。

實(shí)施例二轉(zhuǎn)基因藻株的獲得

1.通用運(yùn)載質(zhì)粒的構(gòu)建

使用以下步驟構(gòu)建通用運(yùn)載質(zhì)粒pPT27：

A.使用限制性內(nèi)切酶XhoI酶切含有蔗糖致死基因的載體質(zhì)粒pRL271，使其線性化并回收片段；

B.從魚腥藻7120基因組DNA擴(kuò)增同源重組雙交換上游片段(SEQ ID No:5)、下游片段 (SEQ ID No:6)和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子P(SEQ ID No:7)，從質(zhì)粒kan-pUC19中擴(kuò)增篩選抗性基因kan(SEQ ID No:8)；

C.將步驟B獲得的同源重組雙交換片段上游片段、下游片段、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子P和篩選抗性基因kan及線性pRL271連接獲得pPT27質(zhì)粒(SEQ ID No:3，見圖1)。

2.穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建

使用前述構(gòu)建的通用運(yùn)載質(zhì)粒pPT27，利用SLIC的方法獲得最后的穿梭運(yùn)載質(zhì)粒fnet1-pPT27(SEQ ID No:4，見圖2和圖3)。

3.轉(zhuǎn)基因藻株的獲得

使用先前文獻(xiàn)記載的方法，將前述獲得的穿梭運(yùn)載質(zhì)粒fnet1-pPT27以及幫助質(zhì)粒pRL623和結(jié)合質(zhì)粒pIncP與野生型魚腥藻7120共培養(yǎng)，2～3周獲得轉(zhuǎn)化子，之后液體擴(kuò)培。

4.驗(yàn)證整合情況

利用以下引物對(duì)：

上游引物：

GCAGAAATTCGATATCTAGATCTCGAGTCTTCCTGTAAACGGTATGG(SEQ ID No:13)

下游引物：

GGCGGACGGGAAGTATCCAGCTCGAGGTATGAGACTTATGACAAACCC(SEQ ID No:14)通過PCR擴(kuò)增檢測(cè)藻株的整合情況。當(dāng)轉(zhuǎn)化子所擴(kuò)增的片段大于野生型擴(kuò)增片段時(shí)，說明整合成功。然后提取野生株和轉(zhuǎn)基因株的總蛋白，使用NifH抗體鑒定蛋白的表達(dá)情況以再次確認(rèn)。

實(shí)施例三藻株產(chǎn)氫量的檢測(cè)

以實(shí)施例2獲得的FNET1轉(zhuǎn)基因藻和野生型分別在BGII₀培養(yǎng)基和缺銅BGII₀培養(yǎng)基上培養(yǎng)，測(cè)定各藻株和在各條件下的產(chǎn)氫量和葉綠素含量(測(cè)定方法請(qǐng)參見Improving conversion efficiency of solar energy to electricity in cyanobacterial PEMFC by high levels of photo-H 2production，International Journal of Hydrogen Energy，2013)。

結(jié)果顯示，F(xiàn)NET1蛋白的表達(dá)可以顯著提高H₂的產(chǎn)量，H₂的產(chǎn)量被提升了3.9倍(圖3)。由于FNET1含有鐵硫簇，可以轉(zhuǎn)移電子，將電子直接轉(zhuǎn)移至固氮酶反應(yīng)中心，進(jìn)而修改電子傳遞鏈。當(dāng)野生型和轉(zhuǎn)基因藻株培養(yǎng)在缺銅培養(yǎng)基生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期，在光厭氧條件下測(cè)定產(chǎn)氫積累量，結(jié)果揭示野生株和轉(zhuǎn)基因藻株產(chǎn)氫總量相同(圖4)。這說明FNET1蛋白在魚腥藻7120產(chǎn)氫過程中起著重要的角色。在產(chǎn)氫階段，檢測(cè)固氮酶反應(yīng)中心亞基的轉(zhuǎn)錄量可以反映出潛在產(chǎn)氫能力的變化，通過實(shí)驗(yàn)證明在轉(zhuǎn)基因藻株中nifD和nifK的轉(zhuǎn)錄量是增大的(圖 5)。

分析產(chǎn)氫提高的原因，由于FNET1含有鐵硫簇，并且會(huì)接收來自光合系統(tǒng)I傳遞的電子，所以修改了胞內(nèi)的電子傳遞量。在產(chǎn)氫過程中，分析野生型和轉(zhuǎn)基因株中固氮酶核心亞基nifD/nifK的轉(zhuǎn)錄量變化時(shí)發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)基因藻株中，二個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄是被提高的。

實(shí)施例四藻株中糖原的含量

當(dāng)藻株生長(zhǎng)OD₇₅₀至0.5、0.85、1.1時(shí)收集細(xì)胞，加入5％H₂SO₄沸水浴處理30min。10000rpm離心后，過濾除雜質(zhì)，HPLC測(cè)定葡萄糖含量。這一過程中需要測(cè)定葉綠素含量。

結(jié)果顯示，表達(dá)FNET1蛋白的轉(zhuǎn)基因株中含有的糖原的量要高于野生株。nifH的調(diào)節(jié)是受光照影響，而fnet1序列也含有這一受調(diào)控的功能域。在藻絲體生長(zhǎng)階段，并至OD₇₅₀約為0.85時(shí)，nifH的轉(zhuǎn)錄量是所受影響的是有限，而Fd的轉(zhuǎn)錄量是增大的，說明增大了流向碳循環(huán)的電子，使糖原的含量增加(表1)。這說明FNET1蛋白在整個(gè)電子傳遞鏈中起著不可忽視的作用，無論是光發(fā)酵產(chǎn)氫階段或是藻體生長(zhǎng)階段。

表1.野生株和轉(zhuǎn)基因藻株在生長(zhǎng)階段的糖原含量變化

SEQUENCE LISTING

<110> 清華大學(xué)

<120> 一種可以增大電子傳遞的融合蛋白及其應(yīng)用

<130> 20161213-2

<160> 14

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1191

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggctagct accaagttag attgatcaac aagaaacaag acatcgatac taccatcgag 60

attgatgaag aaaccacaat tttagatggc gcagaagaaa atggtattga attacctttc 120

tcttgccatt ctggttcttg ttctagctgt gtaggcaaag ttgttgaagg tgaagttgac 180

caatctgatc aaatcttctt agatgatgaa cagatgggta aaggcttcgc tctactttgt 240

gttacttacc ctcgttccaa ctgcacaatt aagacccacc aagaaccgta ccttgctggt 300

accatgactg acgaaaacat tagacagata gctttctacg gtaaaggcgg tatcggtaaa 360

tctaccacct cccaaaacac ccttgcagct atggcagaaa tgggtcaacg catcatgatt 420

gtaggttgcg accctaaagc tgactccacc cgtctgatgc ttcactccaa agctcaaacc 480

accgtactac acttagctgc tgaacgcggt gcagtagaag acttagaact ccacgaagta 540

atgttgaccg gtttccgtgg cgttaagtgc gtagaatctg gtggtccaga acccggtgta 600

ggttgcgccg gtcgtggtat catcaccgcc attaacttct tagaagaaaa cggcgcttac 660

caagacctag acttcgtatc ctacgacgta ttgggtgacg ttgtatgtgg tggtttcgct 720

atgcctatcc gtgaaggtaa agcacaagaa atctacatcg ttacctctgg tgaaatgatg 780

gcgatgtatg ctgctaacaa catcgctcgc ggtattttga aatatgctca ctccggtggt 840

gtacgtttag gtggtttgat ctgtaacagc cgtaaggttg accgtgaaga cgagttaatc 900

atgaacttgg ctgaacgttt gaacacccaa atgattcact tcgtacctcg tgacaacatc 960

gttcaacacg cagaattgcg ccgtatgacc gttaacgagt acgcaccaga cagcaaccaa 1020

ggtcaagagt accgcgcatt agctaagaag atcatcaaca acgacaagct caccattcct 1080

acaccaatgg aaatggatga actagaagct ctgttgatcg aatacggtct attagacgac 1140

gacaccaagc actctgaaat catcggtaag cccgcagaag ctaccaaata g 1191

<210> 2

<211> 396

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Ala Ser Tyr Gln Val Arg Leu Ile Asn Lys Lys Gln Asp Ile Asp

1 5 10 15

Thr Thr Ile Glu Ile Asp Glu Glu Thr Thr Ile Leu Asp Gly Ala Glu

20 25 30

Glu Asn Gly Ile Glu Leu Pro Phe Ser Cys His Ser Gly Ser Cys Ser

35 40 45

Ser Cys Val Gly Lys Val Val Glu Gly Glu Val Asp Gln Ser Asp Gln

50 55 60

Ile Phe Leu Asp Asp Glu Gln Met Gly Lys Gly Phe Ala Leu Leu Cys

65 70 75 80

Val Thr Tyr Pro Arg Ser Asn Cys Thr Ile Lys Thr His Gln Glu Pro

85 90 95

Tyr Leu Ala Gly Thr Met Thr Asp Glu Asn Ile Arg Gln Ile Ala Phe

100 105 110

Tyr Gly Lys Gly Gly Ile Gly Lys Ser Thr Thr Ser Gln Asn Thr Leu

115 120 125

Ala Ala Met Ala Glu Met Gly Gln Arg Ile Met Ile Val Gly Cys Asp

130 135 140

Pro Lys Ala Asp Ser Thr Arg Leu Met Leu His Ser Lys Ala Gln Thr

145 150 155 160

Thr Val Leu His Leu Ala Ala Glu Arg Gly Ala Val Glu Asp Leu Glu

165 170 175

Leu His Glu Val Met Leu Thr Gly Phe Arg Gly Val Lys Cys Val Glu

180 185 190

Ser Gly Gly Pro Glu Pro Gly Val Gly Cys Ala Gly Arg Gly Ile Ile

195 200 205

Thr Ala Ile Asn Phe Leu Glu Glu Asn Gly Ala Tyr Gln Asp Leu Asp

210 215 220

Phe Val Ser Tyr Asp Val Leu Gly Asp Val Val Cys Gly Gly Phe Ala

225 230 235 240

Met Pro Ile Arg Glu Gly Lys Ala Gln Glu Ile Tyr Ile Val Thr Ser

245 250 255

Gly Glu Met Met Ala Met Tyr Ala Ala Asn Asn Ile Ala Arg Gly Ile

260 265 270

Leu Lys Tyr Ala His Ser Gly Gly Val Arg Leu Gly Gly Leu Ile Cys

275 280 285

Asn Ser Arg Lys Val Asp Arg Glu Asp Glu Leu Ile Met Asn Leu Ala

290 295 300

Glu Arg Leu Asn Thr Gln Met Ile His Phe Val Pro Arg Asp Asn Ile

305 310 315 320

Val Gln His Ala Glu Leu Arg Arg Met Thr Val Asn Glu Tyr Ala Pro

325 330 335

Asp Ser Asn Gln Gly Gln Glu Tyr Arg Ala Leu Ala Lys Lys Ile Ile

340 345 350

Asn Asn Asp Lys Leu Thr Ile Pro Thr Pro Met Glu Met Asp Glu Leu

355 360 365

Glu Ala Leu Leu Ile Glu Tyr Gly Leu Leu Asp Asp Asp Thr Lys His

370 375 380

Ser Glu Ile Ile Gly Lys Pro Ala Glu Ala Thr Lys

385 390 395

<210> 3

<211> 9733

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gctggctgtt ttacgcgtat gacaggctcc ggaagacggt tgttgcgcac gtattcggtg 60

aacgcactat ggcgacgctg gggcgtctta tgagcctgct gtcacccttt gacgtggtga 120

tatggatgac ggatggctgg ccgctgtatg aatcccgcct gaagggaaag ctgcacgtaa 180

tcagcaagcg atatacgcag cgaattgagc ggcataacct gaatctgagg cagcacctgg 240

cacggctggg acggaagtcg ctgtcgttct caaaatcggt ggagctgcat gacaaagtca 300

tcgggcatta tctgaacata aaacactatc aataagttgg agtcattacc aaaaggttag 360

gaatacggtt agccatttgc ctgcttttat atagttcata tgggattcac ctttatgttg 420

ataagaaata aaagaaaatg ccaataggat atcggcattt tcttttgcgt ttttatttgt 480

taactgttaa ttgtccttgt tcaaggatgc tgtctttgac aacagatgtt ttcttgcctt 540

tgatgttcag caggaagctt ggcgcaaacg ttgattgttt gtctgcgtag aatcctctgt 600

ttgtcatata gcttgtaatc acgacattgt ttcctttcgc ttgaggtaca gcgaagtgtg 660

agtaagtaaa ggttacatcg ttaggatcaa gatccatttt taacacaagg ccagttttgt 720

tcagcggctt gtatgggcca gttaaagaat tagaaacata accaagcatg taaatatcgt 780

tagacgtaat gccgtcaatc gtcatttttg atccgcggga gtcagtgaac aggtaccatt 840

tgccgttcat tttaaagacg ttcgcgcgtt caatttcatc tgttactgtg ttagatgcaa 900

tcagcggttt catcactttt ttcagtgtgt aatcatcgtt tagctcaatc ataccgagag 960

cgccgtttgc taactcagcc gtgcgttttt tatcgctttg cagaagtttt tgactttctt 1020

gacggaagaa tgatgtgctt ttgccatagt atgctttgtt aaataaagat tcttcgcctt 1080

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ctacgtagtg aggatctctc agcgtatggt tgtcgcctga gctgtagttg ccttcatcga 1200

tgaactgctg tacattttga tacgtttttc cgtcaccgtc aaagattgat ttataatcct 1260

ctacaccgtt gatgttcaaa gagctgtctg atgctgatac gttaacttgt gcagttgtca 1320

gtgtttgttt gccgtaatgt ttaccggaga aatcagtgta gaataaacgg atttttccgt 1380

cagatgtaaa tgtggctgaa cctgaccatt cttgtgtttg gtcttttagg atagaatcat 1440

ttgcatcgaa tttgtcgctg tctttaaaga cgcggccagc gtttttccag ctgtcaatag 1500

aagtttcgcc gactttttga tagaacatgt aaatcgatgt gtcatccgca tttttaggat 1560

ctccggctaa tgcaaagacg atgtggtagc cgtgatagtt tgcgacagtg ccgtcagcgt 1620

tttgtaatgg ccagctgtcc caaacctcca ggccttttgc agaagagata tttttaattg 1680

tggacgaatc gaattcagga acttgatatt tttcattttt ttgctgttca gggatttgca 1740

gcatatcatg gcgtgtaata tgggaaatgc cgtatgtttc cttatatggc ttttggttcg 1800

tttctttcgc aaacgcttga gttgcgcctc ctgccagcag tgcggtagta aaggttaata 1860

ctgttgcttg ttttgcaaac tttttgatgt tcatcgttca tgtctccttt tttatgtact 1920

gtgttagcgg tctgcttctt ccagccctcc tgtttgaaga tggcaagtta gttacgcaca 1980

ataaaaaaag acctaaaata tgtaaggggt gacgccaaag tatacacttt gccctttaca 2040

cattttaggt cttgcctgct ttatcagtaa caaacccgcg cgatttactt ttcgacctca 2100

ttctattaga ctctcgtttg gattgcaact ggtctatttt cctcttttgt ttgatagaaa 2160

atcataaaag gatttgcaga ctacgggcct aaagaactaa aaaatctatc tgtttctttt 2220

cattctctgt attttttata gtttctgttg catgggcata aagttgcctt tttaatcaca 2280

attcagaaaa tatcataata tctcatttca ctaaataata gtgaacggca ggtatatgtg 2340

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attctttgtt aacccatttc ataacgaaat aattatactt ttgtttatct ttgtgtgata 2580

ttcttgattt ttttctactt aatctgataa gtgagctatt cactttaggt ttaggatgaa 2640

aatattctct tggaaccata cttaatatag aaatatcaac ttctgccatt aaaagtaatg 2700

ccaatgagcg ttttgtattt aataatcttt tagcaaaccc gtattccacg attaaataaa 2760

tctcattagc tatactatca aaaacaattt tgcgtattat atccgtactt atgttataag 2820

gtatattacc atatatttta taggattggt ttttaggaaa tttaaactgc aatatatcct 2880

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tatggtctat ttcaatggca gttacgaaat tacacctctt tactaattca agggtaaaat 3000

ggccttttcc tgagccgatt tcaaagatat tatcatgttc atttaatctt atatttgtca 3060

ttattttatc tatattatgt tttgaagtaa taaagttttg actgtgtttt atatttttct 3120

cgttcattat aaccctcttt aatttggtta tatgaatttt gcttattaac gattcattat 3180

aaccacttat tttttgtttg gttgataatg aactgtgctg attacaaaaa tactaaaaat 3240

gcccatattt tttcctcctt ataaaattag tataattata gcacgcgaat tcatcgaata 3300

aatacctgtg acggaagatc acttcgcaga ataaataaat cctggtgtcc ctgttgatac 3360

cgggaagccc tgggccaact tttggcgaaa atgagacgtt gatcggcacg taagaggttc 3420

caactttcac cataatgaaa taagatcact accgggcgta ttttttgagt tatcgagatt 3480

ttcaggagct aaggaagcta aaatggagaa aaaaatcact ggatatacca ccgttgatat 3540

atcccaatgg catcgtaaag aacattttga ggcatttcag tcagttgctc aatgtaccta 3600

taaccagacc gttcagctgg atattacggc ctttttaaag accgtaaaga aaaataagca 3660

caagttttat ccggccttta ttcacattct tgcccgcctg atgaatgctc atccggaatt 3720

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cgttttccat gagcaaactg aaacgttttc atcgctctgg agtgaatacc acgacgattt 3840

ccggcagttt ctacacatat attcgcaaga tgtggcgtgt tacggtgaaa acctggccta 3900

tttccctaaa gggtttattg agaatatgtt tttcgtctca gccaatccct gggtgagttt 3960

caccagtttt gatttaaacg tggccaatat ggacaacttc ttcgcccccg ttttcaccat 4020

gggcaaatat tatacgcaag gcgacaaggt gctgatgccg ctggcgattc aggttcatca 4080

tgccgtttgt gatggcttcc atgtcggcag aatgcttaat gaattacaac agtactgcga 4140

tgagtggcag ggcggggcgt aattttttta aggcagttat tggtgccctt aaacgcctgg 4200

tgctacgcct gaataagtga taataagcgg atgaatggca gaaattcgat atctagatct 4260

cgagtcttcc tgtaaacggt atggatcatt gcttcccatc aaatgcagtg tccaactctg 4320

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ttaattattc aagtaggaag cattctctta gaaatagata aagaacttgc tcgtaacatc 5040

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aaactggatg gctttcytgc cgccaaggat ctgatggcgc aggggatcaa gatctgatca 5460

aggagacagg atgaggatcg tttcgcatga ttgaacaagg tggattgcac gcaggttctc 5520

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acgcgcgagg cag 9733

<210> 4

<211> 10924

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4