本發明涉及有機熒光探針領域，具體涉及光學調控的細胞膜生化標記物探針庫及其在人類健康疾病檢測領域的應用。

技術背景

熒光探針是化學傳感技術領域在上個世紀八十年代的一項重大發現，目前己有愈來愈多的熒光探針應用于分子水平上進行實時檢測。熒光檢測技術由于靈敏度高，操作簡便，可視性強，且對細胞、生物體的損傷小，成為了用于臨床分析、環境監測、生物分析及生命科學等領域不可缺少的檢測工具分子熒光探針的檢測對象包括各種離子，小分子，自由基，多肽，酶，甚至還包括溫度，極性，粘度等。低分子量的探針與靶標分子相互作用時往往通過化學反應，靜電作用及間接作用力等方式來達到檢測靶標的目的。人們可以使用熒光顯微鏡，熒光光譜儀，流式細胞儀，熒光活體成像系統等儀器獲取熒光探針檢測的相關信息，借助熒光成像技術我們能夠實時檢測活細胞內分子或離子的濃度以及生物大分子結構的變化過程，也可以獲得關于生物組織生理代謝過程的相關信息，還可以實現生物活體的熒光成像。

無論是各種疾病的診斷和治療，還是對疾病發病機理的研究，都必須要借助于靈敏度高特異性強的檢測手段。熒光檢測特別是有機小分子熒光探針一方面具有靈敏度高，操作簡便的優點，另一方面研究者們能夠根據需要設計合成出滿足特定要求的探針分子，基于此，熒光探針和熒光檢測技術在生命科學的發展中起到舉足輕重的。

近年來，生命科學，環境科學，材料科學，生命醫學等學科的發展對熒光探針的性能提出了更高的要求。更高的靈敏度和選擇性，更低的檢測限，更高的準確度和精密度，更完善可信的形態分析，更快的分析速度和自動化程度，更小的樣品量，更好的生物相容性，微損或無損分析，活體，實時分析，分析器件小型化，微型化和智能化等。因此，開發出性能更為優良的熒光探針以便用于生物化學，分子生物學和細胞生物學的研究是一項緊迫而意義重大的工作。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種靈敏度高，操作簡便，可視性強，且對細胞，生物體的損傷小的熒光探針以及其具有高的細胞膜靶向性，光調控檢測和識別特異性強的光學調控的細胞膜生化標記物探針及其制備方法和應用。

為了解決上述其中一個技術問題提出的技術方案是：一種細胞膜生化標記物探針，所述的細胞膜生化標記物探針的結構式如下：

為了解決上述其中一個技術問題提出的技術方案是：一種如權利要求1所述的細胞膜生化標記物探針的制備方法，特異性錨定細胞膜熒光探針通過?；磻苽浼毎ど瘶擞浳锾结?，所述的特異性錨定細胞膜熒光探針結構式如下：

優選的，所述特異性錨定細胞膜熒光探針的制備方法具體步驟如下：

加入熒光素，膽固醇甲酰氯，熒光素和膽固醇甲酰氯摩爾比為1：1～1.8，三乙胺，無水n,n-二甲基甲酰胺，氯仿，通入氮氣，在-3～0℃下反應8～10h，產物處理：反應加入飽和食鹽水和乙酸乙酯萃取，重復萃取三次，柱層析，分別旋蒸，烘干封裝，得到黃色固體，產率為60％。

優選的，具體步驟如下：加入所述特異性錨定細胞膜熒光探針，水合肼，所述特異性錨定細胞膜熒光探針和水合肼的摩爾比為1：1～1.9，無水乙醇，通入氮氣，85～95℃加熱回流10～12h，產物處理：反應加入飽和食鹽水和乙酸乙酯萃取，重復萃取三次，柱層析，分別旋蒸，烘干封裝，得到淡黃色固體，產率為90％。

為了解決上述其中一個技術問題提出的技術方案是：一種光學調控的細胞膜生化標記物探針，所述光學調控的細胞膜生化標記物探針的結構式如下：

優選的，加入所述細胞膜生化標記物探針，1-(1-溴乙基)-2-硝基苯，所述細胞膜生化標記物探針和1-(1-溴乙基)-2-硝基苯的摩爾比為1：1～1.9，無水n,n-二甲基甲酰胺，碳酸銫，通入氮氣，45～60℃加熱6～8h，產物處理：反應加入飽和食鹽水和乙酸乙酯萃取，重復萃取三次，柱層析，分別旋蒸，烘干封裝，得到淡黃色固體，產率為50％。

為了解決上述其中一個技術問題提出的技術方案是：一種所述的細胞膜生化標記物探針的應用，所述細胞膜生化標記物探針可應用于環境監測和生物分析。

為了解決上述其中一個技術問題提出的技術方案是：一種所述的光學調控的細胞膜生化標記物探針的應用，所述光學調控的細胞膜生化標記物探針可應用于環境監測和生物分析。

有益效果：

本發明通過溴代反應，添加光保護基團，使得探針無法對周圍的生化標記物的檢測，增強探針可控檢測能力，等到探針全部錨定在細胞膜上，再通過紫外光照控制光保護基團的離去，探針才可以檢測周圍的生化標記物，這樣可以大大提高探針對細胞膜上生化標記物檢測的準確性。

本發明其結構特點主要是以熒光素為主體結構，膽固醇為細胞膜靶向基團，1-(1-溴乙基)-2-硝基苯或1-(1-溴乙基)-4,5-二甲氧基-2-硝基苯為光保護基團，熒光素酰肼為識別基團就可以得到光學調控的細胞膜生化標記物探針。本發明所說的具光學調控的細胞膜生化標記物探針庫，既含細胞膜靶向性的膽固醇單元又含特異性是別的單元和光保護單元，所述生化標記物為銅離子。所述光保護基團在波長為365nm的光照射十分鐘可以完全離去。所述的光學調控的細胞膜生化標記物探針的激發波長為488nm。

本發明的材料應用于人類健康或疾病的檢測，其中包括帕金森疾病，阿爾茲海默癥等等，可獲得高效的熒光成像圖。

附圖說明

下面結合附圖對本發明的作進一步說明。

圖1為化合物3在室溫下隨著銅離子濃度增加的熒光光譜。

圖2為化合物1在hepg2細胞中熒光成像圖。

圖3為化合物2在hepg2細胞中檢測細胞膜上銅離子的熒光成像圖。

圖4為化合物3在hepg2細胞中檢測細胞膜上銅離子的熒光成像圖。

圖5為化合物1的氫譜圖。

圖6為化合物2的氫譜圖。

圖7為化合物3的氫譜圖。

具體實施方式

為了更好地理解本發明，下面通過具體的實施例來具體說明本發明的技術方案。

實施例1：

特異性錨定細胞膜熒光探針，記為化合物1，結構式如下：

化合物1的制備步驟如下：

在25ml的圓底燒瓶中加入熒光素(100mg,0.30mmol)，膽固醇甲酰氯(135.15mg,0.30mmol)，三乙胺(0.042ml)，無水n,n-二甲基甲酰胺(4ml)，氯仿(1.5ml)，通入氮氣，在0℃下反應8h。產物處理：反應加入100ml飽和食鹽水和50ml乙酸乙酯萃取，重復萃取三次，柱層析，分別旋蒸，烘干封裝。得到黃色固體，產率為60％。¹hnmr(300mhz,cdcl3):δ＝8.03(d,j＝3hz,1h),7.63(m,2h),7.16(m,2h),6.67(m,5h),5.43(s,1h),4.62(dd,j1＝4.5hz,j2＝3hz,1h),2.51(d,j＝3hz,2h),2.23(m,1h),1.84(m,6h),1.51(m,6h),0.94(m,25h),0.69(s,3h)。在1.5ml離心管中加入hepg2細胞培養液(1ml)，化合物1(1mm，2μl)，細胞核染料(1mm，1μl)，細胞膜染料(1mm，1μl)，培養hepg2細胞0.5h，在共聚焦顯微鏡下觀察熒光成像圖，如附圖2所示。圖2-(1)表示細胞核成像圖，圖2-(2)表示化合物1錨定在細胞膜上的熒光暗場圖，圖2-(3)表示化合物1錨定在細胞膜上的熒光明場圖，圖2-(4)表示細胞膜染料錨定在細胞膜上的熒光暗場圖，圖2-(5)表示化合物1錨定在細胞膜上的暗場圖和細胞膜染料錨定在細胞膜上的熒光暗場圖的重合圖。從圖2可以看出化合物1成像圖和細胞膜染料成像圖很好的重合在一起，這說明我們的探針靶向細胞膜效果很好。

實施例2：

特異性錨定細胞膜熒光探針。記為化合物1，結構式如下：

化合物1的制備步驟如下：

在50ml的圓底燒瓶中加入熒光素(200mg,0.60mmol)，膽固醇甲酰氯(337.88mg,0.75mmol)，三乙胺(0.126ml)，無水n,n-二甲基甲酰胺(16ml)，氯仿(3ml)，通入氮氣，在-2℃下反應7h。產物處理：反應加入100ml飽和食鹽水和50ml乙酸乙酯萃取，重復萃取三次，柱層析，分別旋蒸，烘干封裝。得到黃色固體，產率為60％。

實施例3：

細胞膜銅離子熒光探針,記為化合物2，結構式如下：

在25ml的圓底燒瓶中加入化合物1(100mg,0.13mmol)，水合肼(8.05mg,0.16mmol)，無水乙醇(8ml)，通入氮氣，95℃加熱回流12h。產物處理：反應加入100ml飽和食鹽水和50ml乙酸乙酯萃取，重復萃取三次，柱層析，分別旋蒸，烘干封裝。得到淡黃色固體，產率為90％。¹hnmr(300mhz,cdcl3)，δ7.95(t,j＝3hz,1h),7.81(s,1h),7.48(t,j＝3hz,2h),7.11(m,1h),6.82(dd,j1＝4.5hz,j2＝1.5hz,1h),6.70(dd,j1＝4.5hz,j2＝0.9hz,2h),6.50(m,2h)5.42(d,j＝1.5hz,1h),4.60(dd,j1＝6hz,j2＝3hz,1h),3.69(bs,nh2),2.49(dd,j1＝10.5hz,j2＝4.5hz,2h),1.97(m,7h),1.45(m,11h),0.98(m,20h),0.69(s,3h)。配置2個樣品，在1.5ml離心管中加入hepg2細胞培養液(1ml)，銅離子(1mm，2μl)，化合物2(1mm，2μl)，細胞核染料(1mm，1μl)，細胞膜染料(1mm，1μl)。第一個樣品在365nm紫外燈下照射10分鐘，兩個樣品培養hepg2細胞0.5h，在共聚焦顯微鏡下觀察熒光成像圖，如附圖3所示。圖3-(1)表示細胞核成像圖，圖3-(2)表示沒經過356nm紫外光照射的樣品中化合物2在細胞膜上的熒光暗場圖，圖3-(3)表示經過356nm紫外光照射的樣品中化合物2在細胞膜上的熒光暗場圖，圖3-(4)表示沒經過356nm紫外光照射的樣品中化合物2在細胞膜上的熒光暗場圖和經過356nm紫外光照射的樣品中化合物2在細胞膜上的熒光暗場圖的重合圖，圖3-(5)表示細胞膜染料錨定在細胞膜上的熒光暗場圖。圖3-(6)表示經過356nm紫外光照射的樣品中化合物2在細胞膜上的熒光暗場圖和細胞膜染料錨定在細胞膜上的熒光暗場圖的重合圖。從圖3可以看出不能通過紫外光的照射來控制化合物2的成像圖，這說明沒加光保護基團的探針不能實現可控和精確地檢測。實施例4:

細胞膜銅離子熒光探針，記為化合物2，結構式如下：

在50ml的圓底燒瓶中加入化合物1(200mg,0.26mmol)，水合肼(19.32mg,0.38mmol)，無水乙醇(17ml)，通入氮氣，90℃加熱回流11h。產物處理：反應加入100ml飽和食鹽水和50ml乙酸乙酯萃取，重復萃取三次，柱層析，分別旋蒸，烘干封裝。得到淡黃色固體，產率為90％。

實施例5：

光調控細胞膜子銅離子熒光探針,記為化合物3，結構式如下：

在25ml的圓底燒瓶中加入化合物2(100mg,0.13mmol)，1-(1-溴乙基)-2-硝基苯(52.46mg,0.16mmol)，無水n,n-二甲基甲酰胺(7ml)，碳酸銫(169.45mg，0.52mmol)，通入氮氣，60℃加熱6h。產物處理：反應加入100ml飽和食鹽水和50ml乙酸乙酯萃取，重復萃取三次，柱層析，分別旋蒸，烘干封裝。得到淡黃色固體，產率為50％。。¹hnmr(300mhz,cdcl3):δ8.03(d,j＝4.5hz,1h),7.93(t,j＝4.5hz,1h),7.75(d,j＝3hz,1h),7.59(t,j＝7.5hz,1h),7.45(m,3h),7.09(s,1h)7.02(d,j＝3hz,1h),6.52(m,4h),6.82(dd,j1＝4.5hz,j2＝1.5,1h),6.65(d,j＝4.5hz,2h),6.52(d,j＝3hz,2h),6.05(dd,j1＝3hz,j2＝1.5hz,1h),5.42(s,1h),4.60(dd,j1＝6hz,j2＝3hz,1h)3.52(bs,nh2),2.48(s,2h),2.00(m,5h),1.56(m,10h),1.33(m,4h),0.91(m,22h),0.68(s,3h)。配置16個樣品，在1.5ml離心管中加入hepes緩沖溶液(1ml，ph＝7.4)，化合物3(1mm，1μl)，銅離子濃度分別為1μm，2μm，4μm，6μm，8μm，10μm，12μm，14μm，16μm，18μm，20μm，22μm，24μm，26μm，28μm，30μm，所有樣品在365nm紫外燈下照射10分鐘，振蕩0.5h，測熒光光譜，得到譜圖如圖1所示，從圖1可以看出隨著銅離子的濃度不斷增加化合物3的熒光強度也隨之增強。配置2個樣品，在1.5ml離心管中加入hepg2細胞培養液(1ml)，銅離子(1mm，2μl)，化合物3(1mm，2μl)，細胞核染料(1mm，1μl)，細胞膜染料(1mm，1μl)。第一個樣品在365nm紫外燈下照射10分鐘，兩個樣品培養hepg2細胞0.5h，在共聚焦顯微鏡下觀察熒光成像圖，如附圖4所示。圖4-(1)表示細胞核成像圖，圖4-(2)表示沒經過356nm紫外光照射的樣品中化合物3在細胞膜上的暗場圖，從圖中可以看出沒有熒光的，圖4-(3)表示經過356nm紫外光照射的樣品中化合物3在細胞膜上的熒光暗場圖，圖4-(4)表示沒經過356nm紫外光照射的樣品中化合物3在細胞膜上的暗場圖和經過356nm紫外光照射的樣品中化合物3在細胞膜上的熒光暗場圖的重合圖，圖4-(5)表示細胞膜染料錨定在細胞膜上的熒光暗場圖。圖4-(6)表示經過356nm紫外光照射的樣品中化合物3在細胞膜上的熒光暗場圖和細胞膜染料錨定在細胞膜上的熒光暗場圖的重合圖。從圖4可以看出能通過紫外光的照射來控制化合物3的成像圖，這說明加光保護基團的探針能實現可控和精確地檢測。

實施例6：

光調控細胞膜子銅離子熒光探針,記為化合物3，結構式如下：

在25ml的圓底燒瓶中加入化合物2(200mg,0.26mmol)，1-(1-溴乙基)-2-硝基苯(120.66mg,0.38mmol)，無水n,n-二甲基甲酰胺(16ml)，碳酸銫(338.9mg，1.04mmol)，通入氮氣，50℃加熱7h。產物處理：反應加入100ml飽和食鹽水和50ml乙酸乙酯萃取，重復萃取三次，柱層析，分別旋蒸，烘干封裝。得到淡黃色固體，產率為50％。

本發明的不局限于上述實施例所述的具體技術方案，凡采用等同替換形成的技術方案均為本發明要求的保護范圍。