本發明涉及生物活性肽制備技術領域，尤其是涉及一種雙酶分步酶解螃蟹殼制備抗氧化活性肽的方法。
背景技術：
海洋甲殼動物資源豐富，據世界糧農組織FAO漁業部統計，1996年世界海洋甲殼動物總產量達到510.7萬噸，其中蟹類占總產量的23.88％。蟹類經加工后會產生大量的下腳料，如蟹腳、蟹背殼等，由于技術及認識等方面原因，這些蝦蟹殼大多數往往被隨意丟棄，造成了極大的污染和資源浪費。而國內生產企業對蟹殼加工利用尚處于初級階段，現有的加工利用方法除了少部分粗粉碎作為魚粉加工原料外，多數被用于生產甲殼素，而甲殼素生產企業大多面臨環保壓力而停止生產。因此如何把這一資源進行最大化利用，開發新產品已成為水產品加工業急需解決的問題。
近年來，對水產品加工下腳料綜合利用的研究漸成熱點，主要是利用蛋白酶來提取蛋白水解物，用于調味料或食品添加劑的開發。蝦蟹殼中富含豐富的蛋白質，以及眾多對人體有益的營養素及鐵、鋅、銅等微量元素，利用生物酶解技術，將蟹殼資源有效的加以開發利用，制備成為具有抗氧化功能，且營養豐富的產品，將大大提高其應用價值，有效增加了螃蟹的經濟價值。
技術實現要素：
本發明的目的是為了提供一種工藝步驟簡單，過程穩定可控，節能、高效、綠色環保的雙酶分步酶解螃蟹殼制備抗氧化活性肽的方法，利用蟹殼制備抗氧化鈦，實現螃蟹加工廢棄物資源的綜合利用，提高其應用價值，有效增加了螃蟹的經濟價值。
為了實現上述目的，本發明采用以下技術方案：
一種雙酶分步酶解螃蟹殼制備抗氧化活性肽的方法，包括以下步驟：
(1)原料預處理：將蟹殼用水洗凈、晾干，經粉碎機粉碎，得蟹殼粉，待用。
(2)雙酶酶解：將蟹殼粉與水按質量比1：(5～10)混合后，調節pH為2.0～3.0，在30～40℃保溫10～20min，加入為蟹殼粉質量0.1～0.3％的酸性蛋白酶，保溫酶解6～8h，升至95～100℃滅酶15～20min，冷卻至50～60℃，調節pH至6.5～7.5，加入為蟹殼粉質量0.1～0.3％的風味蛋白酶，于50～60℃保溫酶解2～4h，升溫至95～100℃滅酶10～20min，得酶解液。本發明的關鍵點在于酶解過程，不同的蛋白酶對蛋白質的作用位點不同，單酶水解作用位點較單一，導致蛋白質的水解度較低，本發明采用雙酶酶解技術，由于酸性蛋白酶和風味蛋白酶的作用位點差異較大，因此可以有效提高蟹殼蛋白的水解度，從而獲得小分子的活性肽。所述的酸性蛋白酶為由黑曲霉培養發酵后采用現代生物技術精制而成的安全、高效生物食品級酶制劑，其分子量35kDa左右，酶活力為20000～50000U/g；所述的風味蛋白酶為由米曲霉菌株發酵，經提純、復配而成的食品級復合風味蛋白酶，酶活力為≥30000U/g。
(3)離心分離：將酶解液進行高速離心分離，取上層清液，得抗氧化肽粗提液。
(4)膜分離：將抗氧化肽粗提液利用超濾膜進行分離提純，得到蟹殼抗氧化肽溶液。膜分離去除無抗氧化活性或抗氧化活性較低的成分，在進一步提高蟹殼抗氧化肽的純度的同時，對抗氧化肽的結構和活性的影響較小。
(5)真空冷凍干燥：將抗氧化肽溶液真空冷凍干燥，即得固體的蟹殼抗氧化活性肽。
作為優選，步驟(2)中，高速離心的工藝參數為：離心轉速6000～10000rpm/min，時間10～30min。
作為優選，步驟(2)中，所述酸性蛋白酶酶活力為20000～50000U/g，所述風味蛋白酶酶活力≥30000U/g。
作為優選，步驟(2)中，酶解過程在攪拌條件下進行。
因此，本發明具有如下有益效果：本發明以蟹殼為原料，蟹殼粉碎后經雙酶分步酶解、離心分離、膜分離、真空冷凍干燥得到固體的蟹殼抗氧化肽，工藝步驟簡單，過程穩定可控，節能、高效、綠色環保，實現了螃蟹加工廢棄物資源的綜合利用，提高其應用價值，有效增加了螃蟹的經濟價值。
具體實施方式
下面通過具體實施方式對本發明做進一步的描述。
實施例1
(1)原料預處理：將蟹殼用水洗凈、晾干，經粉碎機粉碎，得蟹殼粉，待用；
(2)雙酶酶解：將蟹殼粉與水按質量比1：5混合后，調節pH為2.0，在30℃保溫10min，加入為蟹殼粉質量0.1％、酶活力為20000U/g的酸性蛋白酶，在攪拌條件下保溫酶解6h，升至95℃滅酶15min，冷卻至50℃，調節pH至6.5，加入為蟹殼粉質量0.1％、酶活力≥30000U/g的風味蛋白酶，在攪拌條件下于50℃保溫酶解2h，升溫至95℃滅酶10min，得酶解液；
(3)離心分離：將酶解液進行高速離心分離，取上層清液，得抗氧化肽粗提液，高速離心的工藝參數為：離心轉速6000rpm/min，時間10min；
(4)膜分離：將抗氧化肽粗提液利用超濾膜進行分離提純，得到蟹殼抗氧化肽溶液；
(5)真空冷凍干燥：將抗氧化肽溶液真空冷凍干燥，即得固體的蟹殼抗氧化活性肽。
將得到的蟹殼抗氧化肽經抗氧化活性測定，以抗壞血酸當量表示，蟹殼抗氧化肽對DPPH的清除效果為10.5mg AAE/g樣品，抗氧化肽的產量為240mg/g原料；感官評價為4。
實施例2
(1)原料預處理：將蟹殼用水洗凈、晾干，經粉碎機粉碎，得蟹殼粉，待用；
(2)雙酶酶解：將蟹殼粉與水按質量比1：10混合后，調節pH為3.0，在40℃保溫20min，加入為蟹殼粉質量0.3％、酶活力為50000U/g的酸性蛋白酶，在攪拌條件下保溫酶解8h，升至100℃滅酶20min，冷卻至60℃，調節pH至7.5，加入為蟹殼粉質量0.3％、酶活力≥30000U/g的風味蛋白酶，在攪拌條件下于60℃保溫酶解4h，升溫至100℃滅酶20min，得酶解液；
(3)離心分離：將酶解液進行高速離心分離，取上層清液，得抗氧化肽粗提液，高速離心的工藝參數為：離心轉速10000rpm/min，時間30min；
(4)膜分離：將抗氧化肽粗提液利用超濾膜進行分離提純，得到蟹殼抗氧化肽溶液；
(5)真空冷凍干燥：將抗氧化肽溶液真空冷凍干燥，即得固體的蟹殼抗氧化活性肽。
將得到的蟹殼抗氧化肽經抗氧化活性測定，以抗壞血酸當量表示，蟹殼抗氧化肽對DPPH的清除效果為10.2mg AAE/g樣品，抗氧化肽的產量為180mg/g原料；感官評價為4。
實施例3
(1)原料預處理：將蟹殼用水洗凈、晾干，經粉碎機粉碎，得蟹殼粉，待用；
(2)雙酶酶解：將蟹殼粉與水按質量比1：7混合后，調節pH為2.5，在35℃保溫15min，加入為蟹殼粉質量0.2％、酶活力為30000U/g的酸性蛋白酶，在攪拌條件下保溫酶解7h，升至98℃滅酶17min，冷卻至55℃，調節pH至7.2，加入為蟹殼粉質量0.2％、酶活力≥30000U/g的風味蛋白酶，在攪拌條件下于55℃保溫酶解3h，升溫至97℃滅酶15min，得酶解液；
(3)離心分離：將酶解液進行高速離心分離，取上層清液，得抗氧化肽粗提液，高速離心的工藝參數為：離心轉速8000rpm/min，時間20min；
(4)膜分離：將抗氧化肽粗提液利用超濾膜進行分離提純，得到蟹殼抗氧化肽溶液；
(5)真空冷凍干燥：將抗氧化肽溶液真空冷凍干燥，即得固體的蟹殼抗氧化活性肽。
將得到的蟹殼抗氧化肽經抗氧化活性測定，以抗壞血酸當量表示，蟹殼抗氧化肽對DPPH的清除效果為9.8mg AAE/g樣品，抗氧化肽的產量為249mg/g原料；感官評價為4。
本發明所用的DPPH清除率測定方法具體步驟為：
取1.5mL適當稀釋的蟹殼抗氧化肽溶液，加入3.0mL 0.09mg/mL DPPH(95％乙醇溶液)，混合均勻室溫避光放置5min，以95％乙醇為調零管，測定樣品在517nm處吸光值。其中空白對照用95％乙醇溶液替代樣品，標準品為抗壞血酸(AAE)溶液，濃度為0.01、0.02、0.03、0.04mg/mL。
結果以每g蟹殼抗氧化肽相當于抗壞血酸的mg數表示，即mg AAE/g樣品。
本發明采用的感官評價方法為：由8名經過訓練的感官評價小組成員按照表1所示的評分標準，對蟹殼抗氧化肽進行感官評分。
表1 感官評價評分標準
以上所述的實施例只是本發明的一種較佳的方案，并非對本發明作任何形式上的限制，在不超出權利要求所記載的技術方案的前提下還有其它的變體及改型。