本發明屬于生物醫療器械技術領域，特別涉及一種應用于第二代高通量測序的全自動DNA文庫制備裝置。

（二）

背景技術：

作為最重要的分子生物學分析方法之一，測序技術的出現不僅為遺傳信息的揭示和基因表達調控等基礎生物學研究提供重要數據，而且在基因診斷和基因治療等應用研究中也發揮著重要的作用。

高通量測序技術是測序發展歷程的一個里程碑,它為現代生命科學研究提供了前所未有的機遇。第二代高通量測序技術(二代測序)可進行基因組測序、轉錄組測序、基因表達調控、轉錄因子結合位點的檢測以及甲基化等研究。二代測序也是在目前用于解析遺傳病遺傳機制、藥物基因組學、腫瘤個性化治療、生物標記物鑒定等問題應用最為廣泛也最直接的技術手段。

在二代測序的實驗步驟中，測序文庫的制備是非常關鍵的一步。傳統測序文庫的制備需要樣本核酸提取、酶前處理或機械剪切、加接頭進行鏈結、PCR擴增等等工序，操作復雜，自動化程度不高。同時為了避免污染，以上操作需要在不同的實驗室中進行，對實驗室物理空間分布具有嚴格要求，并且需要操作人員經過專業培訓，否則將影響后續測序結果的準確性。

（三）

技術實現要素：

本發明為了彌補現有技術第二代測序文庫制備技術自動化程度低且操作過程中易引入污染，從而影響測序結果的準確性，并且操作程序專業繁瑣，非專業人士不能獨立完成的不足，提供了一種應用于第二代高通量測序的全自動DNA文庫制備裝置，該應用于第二代高通量測序的全自動DNA文庫制備裝置將建庫與純化的過程完全自動化，且實現全封閉操作，實現零污染、高重復性的文庫制備，也解決部分實驗室物理空間不足的難題。

本發明是通過如下技術方案實現的：

一種應用于第二代高通量測序的全自動DNA文庫制備裝置，包括盒體，盒體的頂面上設置進樣口，其特殊之處在于：還設置文庫轉移口，進樣口、文庫轉移口上設置可左右滑動以封閉或打開進樣口、文庫轉移口的密封蓋，盒體底部分別設置1個文庫收集池、1個樣品池、8個試劑倉、1個廢液槽，其中，樣品池與進樣口相對設置，文庫收集池與文庫轉移口相對設置，盒體內分別設置螺桿、取樣針，所述螺桿左、右兩端分別經軸承三、軸承四與盒體相應側轉動連接，螺桿水平設置，螺桿的右端伸出盒體，螺桿上設置連接件，該連接件與螺桿通過螺紋相連，連接件的頂面上設置有取樣針容置孔，取樣針容置孔的中心軸與螺桿的中心軸垂直，取樣針容置孔底部固定設置第一彈簧，第一彈簧與取樣針容置孔通軸設置，第一彈簧由取樣針容置孔底部向上延伸并伸出取樣針容置孔，取樣針套設在第一彈簧內，取樣針通過管道與負壓發生器連通，負壓發生器包括殼體、活塞和活塞桿，活塞桿上套有第二彈簧，活塞桿的自由端固定連接壓桿針的左端，壓桿針的右端伸出盒體，用于推進活塞桿，取樣針的上方設置有壓板，壓板包括壓板本體及與壓板本體連接的壓板軸，其中，壓板軸與螺桿平行設置，壓板軸的左端通過軸承一與盒體轉動連接，壓板軸的右端通過軸承二與盒體轉動連接， 壓板軸的右端伸出盒體。

應用于第二代高通量測序的全自動DNA文庫制備裝置測序方法，包括以下步驟：

將DNA文庫構建用到的所有試劑都預先放入盒體底部的試劑倉中，DNA樣品經片段化、末端修復、加接頭、PCR擴增并純化后，內部取樣針把構建好的文庫轉移至文庫收集池中，將盒體頂部的密封蓋打開，通過文庫轉移口取出構建好的文庫，然后放到測序平臺上進行測序。

所述的應用于第二代高通量測序的全自動DNA文庫制備裝置，其特殊之處在于：文庫制備所需的所有試劑分別置于試劑倉中，文庫收集池、廢液槽、試劑倉的開口端由錫箔紙封閉。

所述的應用于第二代高通量測序的全自動DNA文庫制備裝置，其特殊之處在于：文庫收集池、樣品池、試劑倉、廢液槽的上方設置多孔板，多孔板左、右端分別與盒體內壁固定設置，多孔板上的孔與試劑倉、廢液槽、樣品池、文庫收集池的開口端分別對應。

所述的應用于第二代高通量測序的全自動DNA文庫制備裝置，其特殊之處在于：盒體內壁設有限定壓板軸旋轉角度的壓板限位板，壓板限位板位于壓板本體下方，壓板限位板的中心軸與壓板軸垂直。

所述的應用于第二代高通量測序的全自動DNA文庫制備裝置，其特殊之處在于：軸承三、軸承四安裝處均安裝密封墊。

所述的應用于第二代高通量測序的全自動DNA文庫制備裝置，其特殊之處在于：

試劑倉中分別盛放的試劑為試劑組合一或試劑組合二，其中，

試劑組合一為：

試劑倉一：DNA片段化試劑混合液；

試劑倉二： EDTA溶液；

試劑倉三：無DNase、RNase水；

試劑倉四：CMPμre Beads；

試劑倉五：乙醇溶液；

試劑倉六：DNA末端修復及加A試劑混合液；

試劑倉七：Adaptor連接反應試劑混合液；

試劑倉八：PCR擴增試劑混合液。

試劑組合二為：

試劑倉一：DNA片段化試劑混合液；

試劑倉二： EDTA溶液；

試劑倉三：Nuclease-free Water；

試劑倉四：AMPμre Beads；

試劑倉五：乙醇溶液；

試劑倉六：DNA末端修復及加A試劑混合液；

試劑倉七：Adaptor連接反應試劑混合液；

試劑倉八：PCR擴增試劑混合液。

所述的應用于第二代高通量測序的全自動DNA文庫制備裝置，其特殊之處在于：試劑選擇組合一時，測序方法具體包括以下步驟：

文庫制備樣本：純化的雙鏈DNA，溶于超純水中，DNA濃度100-300 ng/μl，DNA純度：OD260/OD280=1.8-2.0。

試劑艙1-8中分別盛放試劑。

文庫制備流程如下：

以1 μg DNA樣本進行文庫制備，用移液器吸取10-15 μl樣本通過進樣口加入到樣品池中，封閉進樣口。

1、DNA片段化反應

外部機械操控盒體內部的小型移液器將樣品池中的3.3-10 μl DNA溶液轉移到試劑艙一中，同時從試劑艙三中轉移無DNase、RNase水5.8-12.5 μl到試劑艙一中，使反應總體積為20 μl，與試劑艙一中的DNA片段化試劑混合液發生反應。

反應條件：35-38℃ 溫育25-30分鐘。

然后從試劑艙二中吸取5 μl的0.5 M EDTA加入試劑艙一，終止酶促反應。

2、DNA片段純化

1）通過盒體內部小型移液器上下吸打10-15次將試劑艙四中的CMPure磁珠徹底混勻，然后轉移25 μl的磁珠液放到試劑艙一中；

2）盒體內部小型移液器上下吸打5-10次混勻，室溫靜置5-10分鐘；

3）控制外部機械的磁力架裝置上升至試劑艙一位置，靜置5-10分鐘，使磁珠和上清溶液分離；

4）盒體內部小型移液器吸取試劑艙一中的上清，轉移至廢液槽；

5）將磁力架降低，吸取試劑艙五中的80%乙醇60 μl至試劑艙一中，靜置30-60秒；

6）將磁力架上升至試劑艙一位置，靜置5-10分鐘，使磁珠和上清溶液分離，吸取試劑艙一中的上清，轉移至廢液槽；

7）重復步驟5、6；

8）室溫靜置10-15分鐘，使磁珠在空氣中干燥；

9）將磁力架降低，吸取試劑艙三中的無DNase、RNase水35-40 μl至試劑艙一中，利用盒體內部小型移液器上下吸打5-10次混勻，室溫靜置5-10分鐘；

10）將磁力架上升至試劑艙一位置，使磁珠與洗脫的DNA分離。

3、DNA末端修復反應及加A反應：

1）轉移試劑艙一中的DNA純化溶液25 μl至試劑艙六中，然后轉移試劑艙三中的無DNase、RNase水31.5 μl至試劑艙六，利用盒體內部小型移液器上下吸打5-10次混勻，與試劑艙六中的DNA末端修復反應及加A反應混合液進行反應；

2）反應程序如下：12-15℃ 15-20 min；35-37℃ 15-20 min；70-72℃ 20-25 min；4℃保持。

4、末端修復DNA的純化

1）通過盒體內部小型移液器上下吸打10-15次將試劑艙四中的CMPure磁珠徹底混勻，然后轉移65 μl的磁珠液放到試劑艙六中；

2）盒體內部小型移液器上下吸打5-10次混勻，室溫靜置5-10分鐘；

3）將磁力架上升至試劑艙六位置，靜置5-10分鐘，使磁珠和上清溶液分離；

4）吸取試劑艙六中的上清，轉移至廢液槽；

5）將磁力架降低，吸取試劑艙五中的80%乙醇100 μl至試劑艙六中，靜置30-60秒；

6）將磁力架上升至試劑艙六位置，靜置5-10分鐘，使磁珠和上清溶液分離，吸取試劑艙六中的上清，轉移至廢液槽；

7）重復步驟5、6；

8）室溫靜置10-15分鐘，使磁珠在空氣中干燥；

9）將磁力架降低，吸取試劑艙三中的無DNase、RNase水75 μl至試劑艙六中，利用小型移液器上下吸打5-10次，室溫靜置5-10分鐘；

10）將磁力架上升至試劑艙六位置，使磁珠與洗脫的DNA分離。

5、連接adaptor

1）吸取試劑艙六中的DNA純化溶液65 μl 至試劑艙七中，與試劑艙七中的Adaptor連接反應試劑混合液反應；

2）利用盒體內部小型移液器上下吸打5-10次混勻；

3）反應條件：20-25℃溫育15-20分鐘。

6、連接adaptor的DNA片段選擇性回收

1）通過盒體內部小型移液器上下吸打10-15次將試劑艙四中的CMPure磁珠徹底混勻，然后轉移83.5 μl的磁珠液放到試劑艙七中；

2）利用盒體內部小型移液器上下吸打5-10次，室溫靜置5-10分鐘；

3）將磁力架上升至試劑艙七位置，靜置5-10分鐘，使磁珠和上清溶液分離；

4）吸取試劑艙七中的上清，轉移至廢液槽；

5）將磁力架降低，吸取試劑艙五中的80%乙醇100 μl至試劑艙七中，靜置30-60秒；

6）將磁力架上升至試劑艙七位置，靜置5-10分鐘，使磁珠和上清溶液分離，吸取試劑艙七中的上清，轉移至廢液槽；

7）重復步驟5、6；

8）室溫靜置10-15分鐘，使磁珠在空氣中干燥；

9）將磁力架降低，吸取試劑艙三中的無DNase、RNase水30 μl至試劑艙七中，利用盒體內部小型移液器上下吸打5-10次，室溫靜置5-10分鐘；

10）將磁力架上升至試劑艙七位置，使磁珠與洗脫的DNA分離。

7、PCR擴增

吸取試劑艙七中的連接adaptor后的DNA選擇性回收片段23 μl，轉移至試劑艙八中，與試劑艙八中的PCR擴增試劑混合液反應。

反應程序如下：預變性 95-98℃ 30-45 s；變性 95-98℃ 10-15 s；退火 60-65℃ 30-40 s；延伸 70-72℃ 30-40 s；6-10個循環；終延伸 70-72℃ 4-5 min。

8、PCR產物純化

1）通過盒體內部小型移液器上下吸打10-15次將試劑艙四中的CMPure磁珠徹底混勻，然后轉移50 μl的磁珠液放到試劑艙八中；

2）利用盒體內部小型移液器上下吸打5-10次，室溫靜置5-10分鐘；

3）將磁力架上升至試劑艙八位置，靜置5-10分鐘，使磁珠和上清溶液分離；

4）吸取試劑艙八中的上清，轉移至廢液槽；

5）將磁力架降低，吸取試劑艙五中的80%乙醇60 μl至試劑艙八中，靜置30-60秒；

6）將磁力架上升至試劑艙八位置，使磁珠和上清溶液分離，靜置5-10分鐘，吸取試劑艙八中的上清，轉移至廢液槽；

7）重復步驟5、6；

8）室溫靜置10分鐘，使磁珠在空氣中干燥；

9）將磁力架降低，吸取試劑艙三中的無DNase、RNase水35-40 μl至試劑艙八中，利用盒體內部小型移液器上下吸打5-10次，室溫靜置5-10分鐘；

10）將磁力架上升至試劑艙八位置，使磁珠與PCR產物分離。

9、取出PCR產物

將試劑艙八中的PCR純化溶液25-30 μl轉移至文庫收集池，通過文庫轉移口從外部將PCR純化DNA溶液移出盒體，即可拿到測序平臺上進行簇生成和測序，或將DNA文庫存放在-20℃保存。

所述的應用于第二代高通量測序的全自動DNA文庫制備裝置，其特殊之處在于：

試劑選擇組合二時，測序方法具體包括以下步驟：

文庫制備樣本：純化的雙鏈DNA，溶于超純水中，DNA濃度100-300 ng/μl，DNA純度：OD260/OD280=1.8-2.0。

試劑艙1-8中分別盛放試劑。

文庫制備流程如下：

以1 μg DNA樣本進行文庫制備，用移液器吸取10-20 μl樣本通過進樣孔加入到樣品池中，封閉進樣孔，。

1、DNA片段化反應

外部機械操控盒體內部的小型移液器將樣品池中的3.3-10 μl DNA溶液轉移到試劑艙一中，同時從試劑艙三中轉移Nuclease-free Water 5.8-12.5 μl到試劑艙一中，使反應總體積為20 μl，與試劑艙一中的DNA片段化試劑混合液發生反應。

反應條件：35-38℃ 溫育30-40分鐘。

然后從試劑艙二中吸取5 μl的0.5 M EDTA加入試劑艙一，終止酶促反應。

2、DNA片段純化

1）通過盒體內部小型移液器上下吸打10-15次將試劑艙四中的AMPure磁珠徹底混勻，然后轉移35 μl的磁珠液放到試劑艙一中；

2）盒體內部小型移液器上下吸打5-10次混勻，室溫靜置5-10分鐘；

3）控制外部機械的磁力架裝置上升至試劑艙一位置，靜置5-10分鐘，使磁珠和上清溶液分離；

4）盒體內部小型移液器吸取試劑艙一中的上清，轉移至廢液槽；

5）將磁力架降低，吸取試劑艙五中的80%乙醇60 μl至試劑艙一中，靜置30-60秒；

6）將磁力架上升至試劑艙一位置，靜置5-10分鐘，使磁珠和上清溶液分離。吸取試劑艙一中的上清，轉移至廢液槽；

7）重復步驟5、6；

8）室溫靜置10-15分鐘，使磁珠在空氣中干燥；

9）將磁力架降低，吸取試劑艙三中的 Nuclease-free Water 30-35 μl至試劑艙一中，利用盒體內部小型移液器上下吸打5-10次混勻，室溫靜置5-10分鐘；

10）將磁力架上升至試劑艙一位置，使磁珠與洗脫的DNA分離。

3、DNA末端修復反應及加A反應：

1）轉移試劑艙一中的DNA純化溶液20 μl至試劑艙六中，利用盒體內部小型移液器上下吸打5-10次混勻，與試劑艙六中的DNA末端修復反應及加A反應混合液進行反應；

2）反應程序如下：22-25℃ 18-22 min；70-72℃ 20-25 min；4℃保持。

4、末端修復DNA的純化

1）通過盒體內部小型移液器上下吸打10-15次將試劑艙四中的AMPure磁珠徹底混勻，然后轉移80 μl的磁珠液放到試劑艙六中；

2）盒體內部小型移液器上下吸打5-10次混勻，室溫靜置5-10分鐘；

3）將磁力架上升至試劑艙六位置，靜置5-10分鐘，使磁珠和上清溶液分離；

4）吸取試劑艙六中的上清，轉移至廢液槽；

5）將磁力架降低，吸取試劑艙五中的80%乙醇100 μl至試劑艙六中，靜置30-60秒；

6）將磁力架上升至試劑艙六位置，靜置5-10分鐘，使磁珠和上清溶液分離，吸取試劑艙六中的上清，轉移至廢液槽；

7）重復步驟5、6；

8）室溫靜置10-15分鐘，使磁珠在空氣中干燥；

9）將磁力架降低，吸取試劑艙三中的 Nuclease-free Water 60 μl至試劑艙六中，利用小型移液器上下吸打5-10次，室溫靜置5-10分鐘；

10）將磁力架上升至試劑艙六位置，使磁珠與洗脫的DNA分離。

5、連接adaptor

1）吸取試劑艙六中的DNA純化溶液50 μl 至試劑艙七中，與試劑艙七中的Adaptor連接反應試劑混合液反應；

2）利用盒體內部小型移液器上下吸打10-15次混勻；

3）反應條件：22-25℃溫育15-20分鐘。

6、連接adaptor的DNA片段選擇性回收

1）通過盒體內部小型移液器上下吸打10-15次將試劑艙四中的AMPure磁珠徹底混勻，然后轉移60 μl的磁珠液放到試劑艙七中；

2）利用盒體內部小型移液器上下吸打5-10次，室溫靜置5-10分鐘；

3）將磁力架上升至試劑艙七位置，靜置5-10分鐘，使磁珠和上清溶液分離；

4）吸取試劑艙七中的上清，轉移至廢液槽；

5）將磁力架降低，吸取試劑艙五中的80%乙醇200 μl至試劑艙七中，靜置30-60秒；

6）將磁力架上升至試劑艙七位置，靜置5-10分鐘，使磁珠和上清溶液分離，吸取試劑艙七中的上清，轉移至廢液槽；

7）重復步驟5、6；

8）室溫靜置5-10分鐘，使磁珠在空氣中干燥；

9）將磁力架降低，吸取試劑艙三中的 Nuclease-free Water 30 μl至試劑艙七中，利用盒體內部小型移液器上下吸打5-10次，室溫靜置5-10分鐘；

10）將磁力架上升至試劑艙七位置，使磁珠與洗脫的DNA分離。

7、PCR擴增

吸取試劑艙七中的連接adaptor后的DNA選擇性回收片段20 μl，轉移至試劑艙八中，與試劑艙八中的PCR擴增試劑混合液反應。

反應程序如下：預變性 95-98℃ 2-2.5 min；變性 95-98℃ 30-40 s；退火 60-65℃ 30-40 s；延伸 70-72℃ 60-90 s；4-10個循環；終延伸 70-72℃ 4-5 min。

8、PCR產物純化

1）通過盒體內部小型移液器上下吸打10-15次將試劑艙四中的AMPure磁珠徹底混勻，然后轉移40 μl的磁珠液放到試劑艙八中；

2）利用盒體內部小型移液器上下吸打5-10次，室溫靜置5-10分鐘；

3）將磁力架上升至試劑艙八位置，靜置5-10分鐘，使磁珠和上清溶液分離；

4）吸取試劑艙八中的上清，轉移至廢液槽；

5）將磁力架降低，吸取試劑艙五中的80%乙醇200 μl至試劑艙八中，靜置30-60秒；

6）將磁力架上升至試劑艙八位置，使磁珠和上清溶液分離，靜置5-10分鐘，吸取試劑艙八中的上清，轉移至廢液槽；

7）重復步驟5、6；

8）室溫靜置5-10分鐘，使磁珠在空氣中干燥；

9）將磁力架降低，吸取試劑艙三中的 Nuclease-free Water 35-40μl至試劑艙八中，利用盒體內部小型移液器上下吸打5-10次，室溫靜置5-10分鐘；

10）將磁力架上升至試劑艙八位置，使磁珠與PCR產物分離。

9、取出PCR產物

將試劑艙八中的PCR純化溶液25-30 μl轉移至文庫收集池，通過文庫轉移孔從外部將PCR純化DNA溶液移出盒體，即可拿到測序平臺上進行簇生成和測序，也可將DNA文庫存放在-20℃保存。

所述的應用于第二代高通量測序的全自動DNA文庫制備裝置，其特征在于：文庫制備方法具體還包括步驟：

文庫質量檢測：制備好的DNA文庫用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA文庫中的片段長度分布范圍，若構建的文庫質量良好，可以直接進行測序。

本發明有益效果：本發明將DNA文庫構建用到的所有試劑都預先放入盒體底部的試劑倉中，DNA樣品經片段化、末端修復、加接頭、PCR擴增并純化后，內部取樣針把構建好的文庫轉移至文庫收集池中，將盒體頂部的密封蓋打開，通過文庫轉移口取出構建好的文庫，然后就可以放到測序平臺上進行后續的測序。將DNA樣品由進樣口加至樣品池后密封進樣口，構建過程產生的廢液等都存放在盒體底部的廢液槽內，整個建庫過程都在盒體內部完成，全程封閉，不與外界接觸，不會產生污染，解決了科研及臨床試驗工作中讓人頗為頭疼的污染問題，同時解放了人工，即使是本領域內的普通技術人員都能獨立操作實施，提高了效率。

（四）附圖說明

下面結合附圖對本發明作進一步的說明。

附圖1為本發明裝置的結構示意圖；

附圖2為本發明壓板和壓板限位板的位置關系示意圖；

附圖3為本發明螺桿與連接件的位置關系示意圖，

圖中，1盒體，11進樣口，2壓板軸，21軸承一， 23軸承二，24壓板限位板，25壓板本體，26壓板軸，3取樣針，31活塞，32負壓發生器，33第二彈簧，34壓桿針，35第一彈簧，36管道，4螺桿，41軸承三，42軸承四，44連接件，5樣品池，61試劑倉一，62試劑倉二，63試劑倉三 ，64試劑倉四，65試劑倉五，66試劑倉六，67試劑倉七，68試劑倉八，7廢液槽 ，8錫箔，9多孔板，12文庫轉移口，13文庫收集池。

（五）具體實施方式

本實施例應用于第二代高通量測序的全自動DNA文庫制備裝置包括盒體1，盒體1的頂面上設置進樣口11，其特征在于：還設置文庫轉移口12，進樣口11、文庫轉移口12上設置可左右滑動以封閉或打開進樣口11、文庫轉移口12的密封蓋，盒體1底部從左往右依次設置1個文庫收集池13、1個樣品池5、8個試劑倉61-68、1個廢液槽7，試劑倉一 61、 試劑倉二 62、 試劑倉三 63、試劑倉四 64、試劑倉五 65、試劑倉六66、試劑倉七 67、試劑倉八68、樣品池 5 和文庫收集池13、廢液槽7的頂部位于同一平面，文庫制備所需的所有試劑均置于試劑倉61-68中，為避免試劑被污染，文庫收集池13、廢液槽7、試劑倉61-68的開口端由錫箔8封閉，樣品池5的開口端未封閉。樣品池5與進樣口11相對設置，可以使用移液器將建庫樣本通過進樣口11加入到樣品池5中；文庫收集池13與文庫轉移口12相對設置，用于盛放最終構建好的文庫，可以用移液器通過文庫轉移口12將制備好的文庫吸出儲存或直接用于測序；廢液槽7用于盛裝文庫制備過程中產生的所有廢液。

試劑倉一 61、 試劑倉二 62、 試劑倉三 63、試劑倉四 64、試劑倉五 65、試劑倉六 66、試劑倉七 67、試劑倉八68、廢液槽7、樣品池 5 和文庫收集池13的上部設置有多孔板 9，多孔板 9 與盒體 1 內壁固定連接，多孔板 9 上的孔分別對應試劑倉一 61、 試劑倉二 62、 試劑倉三 63、試劑倉四 64、試劑倉五 65、試劑倉六66、試劑倉七 67、試劑倉八68、廢液槽7、樣品池 5 和文庫收集池13的開口端。盒體1內分別設置螺桿4、取樣針3，所述螺桿4左、右兩端分別經軸承三41、軸承四42與盒體1相應側轉動連接，螺桿4水平設置，螺桿4的右端伸出盒體1與螺桿旋鈕相連，螺桿4上設置連接件44，該連接件44與螺桿4通過螺紋相連，轉動螺桿旋鈕，連接件44與螺桿4相對運動，連接件44的頂面上設置有取樣針容置孔 45，取樣針容置孔 45 的中心軸與螺桿 4 的中心軸垂直，取樣針容置孔 45 底部固定設置第一彈簧 35，第一彈簧 35 與取樣針容置孔 45 通軸設置，第一彈簧 35 由取樣針容置孔 35底部向上延伸并伸出取樣針容置孔 45，取樣針 3 套設在第一彈簧 35 內，旋轉螺桿旋鈕，取樣針隨著連接件 44在試劑倉61-68、樣品池 5、廢液槽 7、文庫收集池13之間的移動，取樣針 3 通過管道 36 與負壓發生器 32 連通，負壓發生器 32 包括殼體、活塞 31 和活塞桿，活塞桿上套有第二彈簧 33，活塞桿的自由端固定連接壓桿針 34 的左端，壓桿針 34 的右端伸出盒體 1，用于推進活塞桿，當不推動壓桿針 34 時，第二彈簧 33將壓桿針 34 彈回原位，取樣針 3 的上方設置有壓板 2，壓板 2 包括壓板本體 25 及與壓板本體 25連接的壓板軸 26，其中，壓板軸 26 與螺桿 4 平行設置， 壓板軸 26 的左端通過軸承一 21 與盒體 1 轉動連接，壓板軸 26 的右端通過軸承二 23 與盒體 1 轉動連接， 壓板軸 26 的右端伸出盒體 1與壓板旋轉相連。壓板本體 25 用于向下按壓取樣針 3，旋轉壓板旋鈕，壓板軸 26 帶動壓板本體 25向下按壓取樣針 3，不旋轉壓板旋鈕時，第一彈簧 35 將壓板本體 25 彈回原位。故盒體內部的取樣針3，通過活塞31、負壓發生器32、第二彈簧33及第一彈簧35的作用實現在盒體底部不同試劑倉61-68間左右以及上下移動，完成液體的吸取與釋放。試劑倉61-68，可按順序加入DNA片段化、片段末端修復、加接頭、PCR擴增和純化所需的各種試劑，然后用錫箔紙密封，實現文庫制備過程的全封閉、零污染。各試劑倉放置試劑依次為：試劑倉一61（盛放DNA片段化試劑混合液）、試劑倉二62（盛放EDTA溶液）、試劑倉三63（盛放無DNase、RNase水）、試劑倉四64（盛放DNA片段選擇性回收磁珠）、試劑倉五65（盛放乙醇溶液）、試劑倉六66（盛放DNA末端修復及加A試劑混合液）、試劑倉七67（盛放Adaptor連接反應試劑混合液）、試劑倉八68（盛放PCR擴增試劑混合液）。

盒體 1內壁還固定設置有用于限定壓板軸 26旋轉角度的壓板限位板 24，壓板限位板 24 位于壓板本體 25 下方，壓板限位板 24 的中心軸與壓板軸 26 垂直，壓板軸 26 轉至一定角度時，壓板 25 與壓板限位板 24 接觸，壓板軸 26 不能繼續旋轉。

本發明的全自動文庫制備裝置與外部機械部分配合使用，外部機械由控制系統控制，可以在控制系統上輸入指令，按照檢測步驟設置好取液間隔、取哪個試劑倉中的試劑以及吸取試劑的體積等。樣品由進樣口11注入樣品池5，封閉進樣口11；外部機械根據設定好的步驟操作內部的取樣針在不同試劑倉間左右以及上下移動，完成液體的吸取與釋放，完成文庫制備的一系列流程。最終制備好的文庫集中于文庫收集池13，手動使用移液器將制備好的文庫吸出，儲存或直接進行測序。

實施例1

本實施例應用于第二代高通量測序的全自動DNA文庫制備裝置的測序步驟如下：

文庫制備樣本：純化的雙鏈DNA，溶于超純水中。DNA濃度280 ng/μl，DNA純度：OD260/OD280=1.8。

試劑艙1-8中分別盛放的試劑及體積為：

試劑艙一：DNA片段化試劑混合液4.2 ul（主要成分：10X dsDNA Fragmentase Reaction Bμffer 2 μl、100X BSA (100 mg/ml) 0.2 μl、dsDNA Fragmentase 2 μl）；

試劑艙二：0.5M 的EDTA 10μl；

試劑艙三：無DNase、RNase水 310μl；

試劑艙四：CMPμre Beads 310μl；

試劑艙五：80%乙醇 900μl；

試劑艙六：DNA末端修復及加A試劑混合液8.5 μl（主要成分：10x End Repair Reaction Buffer 6.5 μl、End Prep Enzyme Mix 2 μl）

試劑艙七：Adaptor連接反應試劑混合液18.5 μl（主要成分：T4 DNA ligase buffer 14 μl、T4 DNA ligase 2 μl、Adaptor 2.5 μl）；

試劑艙八：PCR擴增試劑混合液27 μl（主要成分：HiFidelity 2X PCR Master Mix 25 μl、univesial primer 1μl、Index primer 1μl）。

文庫制備流程如下：

以1 μg DNA樣本進行文庫制備，用移液器吸取10 μl樣本通過進樣口加入到樣品池中，封閉進樣口。用手將盒體快速甩兩下，以確保所有試劑都集中于試劑艙底部。（以下所有反應程序都通過控制系統的軟件程序操控外部機械來實現。）

1、DNA片段化反應

外部機械操控盒體內部的小型移液器將樣品池中的3.6μl DNA溶液轉移到試劑艙一中，同時從試劑艙三中轉移無DNase、RNase水12.2μl到試劑艙一中（使反應總體積為20 μl），與試劑艙一中的DNA片段化試劑混合液發生反應。

反應條件：35℃ 溫育25分鐘。

然后從試劑艙二中吸取5 μl的0.5 M EDTA加入試劑艙一，終止酶促反應。

2、DNA片段純化

1）通過盒體內部小型移液器上下吸打15次將試劑艙四中的CMPure磁珠徹底混勻，然后轉移25 μl的磁珠液放到試劑艙一中；

2）盒體內部小型移液器上下吸打10次混勻，室溫靜置5分鐘；

3）控制外部機械的磁力架裝置上升至試劑艙一位置，靜置5分鐘，使磁珠和上清溶液分離；

4）盒體內部小型移液器吸取試劑艙一中的上清，轉移至廢液槽；

5）將磁力架降低，吸取試劑艙五中的80%乙醇60 μl至試劑艙一中，靜置30秒；

6）將磁力架上升至試劑艙一位置，靜置5分鐘，使磁珠和上清溶液分離。吸取試劑艙一中的上清，轉移至廢液槽；

7）重復步驟5、6；

8）室溫靜置10分鐘，使磁珠在空氣中干燥；

9）將磁力架降低，吸取試劑艙三中的無DNase、RNase水35 μl至試劑艙一中，利用盒體內部小型移液器上下吸打10次混勻，室溫靜置5分鐘；

10）將磁力架上升至試劑艙一位置，使磁珠與洗脫的DNA分離。

3、DNA末端修復反應及加A反應：

1）轉移試劑艙一中的DNA純化溶液25 μl至試劑艙六中，然后轉移試劑艙三中的無DNase、RNase水31.5 μl至試劑艙六，利用盒體內部小型移液器上下吸打10次混勻，與試劑艙六中的DNA末端修復反應及加A反應混合液進行反應；

2）反應程序如下：12℃ 20 min；35℃ 15 min；70℃ 25 min；4℃保持。

4、末端修復DNA的純化

1）通過盒體內部小型移液器上下吸打10次將試劑艙四中的CMPure磁珠徹底混勻，然后轉移65 μl的磁珠液放到試劑艙六中；

2）盒體內部小型移液器上下吸打5次混勻，室溫靜置10分鐘；

3）將磁力架上升至試劑艙六位置，靜置5分鐘，使磁珠和上清溶液分離；

4）吸取試劑艙六中的上清，轉移至廢液槽；

5）將磁力架降低，吸取試劑艙五中的80%乙醇100 μl至試劑艙六中，靜置60秒；

6）將磁力架上升至試劑艙六位置，靜置5分鐘，使磁珠和上清溶液分離，吸取試劑艙六中的上清，轉移至廢液槽；

7）重復步驟5、6；

8）室溫靜置10分鐘，使磁珠在空氣中干燥；

9）將磁力架降低，吸取試劑艙三中的無DNase、RNase水75 μl至試劑艙六中，利用小型移液器上下吸打10次，室溫靜置5分鐘；

10）將磁力架上升至試劑艙六位置，使磁珠與洗脫的DNA分離。

5、連接adaptor

1）吸取試劑艙六中的DNA純化溶液65 μl 至試劑艙七中，與試劑艙七中的Adaptor連接反應試劑混合液反應；

2）利用盒體內部小型移液器上下吸打5次混勻；

3）反應條件：20℃溫育15分鐘。

6、連接adaptor的DNA片段選擇性回收

1）通過盒體內部小型移液器上下吸打15次將試劑艙四中的CMPure磁珠徹底混勻，然后轉移83.5 μl的磁珠液放到試劑艙七中；

2）利用盒體內部小型移液器上下吸打5次，室溫靜置10分鐘；

3）將磁力架上升至試劑艙七位置，靜置10分鐘，使磁珠和上清溶液分離；

4）吸取試劑艙七中的上清，轉移至廢液槽；

5）將磁力架降低，吸取試劑艙五中的80%乙醇100 μl至試劑艙七中，靜置30秒；

6）將磁力架上升至試劑艙七位置，靜置5分鐘，使磁珠和上清溶液分離，吸取試劑艙七中的上清，轉移至廢液槽；

7）重復步驟5、6；

8）室溫靜置10分鐘，使磁珠在空氣中干燥；

9）將磁力架降低，吸取試劑艙三中的無DNase、RNase水30 μl至試劑艙七中，利用盒體內部小型移液器上下吸打10次，室溫靜置5分鐘；

10）將磁力架上升至試劑艙七位置，使磁珠與洗脫的DNA分離。

7、PCR擴增

吸取試劑艙七中的連接adaptor后的DNA選擇性回收片段23 μl，轉移至試劑艙八中，與試劑艙八中的PCR擴增試劑混合液反應。

反應程序如下：預變性 95℃ 30 s；變性 95℃ 10 s；退火 60℃ 30s；延伸 70℃ 40 s；6個循環；終延伸 70℃ 4 min。

8、PCR產物純化

1）通過盒體內部小型移液器上下吸打10次將試劑艙四中的CMPure磁珠徹底混勻，然后轉移50 μl的磁珠液放到試劑艙八中；

2）利用盒體內部小型移液器上下吸打5次，室溫靜置10分鐘；

3）將磁力架上升至試劑艙八位置，靜置5分鐘，使磁珠和上清溶液分離；

4）吸取試劑艙八中的上清，轉移至廢液槽；

5）將磁力架降低，吸取試劑艙五中的80%乙醇60 μl至試劑艙八中，靜置30秒；

6）將磁力架上升至試劑艙八位置，使磁珠和上清溶液分離，靜置10分鐘，吸取試劑艙八中的上清，轉移至廢液槽；

7）重復步驟5、6；

8）室溫靜置10分鐘，使磁珠在空氣中干燥；

9）將磁力架降低，吸取試劑艙三中的無DNase、RNase水35 μl至試劑艙八中，利用盒體內部小型移液器上下吸打10次，室溫靜置5分鐘；

10）將磁力架上升至試劑艙八位置，使磁珠與PCR產物分離。

9、取出PCR產物

將試劑艙八中的PCR純化溶液25μl轉移至文庫收集池，通過文庫轉移口從外部將PCR純化DNA溶液移出盒體，即可拿到測序平臺上進行簇生成和測序，也可將DNA文庫存放在-20℃保存。

10、文庫質量檢測

制備好的DNA文庫用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA文庫中的片段長度分布范圍，若構建的文庫質量良好，可以直接進行測序。

實施例2

本實施例應用于第二代高通量測序的全自動DNA文庫制備裝置的測序步驟中，

文庫制備樣本，DNA濃度100 ng/μl，DNA純度：OD260/OD280=2.0。

試劑艙二：0.5M 的EDTA 20 μl；

試劑艙三：無DNase、RNase水350 μl；

試劑艙四：CMPμre Beads 350 μl；

試劑艙五：80%乙醇 1100 μl；

文庫制備流程中，以1 μg DNA樣本進行文庫制備，用移液器吸取15 μl樣本通過進樣口加入到樣品池中，封閉進樣口。

1、DNA片段化反應

外部機械操控盒體內部的小型移液器將樣品池中的10μl DNA溶液轉移到試劑艙一中，同時從試劑艙三中轉移無DNase、RNase水5.8 μl到試劑艙一中（使反應總體積為20 μl），與試劑艙一中的DNA片段化試劑混合液發生反應。

反應條件：38℃ 溫育30分鐘。

2、DNA片段純化

1）通過盒體內部小型移液器上下吸打10次將試劑艙四中的CMPure磁珠徹底混勻，然后轉移25 μl的磁珠液放到試劑艙一中；

2）盒體內部小型移液器上下吸打5次混勻，室溫靜置10分鐘；

3）控制外部機械的磁力架裝置上升至試劑艙一位置，靜置10分鐘，使磁珠和上清溶液分離；

6）將磁力架上升至試劑艙一位置，靜置10分鐘，使磁珠和上清溶液分離。吸取試劑艙一中的上清，轉移至廢液槽；

8）室溫靜置15分鐘，使磁珠在空氣中干燥；

9）將磁力架降低，吸取試劑艙三中的無DNase、RNase水40 μl至試劑艙一中，利用盒體內部小型移液器上下吸打5次混勻，室溫靜置10分鐘。

3、DNA末端修復反應及加A反應：

2）反應程序如下： 15℃ 15 min； 37℃ 20 min； 72℃ 20min；4℃保持。

4、末端修復DNA的純化

2）盒體內部小型移液器上下吸打10次混勻，室溫靜置5分鐘；

3）將磁力架上升至試劑艙六位置，靜置10分鐘，使磁珠和上清溶液分離；

5）將磁力架降低，吸取試劑艙五中的80%乙醇100 μl至試劑艙六中，靜置60秒；

6）將磁力架上升至試劑艙六位置，靜置10分鐘，使磁珠和上清溶液分離，吸取試劑艙六中的上清，轉移至廢液槽；

8）室溫靜置15分鐘，使磁珠在空氣中干燥；

9）將磁力架降低，吸取試劑艙三中的無DNase、RNase水75 μl至試劑艙六中，利用小型移液器上下吸打5次，室溫靜置5分鐘。

5、連接adaptor

2）利用盒體內部小型移液器上下吸打10次混勻；

3）反應條件： 25℃溫育20分鐘。

6、連接adaptor的DNA片段選擇性回收

1）通過盒體內部小型移液器上下吸打10次將試劑艙四中的CMPure磁珠徹底混勻，然后轉移83.5 μl的磁珠液放到試劑艙七中；

2）利用盒體內部小型移液器上下吸打10次，室溫靜置5分鐘；

3）將磁力架上升至試劑艙七位置，靜置5分鐘，使磁珠和上清溶液分離；

5）將磁力架降低，吸取試劑艙五中的80%乙醇100 μl至試劑艙七中，靜置60秒；

6）將磁力架上升至試劑艙七位置，靜置10分鐘，使磁珠和上清溶液分離，吸取試劑艙七中的上清，轉移至廢液槽；

8）室溫靜置15分鐘，使磁珠在空氣中干燥；

9）將磁力架降低，吸取試劑艙三中的無DNase、RNase水30 μl至試劑艙七中，利用盒體內部小型移液器上下吸打5次，室溫靜置10分鐘。

7、PCR擴增

反應程序如下：預變性 98℃ 45 s；變性 98℃ 15 s；退火65℃ 40 s；延伸 72℃ 30 s； 10個循環；終延伸 72℃ 5 min。

8、PCR產物純化

1）通過盒體內部小型移液器上下吸打15次將試劑艙四中的CMPure磁珠徹底混勻，然后轉移50 μl的磁珠液放到試劑艙八中；

2）利用盒體內部小型移液器上下吸打10次，室溫靜置5分鐘；

3）將磁力架上升至試劑艙八位置，靜置10分鐘，使磁珠和上清溶液分離；

5）將磁力架降低，吸取試劑艙五中的80%乙醇60 μl至試劑艙八中，靜置60秒；

6）將磁力架上升至試劑艙八位置，使磁珠和上清溶液分離，靜置5分鐘，吸取試劑艙八中的上清，轉移至廢液槽；

9）將磁力架降低，吸取試劑艙三中的無DNase、RNase水40 μl至試劑艙八中，利用盒體內部小型移液器上下吸打5次，室溫靜置10分鐘。

9、取出PCR產物

將試劑艙八中的PCR純化溶液30 μl轉移至文庫收集池，通過文庫轉移口從外部將PCR純化DNA溶液移出盒體，即可拿到測序平臺上進行簇生成和測序，也可將DNA文庫存放在-20℃保存。

其他與實施例1相同。

實施例3

本實施例應用于第二代高通量測序的全自動DNA文庫制備裝置的測序步驟中：

文庫制備樣本：DNA濃度300 ng/μl，DNA純度：OD260/OD280=1.9。

試劑艙二：0.5M 的EDTA 15μl；

試劑艙三：無DNase、RNase水 330μl；

試劑艙四：CMPμre Beads 320 μl；

試劑艙五：80%乙醇1000μl。

文庫制備流程中，以1 μg DNA樣本進行文庫制備，用移液器吸取12 μl樣本通過進樣口加入到樣品池中，封閉進樣口。

1、DNA片段化反應

外部機械操控盒體內部的小型移液器將樣品池中的3.3μl DNA溶液轉移到試劑艙一中，同時從試劑艙三中轉移無DNase、RNase水12.5 μl到試劑艙一中（使反應總體積為20 μl），與試劑艙一中的DNA片段化試劑混合液發生反應。

反應條件：37℃ 溫育30分鐘。

2、DNA片段純化

9）將磁力架降低，吸取試劑艙三中的無DNase、RNase水38μl至試劑艙一中，利用盒體內部小型移液器上下吸打10次混勻，室溫靜置6分鐘。

9、取出PCR產物

將試劑艙八中的PCR純化溶液28μl轉移至文庫收集池，通過文庫轉移口從外部將PCR純化DNA溶液移出盒體，即可拿到測序平臺上進行簇生成和測序，也可將DNA文庫存放在-20℃保存。

其他與實施例1相同。

實施例4

本實施例應用于第二代高通量測序的全自動DNA文庫制備裝置的測序步驟如下：

文庫制備樣本：純化的雙鏈DNA，溶于超純水中。DNA濃度300 ng/μl，DNA純度：OD260/OD280=1.8。

試劑艙1-8中分別盛放的試劑及體積為：

試劑艙一：DNA片段化試劑混合液4.2 μl（10X dsDNA Fragmentase Reaction Bμffer 2 μl、100X BSA (100 mg/ml) 0.2 μl、dsDNA Fragmentase 2 μl）；

試劑艙二：0.5M 的EDTA 10μl；

試劑艙三： Nuclease-free Water 195μl；

試劑艙四：AMPμre Beads 215μl；

試劑艙五：80%乙醇 1120μl；

試劑艙六：DNA末端修復及加A試劑混合液18 ul（End-Repair & Adenylation Buffer Mix 15 μl、End-Repair & Adenylation Enzyme Mix 3 μl）；

試劑艙七：Adaptor連接反應試劑混合液50 ul（Ligase Enzyme Mix 47.5 μl、Adaptor 2.5 μl）；

試劑艙八：PCR擴增試劑混合液14 ul（NEXTflex? PCR Master Mix 12 μl、NEXTflex? Primer Mix 2 μl）。

文庫制備流程如下：

以1 μg DNA樣本進行文庫制備，用移液器吸取10μl樣本通過進樣孔加入到樣品池中，封閉進樣孔。用手將盒體快速甩兩下，以確保所有試劑都集中于試劑艙底部。（以下所有反應程序都通過控制系統的軟件程序操控外部機械來實現。）

1、DNA片段化反應

外部機械操控盒體內部的小型移液器將樣品池中的3.3μl DNA溶液轉移到試劑艙一中，同時從試劑艙三中轉移Nuclease-free Water 12.5μl到試劑艙一中（使反應總體積為20 μl），與試劑艙一中的DNA片段化試劑混合液發生反應。

反應條件：35-38℃ 溫育30-40分鐘。

然后從試劑艙二中吸取5 μl的0.5 M EDTA加入試劑艙一，終止酶促反應。

2、DNA片段純化

1）通過盒體內部小型移液器上下吸打10-15次將試劑艙四中的AMPure磁珠徹底混勻，然后轉移35 μl的磁珠液放到試劑艙一中；

2）盒體內部小型移液器上下吸打5-10次混勻，室溫靜置5-10分鐘；

3）控制外部機械的磁力架裝置上升至試劑艙一位置，靜置5-10分鐘，使磁珠和上清溶液分離；

4）盒體內部小型移液器吸取試劑艙一中的上清，轉移至廢液槽；

5）將磁力架降低，吸取試劑艙五中的80%乙醇60 μl至試劑艙一中，靜置30-60秒；

6）將磁力架上升至試劑艙一位置，靜置5-10分鐘，使磁珠和上清溶液分離。吸取試劑艙一中的上清，轉移至廢液槽；

7）重復步驟5、6；

8）室溫靜置10-15分鐘，使磁珠在空氣中干燥；

9）將磁力架降低，吸取試劑艙三中的 Nuclease-free Water 30 μl至試劑艙一中，利用盒體內部小型移液器上下吸打5-10次混勻，室溫靜置5-10分鐘；

10）將磁力架上升至試劑艙一位置，使磁珠與洗脫的DNA分離。

3、DNA末端修復反應及加A反應：

1）轉移試劑艙一中的DNA純化溶液20 μl至試劑艙六中，利用盒體內部小型移液器上下吸打5-10次混勻，與試劑艙六中的DNA末端修復反應及加A反應混合液進行反應；

2）反應程序如下：22-25℃ 18-22 min；70-72℃ 20-25 min；4℃保持。

4、末端修復DNA的純化

1）通過盒體內部小型移液器上下吸打10-15次將試劑艙四中的AMPure磁珠徹底混勻，然后轉移80 μl的磁珠液放到試劑艙六中；

2）盒體內部小型移液器上下吸打5-10次混勻，室溫靜置5-10分鐘；

3）將磁力架上升至試劑艙六位置，靜置5-10分鐘，使磁珠和上清溶液分離；

4）吸取試劑艙六中的上清，轉移至廢液槽；

5）將磁力架降低，吸取試劑艙五中的80%乙醇100 μl至試劑艙六中，靜置30-60秒；

6）將磁力架上升至試劑艙六位置，靜置5-10分鐘，使磁珠和上清溶液分離，吸取試劑艙六中的上清，轉移至廢液槽；

7）重復步驟5、6；

8）室溫靜置10-15分鐘，使磁珠在空氣中干燥；

9）將磁力架降低，吸取試劑艙三中的 Nuclease-free Water 60 μl至試劑艙六中，利用小型移液器上下吸打5-10次，室溫靜置5-10分鐘；

10）將磁力架上升至試劑艙六位置，使磁珠與洗脫的DNA分離。

5、連接adaptor

1）吸取試劑艙六中的DNA純化溶液50 μl 至試劑艙七中，與試劑艙七中的Adaptor連接反應試劑混合液反應；

2）利用盒體內部小型移液器上下吸打10-15次混勻；

3）反應條件：22-25℃溫育15-20分鐘。

6、連接adaptor的DNA片段選擇性回收

1）通過盒體內部小型移液器上下吸打10-15次將試劑艙四中的AMPure磁珠徹底混勻，然后轉移60 μl的磁珠液放到試劑艙七中；

2）利用盒體內部小型移液器上下吸打5-10次，室溫靜置5-10分鐘；

3）將磁力架上升至試劑艙七位置，靜置5-10分鐘，使磁珠和上清溶液分離；

4）吸取試劑艙七中的上清，轉移至廢液槽；

5）將磁力架降低，吸取試劑艙五中的80%乙醇200 μl至試劑艙七中，靜置30-60秒；

6）將磁力架上升至試劑艙七位置，靜置5-10分鐘，使磁珠和上清溶液分離，吸取試劑艙七中的上清，轉移至廢液槽；

7）重復步驟5、6；

8）室溫靜置5-10分鐘，使磁珠在空氣中干燥；

9）將磁力架降低，吸取試劑艙三中的 Nuclease-free Water 30 μl至試劑艙七中，利用盒體內部小型移液器上下吸打5-10次，室溫靜置5-10分鐘；

10）將磁力架上升至試劑艙七位置，使磁珠與洗脫的DNA分離。

7、PCR擴增

吸取試劑艙七中的連接adaptor后的DNA選擇性回收片段20 μl，轉移至試劑艙八中，與試劑艙八中的PCR擴增試劑混合液反應。

反應程序如下：預變性 95-98℃ 2-2.5 min；變性 95-98℃ 30-40 s；退火 60-65℃ 30-40 s；延伸 70-72℃ 60-90 s；4-10個循環；終延伸 70-72℃ 4-5 min。

8、PCR產物純化

1）通過盒體內部小型移液器上下吸打10-15次將試劑艙四中的AMPure磁珠徹底混勻，然后轉移40 μl的磁珠液放到試劑艙八中；

2）利用盒體內部小型移液器上下吸打5-10次，室溫靜置5-10分鐘；

3）將磁力架上升至試劑艙八位置，靜置5-10分鐘，使磁珠和上清溶液分離；

4）吸取試劑艙八中的上清，轉移至廢液槽；

5）將磁力架降低，吸取試劑艙五中的80%乙醇200 μl至試劑艙八中，靜置30-60秒；

6）將磁力架上升至試劑艙八位置，使磁珠和上清溶液分離，靜置5-10分鐘，吸取試劑艙八中的上清，轉移至廢液槽；

7）重復步驟5、6；

8）室溫靜置5-10分鐘，使磁珠在空氣中干燥；

9）將磁力架降低，吸取試劑艙三中的 Nuclease-free Water 35μl至試劑艙八中，利用盒體內部小型移液器上下吸打5-10次，室溫靜置5-10分鐘；

10）將磁力架上升至試劑艙八位置，使磁珠與PCR產物分離。

9、取出PCR產物

將試劑艙八中的PCR純化溶液25μl轉移至文庫收集池，通過文庫轉移孔從外部將PCR純化DNA溶液移出盒體，即可拿到測序平臺上進行簇生成和測序，也可將DNA文庫存放在-20℃保存。

10、文庫質量檢測

制備好的DNA文庫用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA文庫中的片段長度分布范圍，若構建的文庫質量良好，可以直接進行測序。

實施例5

本實施例應用于第二代高通量測序的全自動DNA文庫制備裝置的測序步驟如下：

文庫制備樣本：純化的雙鏈DNA，溶于超純水中。DNA濃度100 ng/μl，DNA純度：OD260/OD280=2.0。

試劑艙二：0.5M 的EDTA 20 μl；

試劑艙三： Nuclease-free Water 220 μl；

試劑艙四：AMPμre Beads 230 μl；

試劑艙五：80%乙醇 1200 μl。

文庫制備流程如下：

以1 μg DNA樣本進行文庫制備，用移液器吸取20 μl樣本通過進樣孔加入到樣品池中，封閉進樣孔。

1、DNA片段化反應

外部機械操控盒體內部的小型移液器將樣品池中的10μl DNA溶液轉移到試劑艙一中，同時從試劑艙三中轉移Nuclease-free Water 5.8μl到試劑艙一中（使反應總體積為20 μl），與試劑艙一中的DNA片段化試劑混合液發生反應。

2、DNA片段純化

9）吸取試劑艙三中的 Nuclease-free Water 35 μl至試劑艙一中。

9、取出PCR產物

將試劑艙八中的PCR純化溶液30 μl轉移至文庫收集池，通過文庫轉移孔從外部將PCR純化DNA溶液移出盒體，即可拿到測序平臺上進行簇生成和測序，也可將DNA文庫存放在-20℃保存。

其他與實施例4相同。