本發明涉及一種蟲草子座的人工培育方法，具體涉及一種雪峰蟲草子座及其人工培育方法。

背景技術：

雪峰蟲草為線蟲草菌科真菌雪峰蟲草菌ophiocordycepsxuefengensist.c.wen,r.c.zhu,j.c.kang&k.d.hyde，寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上的子座和幼蟲尸體的干燥復合體或充滿菌絲的干燥幼蟲尸體(菌核體)，主要分布于湖南省洞口縣、隆回縣，生長于海拔300～1000m的植物馬鞭草科大青clerodendrumcyrtophyllumturcz.的近地面根或莖中。雪峰蟲草具有補肺益腎、止咳化痰的功效，主治腎虛精虧、陽痿遺精、腰膝酸痛、久咳虛喘等癥。現代科學研究表明，蟲草中的許多種類都含有對人體有益的營養成分及其蟲草素、蟲草酸、腺苷等各種有效成分，具有抗菌、抗腫瘤、抗氧化和提高免疫力等多種功效，尤其以冬蟲夏草、蛹蟲草最為著名。

但由于野生蟲草連年采挖，其生態環境不斷遭受破壞等原因，造成蟲草數量和質量大幅度下降，貨源稀缺，價格昂貴，遠遠不能滿足市場日益增長的需求。與冬蟲夏草相比，雪峰蟲草其寄主為同科不同屬昆蟲的幼蟲，具有相同的腺苷、蟲草素、甘露醇、氨基酸等化學成分及類似的功效，具有與冬蟲夏草類似的功效及較強的免疫調節功能和防癌抗癌作用。雪峰蟲草在湖南雪峰山區被長期當成名貴中藥冬蟲夏草的替代品來使用，效果極佳，目前售價約每克20美元。它也是世界上目前發現的最大的蟲草。因此，對雪峰蟲草的野生馴化與人工培育技術研究具有十分重要的意義。

技術實現要素：

基于背景技術存在的技術問題，本發明提出了一種雪峰蟲草子座及其人工培育方法。

本發明以2014年6月從湖南洞口縣野外調查發現的一種野生蟲草子座為材料通過分離純化，首次獲得了一種蟲草菌株，將該菌株接入培養基制備斜面母種，斜面母種再接至液體培養基中制備一級菌種，一級菌種接入液體培養基中制備生產種，生產菌種接種在生產用培養基中經過培育獲得了一種人工栽培蟲草子座，從而實現了本發明的目的。

上述野生蟲草的子座特征是：子座無分枝，多彎曲，長14～46cm，直徑2～7mm，常圓柱形，黃棕色至銹褐色；頭部與柄無明顯分界，頂部呈尖狀或圓鈍。

本發明從上述野生蟲草分離獲得的雪峰蟲草已于2015年08月10日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱為cgmcc)，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，保藏編號為cgmccno.11107；分類命名：雪峰蟲草菌ophiocordycepsxuefengensis。

本發明所述的雪峰蟲草的純分離物(菌株)在斜面培養基上，基生菌絲發達，氣生菌絲較少。

本發明提出一種雪峰蟲草子座，其特征是由雪峰蟲草菌或其新鮮子座進行組織分離后人工培育獲得的，該子座稍圓柱狀，頂部常見尖狀或圓鈍，不分枝或頂部有短分枝，淺暗黃褐色。所述的新鮮子座是野生的或由人工培育成功后獲得的。

本發明提供的一種雪峰蟲草子座的人工培育方法，其特征在于：方法步驟如下：

1)母種的制備：雪峰蟲草菌或野生子座或培育成功后獲得的子座進行組織分離，取子座2～4mm長度的接種量接入斜面培養基，25～28℃，空氣相對濕度60～90％，暗培養15～25天，至菌絲長滿斜面，挑取基生菌絲發達且轉成黃色的斜面作為母種，所述斜面培養基的原料組成為每1000ml培養基中加入200g馬鈴薯的濾液，蔗糖20g，蛋白胨2g，kno31g，kh2po41g，mgso4·7h2o0.5g，瓊脂15-20g和余量的水；

2)二級母種的制備：將步驟1)得到的所述母種按黃豆大小的菌塊接入斜面培養基中繼續培養或復壯，于25～28℃，空氣相對濕度60～90％時，暗培養15～30天，至菌絲長滿斜面，挑取基生菌絲發達且轉成黃色的斜面作為二級母種；

3)一級菌種的制備：將步驟2)得到二級母種按每100ml培養基接入1～2塊黃豆大小的菌塊的接種量接種至液體培養基中，于25～28℃，以130～150r/min的轉速震蕩培養13～20天，挑選菌絲球大小均勻一致、直徑為2～3mm的菌種作為一級菌種；

4)生產種的制備：將步驟3)得到一級菌種按液體培養基體積5～10％的接種量接入液體培養基中，于25～28℃，以130～150r/min的轉速震蕩培養7～10天，挑選菌絲球大小均勻一致、直徑為2～3mm的菌種作為生產種，所述的液體培養基與步驟3)的培養基相同；

5)雪峰蟲草子座的制備：在無菌環境條件下，將步驟4)得到的生產種用無菌水稀釋到5倍，再按每1l生產種接種到3～6kg生產用培養基的比例進行接種，在20～25℃，空氣相對濕度60～90％時，暗培養18～23天，至菌絲長滿培養基，再在5～10℃12h，20～25℃12h，避光條件下，長出子座，轉入20～25℃弱光培養培養60～90天，至子座長至8～12cm，即可采收，得到雪峰蟲草子座。

優選地，步驟1)中所述斜面培養基的制備方法是按原料組成分別稱量各組分后，把馬鈴薯去皮切小長條，加水煮沸20～30分鐘左右至馬鈴薯軟而不爛時，用3～4層紗布過濾，濾液在加熱狀態下與其余組分混合攪拌均勻，趁熱裝于試管滅菌后，待冷卻至40℃制成斜面，所述斜面培養基ph6.5～7.0。

優選地，步驟3)所述的液體培養基的原料組成為每1000ml培養基中含200g馬鈴薯的濾液，蔗糖20g，蛋白胨2g，kno31g，kh2po41.0g，mgso4·7h2o0.5g和余量的水，所述的液體培養基ph6.5～7.0。

優選地，步驟5)所述的生產用培養基的原料組成為每1kg大米配200～300g蠶蛹粉和2～3l液體培養基，所述的生產用培養基ph6.5～7.0。

與現有技術相比，本發明具有的有益效果在于：

一、操作簡單，取材方便，利用人工培養基培育雪峰蟲草子座，脫離自然的束縛，不需要大規模的栽植大青，養殖癤蝙蛾幼蟲。

二、試驗成本低，試驗重現性好，人工培育基的材料主要是大米、營養液和蠶蛹粉，價格較低，且可周年生產，便于規模化培育。

三、雪峰蟲草的條件生長均一，可提高雪峰蟲草的品質，用人工培育的雪峰蟲草子座其生長條件一直，外觀品質均一，其腺苷、甘露醇和多糖含量等符合冬蟲夏草的藥典標準。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明作進一步解說。

原料來源說明：本發明所用大米、馬鈴薯購自農貿市場，蛋白胨購自廣東環凱微生物科技有限公司，蔗糖、kno3、kh2po4、mgso4·7h2o、瓊脂均購自國藥集團化學試劑有限公司。

實施例1

一種雪峰蟲草子座，稍圓柱狀，頂部常見尖狀或圓鈍，不分枝或頂部有短分枝，淺暗黃褐色。

一種雪峰蟲草子座的人工培育方法，方法步驟如下：

1)母種的制備：對雪峰蟲草菌進行組織分離，取子座2mm長度的接種量接入斜面培養基，于25℃，空氣相對濕度60％，暗培養15天，至菌絲長滿斜面，挑取基生菌絲發達且轉成黃色的斜面作為母種。

斜面培養基的制備：每1000ml培養基中加入200g馬鈴薯的濾液，蔗糖20g，蛋白胨2g，kno31g，kh2po41g，mgso4·7h2o0.5g，瓊脂15g和余量的水。將馬鈴薯去皮切小長條，加水煮沸20分鐘左右至馬鈴薯軟而不爛時，用3層紗布過濾，濾液于燒杯中，加入瓊脂，再加入蔗糖，蛋白胨，kno3，kh2po4，mgso4·7h2o和水在加熱狀態下混合攪拌均勻，趁熱按5ml/管的量分裝于試管里，塞上橡膠塞，包上牛皮紙或報紙，于121℃、0.1mpa條件下滅菌30分鐘，待冷卻至40℃制成斜面，斜面培養基ph6.5。

2)二級母種的制備：將步驟1)得到的所述母種按黃豆大小的菌塊接入斜面培養基中繼續培養或復壯，于25℃，空氣相對濕度60％時，暗培養15天，至菌絲長滿斜面，挑取基生菌絲發達且轉成黃色的斜面作為二級母種；

3)一級菌種的制備：將步驟2)得到二級母種按每100ml培養基接入1塊黃豆大小的菌塊的接種量接種至液體培養基中，于25℃，以130r/min的轉速震蕩培養13天，挑選菌絲球大小均勻一致、直徑為2mm的菌種作為一級菌種；

液體培養基的原料組成為每1000ml培養基中含200g馬鈴薯的濾液，蔗糖20g，蛋白胨2g，kno31g，kh2po41.0g，mgso4·7h2o0.5g和余量的水，液體培養基ph6.5。

4)生產種的制備：將步驟3)得到一級菌種按液體培養基體積5％的接種量接入液體培養基中，于25℃，以130r/min的轉速震蕩培養7天，挑選菌絲球大小均勻一致、直徑為2mm的菌種作為生產種，所述的液體培養基與步驟3)的培養基相同；

5)雪峰蟲草子座的制備：在無菌環境條件下，將步驟4)得到的生產種用無菌水稀釋到5倍，再按每1l生產種接種到3kg生產用培養基的比例進行接種，在20℃，空氣相對濕度60％時，暗培養20天，至菌絲長滿培養基，再在5℃12h，20℃12h，避光條件下，長出子座，轉入22℃弱光培養培養60天，至子座長至10cm，即可采收，得到雪峰蟲草子座。

生產用培養基的原料組成為1kg大米、200g蠶蛹粉和2l液體培養基，混合，121℃滅菌30分鐘，冷卻至室溫，得到生產用培養基。生產用培養基ph6.5。

實施例2

一種雪峰蟲草子座，稍圓柱狀，頂部常見尖狀或圓鈍，不分枝或頂部有短分枝，淺暗黃褐色。

一種雪峰蟲草子座的人工培育方法，方法步驟如下：

1)母種的制備：對雪峰蟲草菌進行組織分離，取子座3mm長度的接種量接入斜面培養基，于28℃，空氣相對濕度90％，暗培養25天，至菌絲長滿斜面，挑取基生菌絲發達且轉成黃色的斜面作為母種。

斜面培養基的制備：每1000ml培養基中加入200g馬鈴薯的濾液，蔗糖20g，蛋白胨2g，kno31g，kh2po41g，mgso4·7h2o0.5g，瓊脂20g和余量的水。將馬鈴薯去皮切小長條，加水煮沸20分鐘左右至馬鈴薯軟而不爛時，用3層紗布過濾，濾液于燒杯中，加入瓊脂，再加入蔗糖，蛋白胨，kno3，kh2po4，mgso4·7h2o和水在加熱狀態下混合攪拌均勻，趁熱按5ml/管的量分裝于試管里，塞上橡膠塞，包上牛皮紙或報紙，于121℃、0.1mpa條件下滅菌30分鐘，待冷卻至40℃制成斜面，斜面培養基ph7.0。

2)二級母種的制備：將步驟1)得到的所述母種按黃豆大小的菌塊接入斜面培養基中繼續培養或復壯，于28℃，空氣相對濕度90％時，暗培養25天，至菌絲長滿斜面，挑取基生菌絲發達且轉成黃色的斜面作為二級母種；

3)一級菌種的制備：將步驟2)得到二級母種按每100ml培養基接入1塊黃豆大小的菌塊的接種量接種至液體培養基中，于28℃，以150r/min的轉速震蕩培養20天，挑選菌絲球大小均勻一致、直徑為3mm的菌種作為一級菌種；

液體培養基的原料組成為每1000ml培養基中含200g馬鈴薯的濾液，蔗糖20g，蛋白胨2g，kno31g，kh2po41.0g，mgso4·7h2o0.5g和余量的水，液體培養基ph6.5。

4)生產種的制備：將步驟3)得到一級菌種按液體培養基體積10％的接種量接入液體培養基中，于28℃，以150r/min的轉速震蕩培養7天，挑選菌絲球大小均勻一致、直徑為3mm的菌種作為生產種，所述的液體培養基與步驟3)的培養基相同；

5)雪峰蟲草子座的制備：在無菌環境條件下，將步驟4)得到的生產種用無菌水稀釋到5倍，再按每1l生產種接種到5kg生產用培養基的比例進行接種，在20℃，空氣相對濕度90％時，暗培養18天，至菌絲長滿培養基，再在5℃12h，25℃12h，避光條件下，長出子座，轉入25℃弱光培養培養60天，至子座長至10cm，即可采收，得到雪峰蟲草子座。

生產用培養基的原料組成為1kg大米、250g蠶蛹粉和2.5l液體培養基，混合，121℃滅菌30分鐘，冷卻至室溫，得到生產用培養基。生產用培養基ph7.0。

實施例3

一種雪峰蟲草子座，稍圓柱狀，頂部常見尖狀或圓鈍，不分枝或頂部有短分枝，淺暗黃褐色。

一種雪峰蟲草子座的人工培育方法，方法步驟如下：

1)母種的制備：對野生子座進行組織分離，取子座2mm長度的接種量接入斜面培養基，于26℃，空氣相對濕度68％，暗培養17天，至菌絲長滿斜面，挑取基生菌絲發達且轉成黃色的斜面作為母種。

斜面培養基的制備：每1000ml培養基中加入200g馬鈴薯的濾液，蔗糖20g，蛋白胨2g，kno31g，kh2po41g，mgso4·7h2o0.5g，瓊脂16g和余量的水。將馬鈴薯去皮切小長條，加水煮沸22分鐘左右至馬鈴薯軟而不爛時，用3層紗布過濾，濾液于燒杯中，加入瓊脂，再加入蔗糖，蛋白胨，kno3，kh2po4，mgso4·7h2o和水在加熱狀態下混合攪拌均勻，趁熱按5ml/管的量分裝于試管里，塞上橡膠塞，包上牛皮紙或報紙，于121℃、0.1mpa條件下滅菌30分鐘，待冷卻至40℃制成斜面，斜面培養基ph7.0。

2)二級母種的制備：將步驟1)得到的所述母種按黃豆大小的菌塊接入斜面培養基中繼續培養或復壯，于26℃，空氣相對濕度75％時，暗培養22天，至菌絲長滿斜面，挑取基生菌絲發達且轉成黃色的斜面作為二級母種；

3)一級菌種的制備：將步驟2)得到二級母種按每100ml培養基接入2塊黃豆大小的菌塊的接種量接種至液體培養基中，于26℃，以140r/min的轉速震蕩培養16天，挑選菌絲球大小均勻一致、直徑為2mm的菌種作為一級菌種；

液體培養基的原料組成為每1000ml培養基中含200g馬鈴薯的濾液，蔗糖20g，蛋白胨2g，kno31g，kh2po41.0g，mgso4·7h2o0.5g和余量的水，液體培養基ph7.0。

4)生產種的制備：將步驟3)得到一級菌種按液體培養基體積6％的接種量接入液體培養基中，于26℃，以140r/min的轉速震蕩培養8天，挑選菌絲球大小均勻一致、直徑為2mm的菌種作為生產種，所述的液體培養基與步驟3)的培養基相同；

5)雪峰蟲草子座的制備：在無菌環境條件下，將步驟4)得到的生產種用無菌水稀釋到5倍，再按每1l生產種接種到4.5kg生產用培養基的比例進行接種，在22℃，空氣相對濕度82％時，暗培養19天，至菌絲長滿培養基，再在10℃12h，20℃12h，避光條件下，長出子座，轉入22℃弱光培養培養70天，至子座長至12cm，即可采收，得到雪峰蟲草子座。

生產用培養基的原料組成為1kg大米、300g蠶蛹粉和3l液體培養基，混合，121℃滅菌30分鐘，冷卻至室溫，得到生產用培養基。生產用培養基ph7.0。

實施例4

一種雪峰蟲草子座，稍圓柱狀，頂部常見尖狀或圓鈍，不分枝或頂部有短分枝，淺暗黃褐色。

一種雪峰蟲草子座的人工培育方法，方法步驟如下：

1)母種的制備：對培育成功后獲得的子座進行組織分離，取子座3mm長度的接種量接入斜面培養基，于27℃，空氣相對濕度75％，暗培養18天，至菌絲長滿斜面，挑取基生菌絲發達且轉成黃色的斜面作為母種。

斜面培養基的制備：每1000ml培養基中加入200g馬鈴薯的濾液，蔗糖20g，蛋白胨2g，kno31g，kh2po41g，mgso4·7h2o0.5g，瓊脂17g和余量的水。將馬鈴薯去皮切小長條，加水煮沸25分鐘左右至馬鈴薯軟而不爛時，用4層紗布過濾，濾液于燒杯中，加入瓊脂，再加入蔗糖，蛋白胨，kno3，kh2po4，mgso4·7h2o和水在加熱狀態下混合攪拌均勻，趁熱按5ml/管的量分裝于試管里，塞上橡膠塞，包上牛皮紙或報紙，于121℃、0.1mpa條件下滅菌30分鐘，待冷卻至40℃制成斜面，斜面培養基ph6.5。

2)二級母種的制備：將步驟1)得到的所述母種按黃豆大小的菌塊接入斜面培養基中繼續培養或復壯，于27℃，空氣相對濕度68％時，暗培養18天，至菌絲長滿斜面，挑取基生菌絲發達且轉成黃色的斜面作為二級母種；

3)一級菌種的制備：將步驟2)得到二級母種按每100ml培養基接入1塊黃豆大小的菌塊的接種量接種至液體培養基中，于26℃，以135r/min的轉速震蕩培養17天，挑選菌絲球大小均勻一致、直徑為3mm的菌種作為一級菌種；

液體培養基的原料組成為每1000ml培養基中含200g馬鈴薯的濾液，蔗糖20g，蛋白胨2g，kno31g，kh2po41.0g，mgso4·7h2o0.5g和余量的水，液體培養基ph6.6。

4)生產種的制備：將步驟3)得到一級菌種按液體培養基體積7％的接種量接入液體培養基中，于27℃，以135r/min的轉速震蕩培養9天，挑選菌絲球大小均勻一致、直徑為2mm的菌種作為生產種，所述的液體培養基與步驟3)的培養基相同；

5)雪峰蟲草子座的制備：在無菌環境條件下，將步驟4)得到的生產種用無菌水稀釋到5倍，再按每1l生產種接種到4kg生產用培養基的比例進行接種，在22℃，空氣相對濕度68％時，暗培養21天，至菌絲長滿培養基，再在10℃12h，25℃12h，避光條件下，長出子座，轉入22℃弱光培養培養90天，至子座長至10cm，即可采收，得到雪峰蟲草子座。

生產用培養基的原料組成為1kg大米、300g蠶蛹粉和3l液體培養基，混合，121℃滅菌30分鐘，冷卻至室溫，得到生產用培養基。生產用培養基ph6.5。

實施例5

一種雪峰蟲草子座，稍圓柱狀，頂部常見尖狀或圓鈍，不分枝或頂部有短分枝，淺暗黃褐色。

一種雪峰蟲草子座的人工培育方法，方法步驟如下：

1)母種的制備：對野生子座進行組織分離，取子座4mm長度的接種量接入斜面培養基，于28℃，空氣相對濕度82％，暗培養20天，至菌絲長滿斜面，挑取基生菌絲發達且轉成黃色的斜面作為母種。

斜面培養基的制備：每1000ml培養基中加入200g馬鈴薯的濾液，蔗糖20g，蛋白胨2g，kno31g，kh2po41g，mgso4·7h2o0.5g，瓊脂18g和余量的水。將馬鈴薯去皮切小長條，加水煮沸30分鐘左右至馬鈴薯軟而不爛時，用4層紗布過濾，濾液于燒杯中，加入瓊脂，再加入蔗糖，蛋白胨，kno3，kh2po4，mgso4·7h2o和水在加熱狀態下混合攪拌均勻，趁熱按5ml/管的量分裝于試管里，塞上橡膠塞，包上牛皮紙或報紙，于121℃、0.1mpa條件下滅菌30分鐘，待冷卻至40℃制成斜面，斜面培養基ph6.7。

2)二級母種的制備：將步驟1)得到的所述母種按黃豆大小的菌塊接入斜面培養基中繼續培養或復壯，于26℃，空氣相對濕度82％時，暗培養27天，至菌絲長滿斜面，挑取基生菌絲發達且轉成黃色的斜面作為二級母種；

3)一級菌種的制備：將步驟2)得到二級母種按每100ml培養基接入1塊黃豆大小的菌塊的接種量接種至液體培養基中，于25℃，以145r/min的轉速震蕩培養19天，挑選菌絲球大小均勻一致、直徑為2mm的菌種作為一級菌種；

液體培養基的原料組成為每1000ml培養基中含200g馬鈴薯的濾液，蔗糖20g，蛋白胨2g，kno31g，kh2po41.0g，mgso4·7h2o0.5g和余量的水，液體培養基ph6.7。

4)生產種的制備：將步驟3)得到一級菌種按液體培養基體積8％的接種量接入液體培養基中，于25℃，以145r/min的轉速震蕩培養10天，挑選菌絲球大小均勻一致、直徑為2mm的菌種作為生產種，所述的液體培養基與步驟3)的培養基相同；

5)雪峰蟲草子座的制備：在無菌環境條件下，將步驟4)得到的生產種用無菌水稀釋到5倍，再按每1l生產種接種到6kg生產用培養基的比例進行接種，在25℃，空氣相對濕度75％時，暗培養23天，至菌絲長滿培養基，再在7℃12h，22℃12h，避光條件下，長出子座，轉入20℃弱光培養培養75天，至子座長至8cm，即可采收，得到雪峰蟲草子座。

生產用培養基的原料組成為1kg大米、280g蠶蛹粉和2.8l液體培養基，混合，121℃滅菌30分鐘，冷卻至室溫，得到生產用培養基。生產用培養基ph6.7。

以上所述，僅為本發明較佳的具體實施方式，但本發明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本技術領域的技術人員在本發明揭露的技術范圍內，根據本發明的技術方案及其發明構思加以等同替換或改變，都應涵蓋在本發明的保護范圍之內。