本發明涉及一類具有抗炎活性的吡唑中氮茚化合物及其制備方法與作為抗炎藥物的用途。本發明還涉及含有所述吡唑中氮茚化合物的藥用組合物。

背景技術：

近年來，中氮茚類化合物在醫藥領域有著廣泛的應用，例如作為FGF(基質成纖維細胞生長因子)與受體結合的強拮抗劑、黃嘌呤氧化酶抑制劑、CRTH2拮抗劑；用于治療心絞痛、心律失常、高尿酸血癥等病癥。

專利WO03/084956公開了一種在中氮茚的3位引入苯甲酰基，得到一類能夠抑制FGF的衍生物，能夠抑制腫瘤血管生成，用于治療各類腫瘤、癌癥。

專利EP0235111,EP0097636,US4378362,EP0382628公開了一些能夠用于治療心絞痛和心律失常的中氮茚衍生物，其中某些化合物還具有抑制鈣轉運的生物活性。

專利CN101243086、WO2008/074966、CN101605789披露了在中氮茚3位引入苯硫基，獲得一類作為CRTH2拮抗劑的中氮茚衍生物；專利WO2007031747則披露了在中氮茚1位引入苯硫基，得到的衍生物同樣也具有CRTH2拮抗作用，可用于治療呼吸系統疾病藥物的開發。

日本橘生藥品工業株式會社在專利WO2012043638中公開了一類具有黃嘌呤氧化酶抑制活性并可用于預防或治療與血清尿酸水平異常相關的疾病的(氮雜)中氮茚衍生物。

本申請發明人在Acta Cryst.(2013).E69,o450公開了一種1,3位引入兩個吡唑羰基的中氮茚衍生物的合成及其晶體結構。

由于中氮茚類化合物具有良好的醫藥用途，因此，研究此類化合物對藥物開發很有意義，本申請發明人設計并合成了一類新穎的吡唑中氮茚衍生物，經生物活性實驗測定，已證明此類化合物具有顯著的抗炎活性，可用于抗炎藥物研究。

技術實現要素：

本發明提供如下的具有抗炎活性的式I化合物或其藥學上可接受的鹽：

其中：

A為氧或硫原子；

R₁-R₄獨立地選自：氫、烷基、烷氧基、環烷基；

R₅選自：-CN；

R₆獨立地選自：氫、烷基；

作為本發明優選的方案，A選自氧原子。

作為本發明的另一個優選方案，R₁-R₄優選烷基、烷氧基。

本發明另一個優選方案，R₆獨立地選自烷基。

本發明的式I化合物優選下列式I-1所示的化合物

其中，

R₁和R₃獨立地選自氫、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基；

R₂和R₄獨立地選自C_1-6烷基、C_1-6烷氧基；

R₆獨立地選自：C_1-6烷基。

本發明還涉及將式I化合物或其藥學上可接受的鹽用于制備藥物的用途，本發明的化合物具有抗炎作用，可用于制備治療各類炎癥相關疾病。

本發明還涉及一種藥用組合物，其包含式I化合物或其藥學可接受的鹽作為活性成分，其可進一步包括藥學上可接受的載體、賦形劑。

所述的藥用組合物，制備成口服、皮下、肌內、靜脈內、透皮等給藥形式。

優選地，本發明的藥用組合物可以制備成片劑、膠囊、粉劑、顆粒劑、口服液、懸浮液或注射液。

術語

“烷基”，是指具有1-10個碳原子的直鏈或支鏈的烷烴基，優選C_1-6烷基，更優選C_1-3烷基，合適的烷基如：甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基等。

“烷氧基”，是指-O-烷基。

“環烷基”，是指飽和的環狀烷基，包括3-6個原子，優選環丙基、環丁基、環戊基、環己基。

“藥學上可接受的鹽”，包括堿加成鹽和酸加成鹽，堿加成鹽優選與NaOH、KOH、Na₂CO₃、K₂CO₃、NaHCO₃、KHCO₃所成的鹽，酸加成鹽優選與氫溴酸、鹽酸、硫酸、磷酸、酒石酸、琥珀酸、富馬酸、馬來酸、蘋果酸、水楊酸、檸檬酸、甲磺酸、對甲苯磺酸、苯甲酸、苯磺酸、醋酸、扁桃酸所成的鹽。

本發明還提供式I所示的中氮茚類衍生物的合成方法：

主要包括如下合成步驟：

1)式VII化合物與VI化合物在有機溶劑中攪拌反應生成式V化合物；

2)式V化合物在堿和CrO₃存在下與丙烯腈在DMF或DMA中反應得到式IV化合物；

3)式IV化合物肼解得到式III化合物；

4)式III化合物與式II化合物縮合成環得式I-1化合物；

或，還包括5)將式I-1化合物進一步轉化為式I-2化合物；

或任選將式I-1和I-2化合物轉化為其藥學上可接受的鹽；式I-1與式I-2共同組成本申請的式I化合物。

其中，X為Cl、Br；R_b為C_1-6烷基；R₁-R₆、A具有與式I化合物相同的定義。

作為本發明的優選方案，步驟1)中，所述有機溶劑選自乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、四氫呋喃、丙酮、乙腈。

作為本發明的另一優選方案，步驟1)中，式VII與式VI化合物的摩爾比為1-2:1。

在發明的一個實施方式中，步驟2)中，所述堿選自NaOH、KOH、Na₂CO₃、K₂CO₃、NaHCO₃、KHCO₃、三乙胺、吡啶等，優選三乙胺。

在發明的另一個實施方式中，步驟3)的肼解是在乙醇作溶劑條件下，與80％水合肼反應實施的。

進一步地，步驟4)是在脂肪酸作溶劑條件下進行反應，所述脂肪酸優選甲酸、乙酸、丙酸。

進一步地，步驟5)所述進一步轉化是用勞森試劑將3位羰基轉化為硫羰基。

其中，本發明所述的勞森試劑是本領域技術人員所熟知的一種氧硫交換試劑，可將羰基化合物轉化為硫羰基化合物。

附圖說明

圖1：化合物4的¹H-NMR譜圖；

圖2：化合物4對小鼠原代腹腔巨噬細胞的細胞毒性測試結果；

圖3：化合物4的抗炎活性測試結果

具體實施例

本發明化合物結構鑒定中：熔點測定實驗儀器為X-4顯微熔點測定儀；¹H-NMR采用Bruker公司ACF-400型核磁共振儀，DMSO-d₆為溶劑，TMS為內標。

實施例1

步驟1)吡啶鎓鹽化合物1的合成

將120mmol 2,4-二甲基吡啶和60mmol溴乙酸乙酯溶于200mL乙酸乙酯中，攪拌20小時，抽濾。濾餅用50ml乙酸乙酯洗滌后，室溫干燥，得到產品1為白色粉末，收率為75％。

步驟2)化合物2的合成

將30mmol化合物1，180mmol三乙胺，120mmol丙烯腈和120mmol三氧化鉻加入到180ml DMF(N,N-二甲基甲酰胺)中加熱到90℃，保持2小時。冷卻后，反應混合物倒入500ml 5％鹽酸中，靜置，抽濾，濾餅干燥后，用石油醚(bp 60-90℃)-乙酸乙酯(體積比4:1)柱層析，得黃色粉末化合物2，收率為40％。

步驟3)酰肼化合物3的合成

將20mmol化合物2與10ml乙醇，30ml 80％水合肼混合后，回流8小時。冷卻，抽濾，得到白色粉末化合物3，收率為74％。

步驟4)5,7-二甲基-1-氰基-3-(3,5-二甲基吡唑基羰基)中氮茚的合成

將10mmol化合物3溶于20ml乙酸中，隨后滴加40mmol乙酰丙酮。攪拌2小時后，抽濾，濾餅干燥后，用石油醚(bp 60-90℃)-乙酸乙酯(體積比4:1)柱層析，得白色粉末終產物4，收率為70％。經測定：熔點為184-185℃；¹H-NMR(CD3SOCD3,400MHz):2.17(s,3H,–CH3),2.40(s,3H,–CH3),2.46(s,3H,–CH3),2.55(s,3H,–CH3),6.31(s,1H,pyrazole＝CH),7.04(s,1H,ArH),7.62(s,1H,ArH),7.82(s,1H,ArH)，見圖1。

生物活性測定：

(1)化合物4細胞毒性檢測

我們對化合物4進行了細胞毒性檢測。首先選取小鼠原代腹腔巨噬細胞為檢測細胞，在96孔細胞培養板中接種細胞懸液(10⁴個細胞/100μl細胞懸液，100μl細胞懸液/孔)，將培養板在細胞培養箱中預培養12小時(在37℃，5％CO₂的條件下)，然后在培養板中加入不同濃度(5μg/ml,10μg/ml，20μg/ml)的化合物4，繼續將培養板放在培養箱孵育24小時，向每孔加入10μl CCK-8溶液(注意不要在孔中生成氣泡，它們會影響O.D.值讀數),然后將細胞培養板放在培養箱內避光孵育1小時，最后用酶標儀測定450nm處的吸光度。

細胞存活率計算方法：細胞存活率＝[(As-Ab)/(Ac-Ab)]*100％

As:實驗孔(含有細胞的培養基，CCK-8溶液，化合物4)

Ac:對照孔(含有細胞的培養基，CCK-8溶液，沒有化合物4)

Ab:空白孔(不含細胞和化合物4的培養基，CCK-8溶液)

在細胞毒性檢測實驗中，我們每組平行樣設置5個，實驗重復做3次，從而保證數據可信性。數據通過平均值±標準誤差(means±SEM)的形式加以展示。經統計學分析，不同濃度的化合物4對小鼠原代腹腔巨噬細胞沒有明顯毒性(參見圖2)。

(2)在體外模擬的炎癥環境中探究化合物4的抗炎性能

我們對化合物4進行了抗炎性能檢測。首先選取小鼠原代腹腔巨噬細胞為檢測細胞，在24孔細胞培養板中接種細胞懸液(10⁵個細胞/500μl細胞懸液，500μl細胞懸液/孔)，接著將培養板在培養箱預培養12小時(在37℃，5％CO₂的條件下)，然后在培養板中加入不同濃度(5μg/ml,10μg/ml，20μg/ml)的化合物4，把培養板放在培養箱孵育1小時后，加入細菌脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)(每個孔LPS的終濃度為1μg/ml)，然后將培養板放在培養箱孵育24小時，取細胞上清，1000rpm，離心10min。參照ELISA試劑盒說明書檢測細胞上清中炎癥因子-腫瘤壞死因子-α的含量。

在炎癥因子檢測實驗中，我們每組平行樣設置3個，實驗重復做3次，從而保證數據可信性。數據通過平均值±標準誤差(means±SEM)的形式加以展示。經統計學分析，10μg/ml和20μg/ml濃度的化合物4有顯著的抗炎效果(*p<0.05表示有統計學上差異，**p<0.01表示有統計學上顯著性差異)(參見圖3)。

可見，本發明的式I化合物具有顯著的抗炎活性，可進一步用于抗炎藥物的研究開發中。

盡管本發明已進行了一定程度的描述，明顯地，在不脫離本發明的精神和范圍的條件下，可進行適當變化。可以理解，本發明不限于所述實施方案，而歸于權利要求的范圍，其包括所述每個因素的等同替換。