本發(fā)明涉及一種抗除草劑海帶孢子體及其制備方法和應(yīng)用，具體涉及將抗除草劑的Bar基因?qū)牒Т婆渥芋w中，并以此為親本培育雌雄配子體，獲得抗除草劑的孢子體細(xì)胞，再經(jīng)過30天的連續(xù)低溫培養(yǎng)，獲得抗除草劑的海帶幼小種苗。本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

海帶(L.japonica)屬于褐藻門，是多年生的大型藻類，山東省沿海地區(qū)的海帶養(yǎng)殖面積達(dá)20多萬畝，年產(chǎn)鮮海帶200多萬噸，占全國的90％。海帶中含有多種藥用活性成分，清淤化痰、降血脂，其多種成分具有抗癌抗病毒的藥理作用。在人工條件下用充氣懸浮培養(yǎng)的海帶雌配子體細(xì)胞，生長極快，生物量每周可翻一番，一個月的生物量可提高20倍。

抗除草劑的Bar基因(Bialaphos Resistance Gene)來源于吸水鏈霉菌，編碼了一種PAT蛋白，共183個氨基酸。該蛋白能夠使草丁膦氨基乙酰化，從而使草丁膦失去對植物的毒性。該蛋白不含有糖基化的氨基酸位點(diǎn)，沒有過敏源，不會引起人體的過敏性反應(yīng)。因此它的使用是非常安全的。使用Bar基因轉(zhuǎn)化獲得的轉(zhuǎn)基因植物有玉米、棉花、煙草、小麥、馬鈴薯、油菜、白楊樹等植物。美國、巴西和墨西哥種植的轉(zhuǎn)基因大豆基本上都是利用Bar基因表達(dá)的抗除草劑特性，并進(jìn)行大面積種植，我國每年進(jìn)口8000萬噸以上含有Bar基因的轉(zhuǎn)基因大豆。

抗除草劑海帶孢子體細(xì)胞培育的方法是以海帶雌雄配子體細(xì)胞培養(yǎng)形成可用于種苗的幼小孢子體的種苗培育技術(shù)，對于加速海帶新品種培育、配子體細(xì)胞的大規(guī)模生產(chǎn)、以及孢子體人工種苗的培育都應(yīng)用具有重要價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種抗除草劑海帶孢子體及其制備方法和應(yīng)用，本發(fā)明以轉(zhuǎn)化抗除草劑基因Bar獲得的雌配子體細(xì)胞與同型非轉(zhuǎn)化體雄配子體細(xì)胞融合形成雜交孢子體細(xì)胞，將雜交孢子體細(xì)胞連續(xù)低溫培養(yǎng)，獲得抗除草劑的孢子體幼胚，并形成幼小孢子體種苗。

本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容主要為：(1)抗除草劑基因Bar在海帶雌配子體細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)化；(2)抗除草劑海帶雌雄配子體細(xì)胞的共培養(yǎng)及抗除草劑孢子體細(xì)胞的培育；3)抗除草劑海帶幼小種苗的培養(yǎng)。

本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下：

抗除草劑海帶孢子體的制備方法，具體步驟如下：

(1)選取生長中的海帶雌配子體品系13號(來源于中國科學(xué)院海洋研究所藻類生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室)海帶雌配子體細(xì)胞團(tuán)，研磨使之成含有5-7個細(xì)胞的海帶雌配子體細(xì)胞團(tuán)，細(xì)胞密度在5×10⁵-2×10⁶個/mL(用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù))，轉(zhuǎn)化時用60mm的無菌培養(yǎng)皿，將雌配子體細(xì)胞均勻平鋪濾紙片中部，形成直徑2cm左右的圓形轟擊圈；

優(yōu)選的，選取生長中的海帶雌配子體品系13號海帶雌配子體細(xì)胞團(tuán)，研磨使之成含有5-7個細(xì)胞的海帶雌配子體細(xì)胞團(tuán)，細(xì)胞密度在1×10⁶個/mL。

(2)轉(zhuǎn)化載體的來源和質(zhì)粒DNA的提取，用生工生物小量DNA提取試劑盒提取質(zhì)粒pBA002-Bar(在載體pBA002中導(dǎo)入長度為552bp的Bar基因的重組質(zhì)粒)的DNA，用以基因槍轟擊后的共培養(yǎng)和目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)化；

在pBA002載體中的Bar基因大小有552bp，編碼183個氨基酸，Bar基因的核苷酸序列為SEQ ID No.1，氨基酸序列為SEQ ID No.2，經(jīng)過重組后被插入到Nos啟動子之后、E9終止子之前的EcoR I和BglII位點(diǎn)上。

(3)基因槍操作技術(shù)過程：擋網(wǎng)與材料間距3cm時轟擊，轟擊壓力為1100psi；

(4)共培養(yǎng)與基因轉(zhuǎn)化：向轟擊后的品系13號的雌配子體細(xì)胞加入步驟(2)中提取的質(zhì)粒pBA002-Bar的DNA，在11-13℃條件下共培養(yǎng)48小時；然后加入質(zhì)量濃度為40mg/L的草丁膦，連續(xù)培養(yǎng)三周，篩選出轉(zhuǎn)化的雌配子體細(xì)胞，即抗除草劑的雌配子體。經(jīng)過40mg/L草丁膦篩選的雌配子體細(xì)胞呈褐色，非轉(zhuǎn)化細(xì)胞不抗除草劑呈綠色，并漸漸分離成單細(xì)胞而死亡。

優(yōu)選的，向轟擊后的品系13號的雌配子體細(xì)胞加入步驟(2)中提取的質(zhì)粒pBA002-Bar的DNA，在12℃條件下共培養(yǎng)48小時。

(5)抗除草劑海帶孢子體的獲得：將抗除草劑的雌配子體與同型非轉(zhuǎn)化體雄配子體細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)獲得交雜孢子體細(xì)胞，經(jīng)過連續(xù)11-13℃低溫條件培養(yǎng)，精子和配子體的卵細(xì)胞自然融合產(chǎn)生的大量抗除草劑的孢子體幼胚；

優(yōu)選的，將抗除草劑的雌配子體與同型非轉(zhuǎn)化體雄配子體細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)獲得交雜孢子體細(xì)胞，經(jīng)過連續(xù)12℃低溫條件培養(yǎng)。

抗除草劑海帶孢子體共培養(yǎng)和低溫培養(yǎng)的營養(yǎng)液的組成：滅菌海水中添加NaNO₃和KH₂PO₄，滅菌海水中NaNO₃的終濃度為8-12mg/L，滅菌海水中KH₂PO₄的終濃度為0.8-1.1mg/L；抗除草劑的海帶孢子體細(xì)胞經(jīng)過15天的細(xì)胞分裂和生產(chǎn)發(fā)育長成8-10列細(xì)胞的孢子體，經(jīng)過30天后可以形成26-32列幼小種苗，并長有附著器。

優(yōu)選的，滅菌海水中NaNO₃的終濃度為10mg/L，滅菌海水中KH₂PO₄的終濃度為1.0mg/L。

本發(fā)明中，抗除草劑的海帶幼小種苗的培育

(1)將抗除草劑的孢子體幼胚置于培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)；培養(yǎng)液的組成為：滅菌海水中添加NaNO₃和KH₂PO₄，滅菌海水中NaNO₃的終濃度為8-12mg/L，NaNO₃與KH₂PO₄的質(zhì)量比為10:0.8-1.1；培養(yǎng)條件為每兩天更換一次培養(yǎng)液，11-12℃低溫光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為800Lux，培養(yǎng)8-10天，光照培養(yǎng)與暗培養(yǎng)的時間比例為14小時：10小時；

優(yōu)選的，滅菌海水中NaNO₃的終濃度為10mg/L；NaNO₃與KH₂PO₄的質(zhì)量比為10:1。

(2)對抗除草劑的海帶幼小種苗進(jìn)行培養(yǎng)，同時進(jìn)行PCR檢測，實(shí)施10mg/L、20mg/L、40mg/L梯度條件下的除草劑篩選，測試轉(zhuǎn)化的幼小種苗對除草劑草丁膦的耐性，建立完整的海帶抗除草劑孢子體細(xì)胞無性繁殖體系。

本發(fā)明中除特殊說明外，“％”均表示質(zhì)量濃度。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)：

通過本發(fā)明的技術(shù)手段，獲得了具有抗除草劑的海帶孢子體細(xì)胞，進(jìn)一步培養(yǎng)獲得了穩(wěn)定發(fā)育的、具有抗除草劑基因的幼小種苗。本發(fā)明可以保持海帶孢子體細(xì)胞無性繁殖的遺傳穩(wěn)定性。

附圖說明

圖1為抗除草劑、呈褐色的海帶雌配子體細(xì)胞，以及不抗除草劑、呈綠色死亡的海帶雌配子體細(xì)胞圖；

圖2為抗除草劑的海帶孢子體細(xì)胞(左)；以及表達(dá)抗除草劑基因的海帶孢子體幼小種苗及其附著器(右)；

圖3為經(jīng)過PCR驗(yàn)證的海帶孢子體中的Bar基因；

圖4為帶有附著體的孢子體細(xì)胞圖；

圖5為抗除草劑的海帶幼小種苗圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會隨著描述而更為清楚。但實(shí)施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。

本發(fā)明具體實(shí)施例中使用的海水取自山東省煙臺市沿海，而適合海帶生長的海水都適用于本發(fā)明。

實(shí)施例1抗除草劑海帶孢子體細(xì)胞的制備方法，具體步驟如下：

(1)選取生長中的海帶雌配子體品系13號海帶雌配子體細(xì)胞團(tuán)，研磨使之成含有5-7個細(xì)胞的海帶雌配子體細(xì)胞團(tuán)，細(xì)胞密度在1×10⁶個/mL(用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù))，轉(zhuǎn)化時用60mm的無菌培養(yǎng)皿，將雌配子體細(xì)胞均勻平鋪濾紙片中部，形成直徑2cm左右的圓形轟擊圈；

(2)轉(zhuǎn)化載體的來源和質(zhì)粒DNA的提取，用生工生物小量DNA提取試劑盒提取質(zhì)粒pBA002-Bar(在載體pBA002中導(dǎo)入長度為552bp的Bar基因的重組質(zhì)粒)的DNA，用以基因槍轟擊后的共培養(yǎng)和目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)化；

在pBA002載體中的Bar基因大小有552bp，編碼183個氨基酸，Bar基因的核苷酸序列為SEQ ID No.1，氨基酸序列為SEQ ID No.2，經(jīng)過重組后被插入到Nos啟動子之后、E9終止子之前的EcoR I和BglII位點(diǎn)上。

(3)基因槍操作技術(shù)過程：打開PDS-1000\He型基因槍電源，打開氦氣瓶閥門，旋轉(zhuǎn)氦氣調(diào)節(jié)桿，使氣壓高于所選可裂膜壓力200psi左右，即1500psi；擋網(wǎng)與材料間距3cm時轟擊，轟擊壓力為1100psi；

(4)共培養(yǎng)與基因轉(zhuǎn)化：向轟擊后的品系13號的雌配子體細(xì)胞加入步驟(2)中提取的質(zhì)粒pBA002-Bar的DNA，在12℃條件下共培養(yǎng)48個小時；然后加入質(zhì)量濃度為40mg/L的草丁膦，連續(xù)培養(yǎng)三周，篩選出轉(zhuǎn)化的雌配子體細(xì)胞，即抗除草劑的雌配子體。經(jīng)過40mg/L草丁膦篩選的雌配子體細(xì)胞呈褐色，非轉(zhuǎn)化細(xì)胞不抗除草劑呈綠色，并漸漸分離成單細(xì)胞而死亡，如圖1所示。

抗除草劑海帶孢子體細(xì)胞中DNA的提取和Bar基因的PCR驗(yàn)證

①DNA提取：取在40mg/L除草劑條件下的孢子體細(xì)胞放入液氮中研磨，加入200μL DNA提取液(1.0MTris-HCL(pH 6.8)1mL，CTAB200mM 2mL，ddH2O 7.m1，適量巰基乙醇)，65℃溫浴20分鐘，12000rpm離心10min；

取離心管加入兩倍體積的預(yù)冷的異丙醇，1/10體積的NaAC，加入上清液，置于-70℃冰箱中保存20min，充分沉淀。12000rpm，離心10min，棄上清；沉淀加入預(yù)冷的75％的乙醇，重復(fù)洗滌兩次后離心。吹干后，用TE溶解DNA，加1μL RNase，37℃保溫1小時后進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳。

②PCR反應(yīng)體系：40μLddH2O，5μL10×PCR Buffer，1μL10mM dNTP，1μL模板，1μLPfu，上、下游引物各1μL。引物序列為：

Jpri-Bar F001 ATGAGCCCAGAACGACGCCCGGCCGA

Jpri-Bar R552 TCAGATCTCGGTGACGGGCAGGACCG

PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性10min；然后95℃30S；55℃50S；72℃

80S，進(jìn)行34個循環(huán)；最后72℃延伸10min。4℃保存。

③凝膠電泳：0.8％瓊脂糖凝膠電泳點(diǎn)樣，TAC緩沖液，90V，40分鐘，紫外燈下檢測擴(kuò)增片段的大小為552bp，如圖2所示。

(5)抗除草劑海帶孢子體細(xì)胞的獲得：將抗除草劑的雌配子體與同型非轉(zhuǎn)化體雄配子體細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)獲得交雜孢子體細(xì)胞，經(jīng)過連續(xù)12℃低溫條件培養(yǎng)，精子和配子體的卵細(xì)胞自然融合產(chǎn)生的大量抗除草劑的孢子體幼胚；

抗除草劑海帶孢子體共培養(yǎng)和低溫培養(yǎng)的營養(yǎng)液的組成：滅菌海水中添加NaNO₃和KH₂PO₄，滅菌海水中NaNO₃的終濃度為10mg/L，滅菌海水中KH₂PO₄的終濃度為1.0mg/L；抗除草劑的海帶孢子體細(xì)胞經(jīng)過15天的細(xì)胞分裂和生產(chǎn)發(fā)育長成8-10列細(xì)胞的孢子體，經(jīng)過30天后可以形成26-32列幼小種苗，并長有附著器，如圖3所示。

轉(zhuǎn)化的海帶孢子體細(xì)胞經(jīng)過30天的培養(yǎng)后，存活的褐色海帶孢子體不斷的生長，并形成細(xì)胞團(tuán)。不同濃度除草劑對海帶孢子體細(xì)胞的篩選效果可以達(dá)到90.0％以上，即使是60mg/L的除草劑使用仍有77.8％的孢子體細(xì)胞是可以成活的。測試表明，海帶孢子體細(xì)胞培養(yǎng)兩周后在草丁膦10mg/L、20mg/L、40mg/L的濃度下保持褐色，對草丁膦具有一定的耐性，未被草丁膦殺死，但是其中也有個別的孢子體細(xì)胞在40mg/L的濃度下變綠，褪色，是未被轉(zhuǎn)化的、不含有Bar基因的孢子體細(xì)胞，附著器發(fā)育正常。在60mg/L的濃度下，有較多的海帶孢子體細(xì)胞變?yōu)榛蔚摹⒍鄶?shù)未產(chǎn)生附著器。抗除草劑草丁膦Bar基因轉(zhuǎn)化的孢子體細(xì)胞測試結(jié)果如表1所示：

表1抗除草劑草丁膦Bar基因轉(zhuǎn)化的孢子體細(xì)胞測試

實(shí)施例2抗除草劑的海帶幼小種苗的培育

將抗除草劑的孢子體幼胚置于培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)；培養(yǎng)液的組成為：滅菌海水中添加NaNO₃和KH₂PO₄，滅菌海水中NaNO₃的終濃度為10mg/L，NaNO₃與KH₂PO₄的質(zhì)量比為10:1.；培養(yǎng)條件為每兩天更換一次培養(yǎng)液，11-12℃低溫光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為800Lux，培養(yǎng)8-10天，光照培養(yǎng)與暗培養(yǎng)的時間比例為14小時：10小時。

對篩選出來的抗除草劑的海帶幼小種苗進(jìn)行培養(yǎng)，同時進(jìn)行PCR檢測，實(shí)施10mg/L、20mg/L、40mg/L梯度條件下的除草劑篩選，測試轉(zhuǎn)化的幼小種苗對除草劑草丁膦的耐性，建立完整的海帶抗除草劑孢子體細(xì)胞無性繁殖體系帶有附著體的孢子體細(xì)胞如圖4所示，抗除草劑的海帶幼小種苗如圖5所示。

〈110〉中國農(nóng)業(yè)大學(xué)煙臺研究院、青島農(nóng)業(yè)大學(xué)

〈120〉一種抗除草劑海帶孢子體及其制備方法和應(yīng)用

〈130〉16-1-1217

〈160〉2

〈170〉PatentIn Version 3.5

〈210〉1

〈211〉552 bp

〈212〉DNA

〈213〉Bar基因

〈400〉1

atgagcccag aacgacgccc ggccgacatc cgccgtgcca ccgaggcgga catgccggcg 60

gtctgcacca tcgtcaacca ctacatcgag acaagcacgg tcaacttccg taccgagccg 120

caggaaccgc aggagtggac ggacgacctc gtccgtctgc gggagcgcta tccctggctc 180

gtcgccgagg tggacggcga ggtcgccggc atcgcctacg cgggcccctg gaaggcacgc 240

aacgcctacg actggacggc cgagtcgacc gtgtacgtct ccccccgcca ccagcggacg 300

ggactgggct ccacgctcta cacccacctg ctgaagtccc tggaggcaca gggcttcaag 360

agcgtggtcg ctgtcatcgg gctgcccaac gacccgagcg tgcgcatgca cgaggcgctc 420

ggatatgccc cccgcggcat gctgcgggcg gccggcttca agcacgggaa ctggcatgac 480

gtgggtttct ggcagctgga cttcagcctg ccggtaccgc cccgtccggt cctgcccgtc 540

accgagatct ga 552

〈210〉2

〈211〉183AA

〈212〉氨基酸

〈213〉Bar基因編碼的蛋白

〈400〉2

MET Ser Pro Glu Arg Arg Pro Ala Asp Ile Arg Arg Ala Thr Glu Ala Asp MET Pro Ala 20

Val Cys Thr Ile Val Asn His Tyr Ile Glu Thr Ser Thr Val Asn Phe Arg Thr Glu Pro 40

Gln Glu Pro Gln Glu Trp Thr Asp Asp Leu Val Arg Leu Arg Glu Arg Tyr Pro Trp Leu 60

Val Ala Glu Val Asp Gly Glu Val Ala Gly Ile Ala Tyr Ala Gly Pro Trp Lys Ala Arg 80

Asn Ala Tyr Asp Trp Thr Ala Glu Ser Thr Val Tyr Val Ser Pro Arg His Gln Arg Thr 100

Gly Leu Gly Ser Thr Leu Tyr Thr His Leu Leu Lys Ser Leu Glu Ala Gln Gly Phe Lys 120

Ser Val Val Ala Val Ile Gly Leu Pro Asn Asp Pro Ser Val Arg MET His Glu Ala Leu 140

Gly Tyr Ala Pro Arg Gly MET Leu Arg Ala Ala Gly Phe Lys His Gly Asn Trp His Asp 150

Val Gly Phe Trp Gln Leu Asp Phe Ser Leu Pro Val Pro Pro Arg Pro Val Leu Pro Val 180

Thr Glu Ile * 183