專(zhuān)利名稱(chēng)：一種紫菜可控酶解后的抗氧化活性肽的純化及分析鑒定方法
一種紫菜可控酶解后的抗氧化活性肽的純化及分析鑒定方法技術(shù)領(lǐng)域
一種紫菜可控酶解產(chǎn)抗氧化活性肽的純化及分析鑒定方法，屬于生物制品分離純化技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
酶制劑已廣泛應(yīng)用在食品、釀造、制藥、有機(jī)酸、淀粉糖、飼料工業(yè)、紡織、皮革、洗滌劑及保健品等各個(gè)領(lǐng)域，應(yīng)用領(lǐng)域越來(lái)越廣泛，食品與人們的生活密切相關(guān)，因此酶在食品工業(yè)中的應(yīng)用價(jià)值越來(lái)越重要，目前在烘焙、奶制品、肉類(lèi)加工、新型營(yíng)養(yǎng)食品和蛋白質(zhì)的水解中得到很大的體現(xiàn)。
酶解蛋白質(zhì)生產(chǎn)多肽已成為當(dāng)今研究熱門(mén)，通過(guò)不同的酶切方式可以獲得不同功能的活性多肽，尤其是開(kāi)發(fā)一些寡肽物質(zhì)，成為蛋白質(zhì)研究中的一個(gè)新領(lǐng)域。
紫菜具有較高的食療藥用價(jià)值，紫菜提取液具有降血脂，防止動(dòng)脈粥樣硬化的功能。我國(guó)沿海大量養(yǎng)殖紫菜，一般末水條斑紫菜因口感較差往往售價(jià)很低。但其蛋白質(zhì)含量仍然在25%左右、另外還含有多糖、瓊脂、VC、各種礦物質(zhì)等。目前紫菜的主要利用途徑是制成海苔休閑食品，深加工產(chǎn)品較少，不斷開(kāi)展對(duì)紫菜的深加工和綜合利用顯得尤為迫切和必要。
由紫菜蛋白經(jīng)過(guò)酶解產(chǎn)生紫菜多肽，分子量介于蛋白質(zhì)與氨基酸之間，是以小分子肽為主、多種功效成分共存的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物，可100%吸收入血液循環(huán)。將紫菜的各類(lèi)功能因子用來(lái)加工功能性食品已經(jīng)成為紫菜深度開(kāi)發(fā)利用的重要方向。
本實(shí)驗(yàn)室研究制備的固體氨肽酶為外肽酶，可以從多肽鏈的N端解離氨基酸，該枯草芽孢桿菌所產(chǎn)氨肽酶酶系較為單一，它具備與多種內(nèi)切性蛋白酶復(fù)配應(yīng)用的潛力。經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室研究該氨肽酶與中性蛋白酶復(fù)合酶解末水條斑紫菜，可得到相對(duì)較高的水解度， 具有較小分子量，穩(wěn)定性好，能夠有效清除自由基的抗氧化活性肽。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種紫菜可控酶解產(chǎn)抗氧化活性肽的純化及分析鑒定方法，該紫菜抗氧化活性肽具有較小分子量，穩(wěn)定性好，能夠有效清除自由基，其抗氧化活性均保持在60%以上，溫度耐受性也較好，可作為食源性抗氧化劑，在保健食品，醫(yī)藥和化妝品領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用前景。
本發(fā)明的技術(shù)方案枯草芽孢桿菌Zj016固體氨肽酶(中國(guó)專(zhuān)利201010578579. 1已公開(kāi)，公開(kāi)號(hào) CN102078012A，
公開(kāi)日2011-6-1)和商品化中性蛋白酶復(fù)配酶解紫菜，制備紫菜抗氧化多肽粗品。該粗品利用kphadex G-IO、DEAE-52和SOURCE 3RPC等色譜手段分離純化，得到酶解紫菜抗氧化活性肽。通過(guò)測(cè)定DPPH消除能力、清除超氧自由基能力，清除羥自由基能力和還原力來(lái)綜合反映紫菜抗氧化肽的抗氧化性。經(jīng)反相高效液相(RP-HPLC)分析型色譜測(cè)定其純度，超高效液相色譜-質(zhì)譜法OhTOF-MQ分析鑒定其氨基酸組成，并對(duì)其穩(wěn)定性進(jìn)行研究。
提取工藝為A一種枯草桿菌固體氨肽酶在紫菜復(fù)配酶解中的應(yīng)用(1)將一種末水條斑紫菜撕成小塊，放入培養(yǎng)皿中；將培養(yǎng)皿放入烘箱中，于105°C的條件下烘干MT^i至恒重；取出將干品放入粉碎機(jī)中研碎，得到紫菜粉末。
(2)以紫菜粉末為底物，以pH8. 5 Na2HPO4-KH2POdl沖液為介質(zhì)，底物與緩沖液的比例為1 30，中性蛋白酶加入量為E/S=lX 105-2X 105 U/g，固體氨肽酶加入量為E/ S=IXlO4-2X104U/g。50°C水解6 h，80°C滅酶15 min，加入乙醇至體系乙醇體積分?jǐn)?shù)為 60%。室溫靜置12 h，10000 r/min離心10 min，得到的上清液為含抗氧化紫菜多肽的混合物。
B酶解紫菜抗氧化活性肽的分離純化及鑒定方法(1)將紫菜多肽混合物通過(guò)大孔樹(shù)脂DlOl脫色后，冷凍干燥得到淡黃色多肽粉末。將該淡黃色多肽粉末經(jīng)a^phadex G-IO凝膠層析，流動(dòng)相為0. 1 mol/L NaCl，流速0.1 mL/ min,收集峰組分，冷凍干燥，得到淺黃色多肽粉末。
(2) DEAE-52離子交換層析步驟(1)所得多肽粉末進(jìn)行離子交換層析，采用階段洗脫的方法，流動(dòng)相0 250 min 0.1 mol/L NaCl, 250^400 min 0.2 mol/L NaCl, 40(T550min 0. 3 mol/L NaCl 和 550 650min 0. 4 mol/L NaCl 的 ρΗ8· 5 Na2HPO4-KH2PO4 緩沖液，進(jìn)樣量為20 mL，流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm，收集峰組分，冷凍干燥；(3)SOURCE 3RPC ST4. 6/100反相層析步驟( 所得多肽粉末進(jìn)行反相層析，流動(dòng)相為A 含0. 1%三氟乙酸的10%-15%乙腈溶液；B 含0. 1%三氟乙酸的80%-75%乙腈溶液；梯度洗脫程序0 20 min 100% A ;20 40 min 100%A 100%B ;40 60 min 100%B，進(jìn)樣量為 2 mL，流速1.5 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm，收集濃縮的峰組分，得到酶解紫菜抗氧化活性肽；(4)利用反相高效液相(RP-HPLC)分析型色譜測(cè)定該白色的酶解紫菜抗氧化活性肽純度達(dá)87. 44%。超高效液相色譜一質(zhì)譜法Ο -TOF-MS)分析鑒定為一種六肽DGVGYG (Asp-Gly-Val-Gly-Tyr-Gly) 結(jié)果如圖 2。
C酶解紫菜抗氧化活性肽的穩(wěn)定性紫菜抗氧化活性肽分別在60°C，8(TC及100°C的水浴環(huán)境中放置2小時(shí)，立即用冰水冷卻，其抗氧化活性均保持在60%以上，溫度耐受性較好。結(jié)果如圖3，圖4。
氨肽酶的酶活LNA法測(cè)定。測(cè)定時(shí)，首先配1Tris-HCl緩沖液，取6. 075g 1Tris溶于900mL蒸餾水，用濃 HCl調(diào)至pH8. 5，然后定容至1L。以L(fǎng)-亮氨酸對(duì)硝基苯胺L-leu-pNA作為底物，取0. Ig底物溶于ImL酒精，然后用Tris-HCl緩沖液定容到100mL。取0. Ig固體氨肽酶粉用Tris-HCl 緩沖液定容到IOOmL作為待測(cè)酶液。加入2mL的Tris-HCl緩沖液和ImL底物(L-亮氨酸對(duì)硝基苯胺L-leu-pNA)，一個(gè)加入ImL酶液，另一個(gè)加入ImL Tris-HCl緩沖液作為對(duì)照， 在50°C水浴反應(yīng)IOmin后，405nm比色測(cè)定酶活。
酶活公式酶活=AX105.7X4Xn/10其中A為待測(cè)酶液的吸光度；η為待測(cè)酶液的稀釋倍數(shù)。
酶活力定義50°C，每分鐘分解L-亮氨酸-對(duì)硝基苯胺產(chǎn)生1微摩爾的對(duì)硝基苯胺所需酶量即為一個(gè)酶活單位。
測(cè)定樣品對(duì)DPPH (二苯代苦味胼基)自由基的清除率采用消除DPPH自由基法。取2mL待測(cè)樣品，加入2mL質(zhì)量濃度為0. 04g/L的DPPH 無(wú)水乙醇溶液，混合均勻后反應(yīng)20min，在轉(zhuǎn)速3500 r/min下，離心lOmin，取上清液，在波長(zhǎng)517nm處測(cè)其吸光度為Ai ；另取2mL待測(cè)樣品于試管中，分別加入無(wú)水乙醇2 mL，反應(yīng) 20min,在轉(zhuǎn)速3500r/min下離心lOmin，取上清液，在波長(zhǎng)517nm處測(cè)其吸光度為Aj ；以2mL 質(zhì)量濃度0. 04g/L的DPPH ·無(wú)水乙醇溶液和2mL無(wú)水乙醇反應(yīng)作為參比，其在波長(zhǎng)517nm 處吸光度記為Atl，按照下列式子計(jì)算樣品對(duì)DPPH自由基的清除率
權(quán)利要求
1. 一種紫菜可控酶解后的抗氧化活性肽的分離純化、鑒定方法，其特征在于(1)以烘干到恒重的末水條斑紫菜粉末為底物，以PH8.5 Na2HPO4-KH2PO4緩沖液為介質(zhì)，底物與緩沖液的質(zhì)量比例為1:30，中性蛋白酶加入量為E/S=lX 105-2X 105U/g，固體氨肽酶加入量為E/S=lX 104 -2X 104U/g，5(rC水解6 h，80°C滅酶15min，加入乙醇至體系乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，室溫靜置12h，10000 r/min離心lOmin，得到的上清液為含紫菜抗氧化多肽粗品；(2)將紫菜抗氧化多肽粗品通過(guò)大孔樹(shù)脂DlOl脫色后，冷凍干燥得到淡黃色多肽粉末，將該淡黃色多肽粉末依次經(jīng)過(guò)kphadex G-10、DEAE-52和SOURCE 3RPC ST4. 6/100進(jìn)一步分離純化后，得到紫菜抗氧化活性肽；a)Sephadex G_10凝膠層析脫色后的多肽粉末進(jìn)行凝膠層析，流動(dòng)相為0. 1 mol/L NaCl，流速0. 1 mL/min，收集峰組分，冷凍干燥，得到淺黃色多肽粉末；b)DEAE-52離子交換層析步驟a)所得多肽粉末進(jìn)行離子交換層析，采用階段洗脫的方法，流動(dòng)相:0 250 min 0. 1 mol/L NaCl,250^400 min 0.2 mol/L NaCl，400 550min 0.3 mol/L NaCl 和 550 650min 0.4 mol/L NaCl 的 pH8. 5 Na2HPO4-Iffl2PO4 緩沖液，進(jìn)樣量為 20 mL，流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm，收集峰組分，冷凍干燥；c)SOURCE 3RPC ST4. 6/100反相層析步驟b)所得多肽粉末進(jìn)行反相層析，流動(dòng)相為 A 含0. 1%三氟乙酸的10%-15%乙腈溶液；B 含0. 1%三氟乙酸的80%-75%乙腈溶液；梯度洗脫程序0 20 min 100% A ；20 40 min 100%A 100%B ；40 60 min 100%B，進(jìn)樣量為 2 mL, 流速1. 5 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm，收集濃縮的峰組分，得到酶解紫菜抗氧化活性肽；當(dāng)其濃度為100 μ g/mL時(shí)，對(duì)超氧自由基、DPPH和羥自由基的清除率依次為超過(guò)20%， 45%，45%，還原能力為VC的1倍以上，有很強(qiáng)的抗氧化性；(3)分析鑒定將所得酶解紫菜抗氧化活性肽進(jìn)行反相高效液相RP-HPLC分析型色譜測(cè)定，其純度達(dá)85%以上；超高效液相色譜一質(zhì)譜法Q-TOF-MS分析鑒定為一種六肽 DGVGYG=Asp-Gly-Val-Gly-Tyr-Gly ；(4)溫度耐受性將所得酶解紫菜抗氧化活性肽分別在60°C，80°C及100°C的水浴環(huán)境中放置2小時(shí)，立即用冰水冷卻，其抗氧化活性均保持在60%以上。
全文摘要
一種紫菜可控酶解后的抗氧化活性肽的純化及分析鑒定方法，屬于生物制品分離純化技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明涉及枯草芽孢桿菌Zj016氨肽酶和中性蛋白酶復(fù)配酶解一種成本低廉的末水條斑紫菜，得到紫菜抗氧化多肽粗品。該粗品利用SephadexG-10、DEAE-52和SOURCE3RPC等色譜手段分離純化，得到酶解紫菜抗氧化活性肽。通過(guò)測(cè)定DPPH消除能力，清除超氧自由基能力，清除羥自由基能力和還原力來(lái)綜合反映紫菜抗氧化活性肽的抗氧化性。經(jīng)RP-HPLC分析型色譜測(cè)定其純度，Q-TOF-MS分析鑒定其氨基酸組成，并對(duì)其抗氧化活性的穩(wěn)定性進(jìn)行研究。該紫菜抗氧化活性肽具有較小分子量，穩(wěn)定性好，能夠有效清除自由基，可作為食源性抗氧化劑，在保健食品，醫(yī)藥和化妝品領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)G01N1/34GK102495169SQ20111036265
公開(kāi)日2012年6月13日 申請(qǐng)日期2011年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月16日
發(fā)明者姚翔, 田亞平 申請(qǐng)人:江南大學(xué)