本發明屬于四溴雙酚A衍生物TBBPA-DHEE半抗原技術領域，尤其涉及一種四溴雙酚A衍生物TBBPA-DHEE兩個苯環中間的支鏈改造(兩個苯環中間的支鏈進行衍生化)，使之具備耦合用羧基的合成方法，并對其用途進行研究。

背景技術：

四溴雙酚A(TBBPA)及其衍生物是一類在全球廣泛使用的溴代阻燃劑，研究表明，TBBPA具有強甲狀腺激素干擾活性以及弱雌激素活性，會通過干擾甲狀腺動態平衡而對機體產生危害。TBBPA-DHEE即為其中一種，是一種重要的添加型阻燃劑。目前，TBBPA及其衍生物在生產過程中的使用、泄露等使其進入環境，可在多介質環境中殘留、積累，并造成潛在危害。

因此，開展四溴雙酚A及其衍生物的分析測定具有重要的現實意義。目前，檢測四溴雙酚A及其衍生物的方法均基于儀器分析方法，具有準確性好、靈敏度高的優點，但是由于所用儀器極其昂貴，而且存在測試成本高、分析時間長、檢測所需樣品量大及前處理步驟繁瑣等不足，無法在較大范圍內系統、全面、快速分析環境中TBBPA及其衍生物的含量，因此，建立一種快速簡便的四溴雙酚A檢測方法是具有重要意義的。

和其他傳統檢測方法相比，生物分析方法是基于抗體(或其它具有識別功能的生物大分子)特異性反應的一種分析方法，已廣泛應用于食品與環境中小分子污染物的分析檢測。該方法具有靈敏度高、方便快捷、高通量、低成本等優勢。而建立此方法的前提是相應抗體的研制。

由于TBBPA-DHEE是小分子物質，小分子化合物因其分子量小，缺乏免疫原性，在免疫動物時，很難誘導產生特異性細胞及體液免疫反應。為此，需要將小分子物質與大分子載體蛋白偶聯，使其成為完全抗原。小分子化合物的抗體，是通過半抗原作為抗原決定簇免疫動物而獲得，所以設計并合成合理的半抗原是制備親和性好、靈敏度高的抗體的關鍵。其原則是設計合成與待測物結構類似的半抗原，并盡量保持與待測物共有的結構作為母核。

對于半抗原結構的選擇，如果待測物本身含有-NH₂，-COOH，-OH，-SH等功能基團，可直接活化后聯入載體蛋白，便可合成人工完全抗原。但大部分待測物分子并不含有功能基團，或功能基團對待測物的特異性和極性影響較大，因此，需要對小分子化合物進行結構改造，使其具有能共價結合到載體蛋白上的一種功能基團(如氨基、羧基、羥基和巰基等)。

本發明基于以上原則，設計了四溴雙酚A衍生物TBBPA-DHEE半抗原合成方法，以雙酚酸為原料，通過4步反應得到四溴雙酚A衍生物TBBPA-DHEE的半抗原，為后續建立四溴雙酚A衍生物TBBPA-DHEE的生物分析方法提供了有利條件，該抗原目前尚無文獻報道。

技術實現要素：

本發明目的是克服現有技術的不足之處，提供了一種四溴雙酚A衍生物TBBPA-DHEE(4,4-雙(3,5-二溴-4-(2-羥基乙氧基)苯基)戊酸)半抗原的合成方法。

本發明的技術方案：一種四溴雙酚A衍生物TBBPA-DHEE半抗原，其結構簡式如下所示：

所述四溴雙酚A衍生物衍生物TBBPA-DHEE半抗原的合成方法，以雙酚酸為原料，通過4步反應得到半抗原。反應過程如下所示：

一種四溴雙酚A衍生物TBBPA-DHEE半抗原合成方法，合成步驟如下：

步驟1、以4,4-雙(4-羥苯基)戊酸為原料與甲醇發生酯化反應生成4,4-雙(4-羥基苯基)戊酸甲酯(a)，步驟如下：

稱取原料4,4-雙(4-羥苯基)戊酸裝入圓底燒瓶內，加入甲醇，回流反應得到化合物4,4-雙(4-羥基苯基)戊酸甲酯；

步驟2、通過化合物a與液溴發生取代反應生成4,4-雙(3,5-二溴-4-羥苯基)戊酸甲酯(b)，合成步驟如下：

把溶有Br₂的冰醋酸A慢慢加入到溶有4,4-雙(4-羥基苯基)戊酸甲酯的冰醋酸B中，持續攪拌；攪拌完成后，將得到的混合物倒入亞硫酸氫鈉的飽和水溶液除去未反應的Br₂；再將所得的產物通過過濾分離，并用冷水洗滌；產物干燥后，重新溶解在甲醇中攪拌均勻，濾除不溶物，濾液在真空下蒸發，得到粗產物，將其通過硅膠柱色譜法純化得到4,4-雙(3,5-二溴-4-羥苯基)戊酸甲酯；

步驟3、4,4-雙(3,5-二溴-4-羥基苯基)戊酸甲酯通過與2-溴乙醇發生取代反應，得到半抗原4,4-雙(3,5-二溴-4-(2-羥基乙氧基)苯基)戊酸甲酯(c)，合成步驟如下：

在二頸瓶中加入4,4-雙(3,5-二溴-4-羥基苯基)戊酸甲酯，碳酸鉀，2-溴乙醇，二甲基甲酰胺，恒溫反應，旋干二甲基甲酰胺，通過硅膠柱色譜法純化得到化合物4,4-雙(3,5-二溴-4-(2-羥基乙氧基)苯基)戊酸甲酯1.1g；

步驟4、化合物c通過與氫氧化鈉發生皂化反應，鹽酸酸化，得到半抗原4,4-雙(3,5-二溴-4-(2-羥基乙氧基)苯基)戊酸，合成步驟如下：

將4,4-雙(3,5-二溴-4-(2-羥基乙氧基)苯基)戊酸甲酯、氫氧化鈉混合，加入甲醇/水混合溶液，恒溫反應，反應完畢后，加鹽酸調節pH＝4～5，用二氯甲烷提取反應液三次，濃縮，通過硅膠柱色譜法純化得化合物4,4-雙(3,5-二溴-4-(2-羥基乙氧基)苯基)戊酸。

步驟1中，所述4,4-雙(4-羥苯基)戊酸、甲醇的用量比為2.86g：20mL，所述回流反應溫度為60℃，回流反應時間為2h。

步驟2中，所述冰醋酸A中，Br₂的濃度為16mol/L；所述冰醋酸B中，4,4-雙(4-羥基苯基)戊酸甲酯的濃度為0.24mol/L；所使用的冰醋酸A與冰醋酸B的體積比為1:4；所述持續攪拌的時間為5h。

步驟3中，所述4,4-雙(3,5-二溴-4-羥基苯基)戊酸甲酯、碳酸鉀、2-溴乙醇、二甲基甲酰胺的用量比為1.2g:0.552g:350μL:7mL；所述恒溫反應的溫度為100℃，恒溫反應時間為10h。

步驟4中，所述4,4-雙(3,5-二溴-4-(2-羥基乙氧基)苯基)戊酸甲酯、氫氧化鈉、甲醇/水混合溶液的用量比為1.1g:0.3g:25mL，所述甲醇/水混合溶液中，甲醇與水的體積比為1:1；所加入的鹽酸濃度為1mol/L；所述恒溫反應的溫度為60℃，恒溫反應時間為4h。

所制備的4,4-雙(3,5-二溴-4-(2-羥基乙氧基)苯基)戊酸用于載體蛋白BSA相偶聯，制備四溴雙酚A衍生物TBBPA-DHEE人工免疫抗原。

本發明的有益效果：本發明經過反復試驗成功的設計并合成了一種四溴雙酚A衍生物TBBPA-DHEE的半抗原，是一種新型的四溴雙酚A衍生物TBBPA-DHEE半抗原的合成方法，該方法不僅簡單、安全、可行，而且所得半抗原能與載體蛋白成功結合得到四溴雙酚A衍生物TBBPA-DHEE的人工抗原，使用該免疫原免疫動物，獲得了能特異性識別四溴雙酚A衍生物TBBPA-DHEE的單克隆和多克隆抗體，抗體效價高，特異性強，可廣泛用于四溴雙酚A衍生物TBBPA-DHEE的免疫分析研究。

附圖說明

圖1本發明制備的4,4-雙(3,5-二溴-4-(2-羥基乙氧基)苯基)戊酸的核磁共振氫譜圖；

圖2為本發明制備的4,4-雙(3,5-二溴-4-(2-羥基乙氧基)苯基)戊酸的質譜圖。

具體實施方式

為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。

實施例1

(1)以4,4-雙(4-羥苯基)戊酸為原料與甲醇發生酯化反應生成4,4-雙(4-羥基苯基)戊酸甲酯(a)，步驟如下：

稱取原料4,4-雙(4-羥苯基)戊酸2.86g裝入圓底燒瓶內，加入甲醇20ml，60℃回流2h得到化合物4,4-雙(4-羥基苯基)戊酸甲酯2.9g。產率96％。

(2)通過化合物a與液溴發生取代反應生成4,4-雙(3,5-二溴-4-羥苯基)戊酸甲酯(b)，合成步驟如下：

把10mL溶有25.7g,0.16mol Br₂的冰醋酸慢慢加入到40mL溶有2.9g，9.6mmol4,4-雙(4-羥基苯基)戊酸甲酯的冰醋酸中，持續攪拌5小時。將混合物倒入亞硫酸氫鈉的飽和水溶液除去未反應的Br₂。將所得的產物通過過濾分離，并用冷水洗滌。干燥后，將所得產物重新溶解在100mL甲醇中，攪拌30分鐘。不溶物通過過濾除去，濾液在真空下蒸發，得到粗產物，將其通過硅膠柱色譜法純化得到4,4-雙(3,5-二溴-4-羥苯基)戊酸甲酯(4.2g)。產率70％。

(3)4,4-雙(3,5-二溴-4-羥基苯基)戊酸甲酯通過與2-溴乙醇發生取代反應，得到半抗原4,4-雙(3,5-二溴-4-(2-羥基乙氧基)苯基)戊酸甲酯(c),合成步驟如下：

在二頸瓶中加入4,4-雙(3,5-二溴-4-羥基苯基)戊酸甲酯1.2g，加入碳酸鉀552mg，2-溴乙醇350μL，二甲基甲酰胺7ml，在100℃下反應10h，旋干二甲基甲酰胺,通過硅膠柱色譜法純化得到化合物4,4-雙(3,5-二溴-4-(2-羥基乙氧基)苯基)戊酸甲酯1.1g,產率80％。

(4)化合物c通過與氫氧化鈉發生皂化反應，鹽酸酸化，得到半抗原4,4-雙(3,5-二溴-4-(2-羥基乙氧基)苯基)戊酸(D₃)，合成步驟如下：

將1.1g 4,4-雙(3,5-二溴-4-(2-羥基乙氧基)苯基)戊酸甲酯、氫氧化鈉300mg混合，加入甲醇和水(1:1，25ml)，在60℃下反應4h結束，加1mol/L鹽酸調pH至4-5，用二氯甲烷提取反應液三次，濃縮，通過硅膠柱色譜法得化合物4,4-雙(3,5-二溴-4-(2-羥基乙氧基)苯基)戊酸(D₃)0.95g，產率85％。

所制備的4,4-雙(3,5-二溴-4-(2-羥基乙氧基)苯基)戊酸的表征見圖1、圖2，其中核磁共振氫譜如下：¹H NMR(CDCl3,400MHz)δ(ppm):1.56(s,3H),1.95(m,2H),2.32(m,2H),3.76(q,J＝5.6Hz,4H),3.97(t,J＝5.6Hz,4H),4.90(t,J＝5.6Hz,2H),7.45(s,4H),12.17(s,1H)。質譜結果如下：calculated for C21H22Br4O6:690.01；found:689.08([M-H+])。

實施例2

利用碳化二亞胺法將合成的四溴雙酚A衍生物TBBPA-DHEE半抗原D₃與載體蛋白BSA相偶聯，制備四溴雙酚A衍生物TBBPA-DHEE人工免疫抗原：

稱取400mg EDC·HCl和15mg BSA溶于2mL 0.01mol/L pH＝7.4的PBS溶液中，于磁力攪拌器上攪拌30min。稱取45mg半抗原D₃溶于1mL 0.01mol/L pH＝7.4的PBS溶液中，逐滴滴加到上述混合溶液中，室溫下攪拌1h，4℃放置過夜。將反應終液置于0.01mol/L pH＝7.4的PBS溶液中4℃透析，每4-12小時換透析一次液，共透析3天。透析結束后將透析袋中的蛋白溶液，即為四溴雙酚A人工抗原D₃-BSA分成若干等份分裝于1mL離心管中，于-20℃冰箱中存放備用。

以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。