本發明涉及微生物的基因工程技術領域，尤其涉及一種膠狀溶桿菌OH17遺傳操作系統的構建方法。

背景技術：

由病原真菌引起的病害，約占植物病害的70～80％，是提高我國農業產量、質量和效益的主要障礙之一。生產上防治真菌病害一般采用化學防治，然而，化學農藥殘留帶來的食品質量安全問題和生態安全問題已成為社會各界關注的焦點。因而，開發生態安全、環境友好型的生物農藥是解決上述問題的有效途徑之一。

近年來，溶桿菌作為一類潛在的生防細菌受到廣泛關注。溶桿菌（Lysobacterspp）是屬于黃單胞科、溶桿菌屬的一類革蘭氏陰性細菌，1978年由Christensen 和 Cook建屬。溶桿菌在環境中普遍存在，其主要特征是無鞭毛但有滑行能力，能產生大量胞外酶和小分子次生代謝產物，對許多微生物，如真菌、卵菌、酵母、細菌等都有較好的拮抗活性。

膠狀溶桿菌（Lysobacter gummosus）OH17是本實驗室從作物根際土壤中分離鑒定的一株溶桿菌屬的細菌。OH17已保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.8649。OH17對植物病原真菌和卵菌具有廣譜、高效的拮抗活性（專利申請號201410814846.9）。因此，這一菌株及其活性代謝產物的研究對于新型、高效和廣譜生物農藥（農用抗生素）的開發具有重要意義。

細菌的遺傳操作系統即基因敲除和互補技術，是研究基因功能的必要手段，也是代謝產物合成和調控研究等必需的遺傳學方法。然而，由于溶桿菌對許多抗生素具有抗性，且敏感的抗生素種類也不相同，導致溶桿菌的遺傳操作系統不易構建。

技術實現要素：

針對上述存在的問題，在前期明確了OH17抗生素敏感性的基礎上，本發明目的在于提供一種OH17的遺傳操作系統，以期為該菌株的分子操作和基因功能研究提供基本保障。

為了達到上述目的，本發明采用的技術方案如下：一種膠狀溶桿菌OH17遺傳操作系統的構建方法，所述的遺傳操作系統的構建方法包括如下步驟：

A）確定目的基因：根據基因組的序列分析，在膠狀溶桿菌OH17的基因組中定位指定基因的同源序列，確定為目的基因；

B）構建基因敲除重組載體：采用PCR擴增目的基因的上游和下游片段，酶切這些片段，純化回收后連接到自殺性質粒上，得到基因敲除重組載體；

C）構建基因敲除突變株：基因敲除重組載體通過電擊轉化的方式進入到OH17感受態細胞中，進行同源雙交換，采用LA培養基進行篩選，經PCR驗證后獲得基因敲除突變株；

D）構建回補菌株的重組載體：采用PCR擴增目的基因及其自身啟動子的片段，酶切這些片段，純化回收后連接到質粒上，得到回補菌株的重組載體；

E）構建回補菌株：回補菌株的重組載體通過電擊轉化的方式進入到步驟C）得到的基因敲除突變株感受態細胞中，采用LA培養基進行篩選，經PCR驗證后獲得回補菌株。

本發明所述的步驟B）的操作過程中，所用的自殺性質粒為pJQ200SK，所述的自殺性質粒上攜帶慶大霉素的抗性基因Gm。

本發明所述的步驟B）的操作過程中，得到的基因敲除重組載體需要經過驗證，驗證方法如下：將自殺性質粒通過熱激轉化到檢測菌株上，采用LA培養基進行篩選，并進行PCR和雙酶切驗證，得到正確的基因敲除重組載體。

本發明所述的步驟D）的操作過程中，所用的質粒為pSEVA321CM。

本發明所述的步驟D）的操作過程中，得到的回補菌株的重組載體需要經過驗證，驗證方法如下：將質粒通過熱激轉化到檢測菌株上，采用LA培養基進行篩選，并進行PCR和雙酶切驗證，得到正確的回補菌株的重組載體。

本發明所述步驟B）和步驟D）中采用檢測菌株為大腸桿菌DH5α。

本發明的優點在于：本發明構建了OH17的遺傳操作系統，實現了OH17的基因敲除以及互補，為該菌株的分子操作和基因功能研究提供基本保障。

附圖說明

圖1重組載體pJQ-pilR的PCR驗證；

圖2重組載體pJQ-pilR的雙酶切驗證；

圖3一次交換子慶大抗性片段的PCR驗證；

圖4 pilR敲除突變體的PCR驗證；

圖5 重組載體pJQ-Lg2296的雙酶切驗證（1, 2, 3）；

圖6 Lg2296突變體的PCR驗證；

圖7 重組載體pSEVA321-pilR的PCR驗證；

圖8 重組載體pSEVA321-pilR的雙酶切驗證；

圖9 pilR突變體及回補菌株的菌落形態；

圖10 pilR突變體及回補菌株的HSAF產量；

圖11 重組載體pLAFR6TET-pilR的PCR驗證；

圖12 重組載體pBBR-pilR及pURF047-pilR回補菌株的HSAF產量

圖13 OH17對不同抗生素的敏感性。

具體實施方式

下面結合附圖說明和具體實施方式對本發明作進一步詳細的描述。

本發明的實施例中應用的培養基為以下幾種培養基：

1）10% TSB培養基：胰蛋白胨大豆肉湯培養基（Tryptic-Soytone-Broth-Medium）3 g，

蒸餾水1 L。

2）LB固體培養基：Tryptone 10 g，NaCl 10 g，Yeast Extract 5 g。

將以上組份加入水溶解，最后定容至1 L，調節pH =7.0-7.2，分裝后，LA固體培養基另加瓊脂粉15 g/L。

實施例1：本發明所述的一種膠狀溶桿菌OH17遺傳操作系統的構建方法如下：

一）基因敲除重組載體的構建；

1）在目的基因上下游各設計一對引物，以OH17基因組DNA為模板，進行PCR擴增。

2）將回收的上下游片段分別利用內切酶進行酶切，連接到用BamHI/XbaI酶切的質粒pJQ200SK上，熱激轉化到大腸桿菌DH5α中。

3）利用LA培養基（Gm 25 μg/mL，X-gal 100 μg/mL）進行篩選，并進行PCR和雙酶切驗證，得到正確的重組載體。

二）基因敲除突變株的構建；

1）將重組載體電擊轉入OH17感受態細胞，電壓為1.8 kv。

2）將細胞涂布于含25 μg/mL慶大霉素的LA培養基。

3）挑取單菌落進行PCR篩選一次交換子。

4）挑取單菌落在無抗生素LB培養基中培養6-8 h，進行二次交換。

5）取上述培養液100 μL涂布于含10%蔗糖的LB平板上，10%的蔗糖使未發生二次交換的一次交換子致死，長出的單菌落即為二次交換子。

6）通過PCR篩選驗證基因敲除突變株。

三）回補菌株重組載體的構建；

1）根據已知目的基因序列設計引物，以OH17基因組DNA為模板，進行PCR反應，擴增產物包括目的基因及其自身啟動子。

2）擴增片段酶切后與相應酶切位點的質粒pSEVA321Cm連接。

3）連接產物熱擊轉化入大腸桿菌DH5α。

4）LA培養基（Cm 34 μg/mL，X-gal 100 μg/mL）進行篩選，并進行PCR和雙酶切驗證，得到正確的重組載體。

四）回補菌株的構建；

1）將回補菌株重組載體，通過電擊轉化的方式導入相應基因敲除突變株感受態細胞中。

2）長出后的菌落，通過表型是否恢復進行篩選，最終得到回補成功菌株。

實施例2：本實施例說明膠狀溶桿菌OH17中pilR基因的敲除。

一）OH17中pilR基因序列的獲得及引物的設計；

以產酶溶桿菌OH11的pilR基因為參考序列，利用BioEdit軟件通過同源比對，在OH17的基因組中定位同源序列。比對到相應序列后，利用NCBI和SMART網站進行序列分析。利用Primer Premier軟件對引物進行設計，引物序列如下：

pilR-F1: CGGGATCCGTCCGTTCTTCACCACCTCCAG

pilR-R1: GGAATTCGTCGGTCAGGCACAAGTCGTAA

pilR-F2: GGAATTCGAAAACCGCTACAACAAGAC

pilR-R2:GCTCTAGAGAGTGGTGATTGAGTTGCTT

二）基因敲除重組載體的構建；

1）PCR擴增pilR基因上下游片段，將回收上下游片段分別用BamHI/EcoRI，EcoRI/XbaI進行酶切，酶切片段純化回收后連接到用BamHI/XbaI酶切的質粒pJQ200SK上，連接產物熱激轉化至大腸桿菌DH5α。

2）利用LA培養基（Gm 25 μg/mL，X-gal 100 μg/mL）進行篩選，并進行PCR和雙酶切驗證，得到正確的重組載體（圖1，圖2）。

三）膠狀溶桿菌OH17電轉感受態的制備；

1）LA培養基上挑取單菌落，在10% TSB液體培養基中培養，28℃，200 rpm，過夜培養。

2）接種量按1:100進行轉接到10% TSB中，28℃培養6-10 h（OD_{600 nm}≈1.0）。

3）將菌液倒入50 mL離心管中，冰浴30 min。

4）4℃，6000 rpm，離心15 min。

5）棄去上清，預冷的10%甘油懸浮菌體，冰上靜置20 min。

6）4℃，6000 rpm，離心15 min。

7）棄上清，用預冷的10%甘油懸浮菌體（重復2次）。

8）最后將離心的菌體沉淀用2 mL 10%的甘油重懸，100 μL每管分裝，置于-70℃冰箱中保存備用。

四）重組載體電轉化到膠狀溶桿菌OH17感受態細胞；

1）將重組載體pJQ-pilR（200 ng~2 μg）加入100 μL OH17感受態細胞輕輕混勻，轉至1 mm電轉化杯（Bio-Rad）中，電擊參數設為：電壓1.8 kv（電轉化儀為Bio-Rad）。

2）經電轉化后，立即在無菌條件下向電轉化杯中加入800 μL的10% TSB培養液，然后將菌液轉移至2 mL離心管中，放入28℃搖床中180 rpm，3 h。

3）離心濃縮后均勻涂布在LA培養基（Gm 25 μg/mL）上，待平板干燥后，在28℃溫箱中培養2~3 d。

4）利用PCR擴增慶大抗性片段，篩選獲得一次交換子（圖3）。

5）挑取單菌落在無抗生素LB培養基中培養6-8 h后，涂布于含10%蔗糖的LB平板上。

6）10%的蔗糖使未發生二次交換的一次交換子致死，長出的單菌落即為二次交換子，通過PCR篩選驗證基因敲除突變株，驗證引物為pilR-F1/pilR-R2（圖4）。

實施例3 ：本實施例說明膠狀溶桿菌OH17中Lg2296基因的敲除。

一）引物設計；

根據基因組序列分析及比對，OH17中編號為Lg2296的基因與產酶溶桿菌OH11中抗真菌物質HSAF的合成基因PKS/NRPS同源，因此選擇該基因進行敲除，設計目的基因上下游片段引物如下：

Lg2296-F1: CGGGATCCAGGTGTCGCTGGCATTGATC

Lg2296-R1: CCCAAGCTTGAGGCTTTGCTGCTGGAATC

Lg2296-F2: CCCAAGCTTAGGGTGTGGGCGACGAACTG

Lg2296-R2: GCTCTAGATCCGACAGCCAGCCGTTGAG

二）重組載體的構建；

1）PCR擴增Lg2296基因上下游片段，將回收上下游片段分別用BamHI/HindIII，HindIII/XbaI進行酶切，酶切片段純化回收后連接到用BamHI/XbaI酶切的質粒pJQ200SK上，連接產物熱激轉化至大腸桿菌DH5α。

2）利用LA培養基（Gm 25 μg/mL，X-gal 100 μg/mL）進行篩選，并進行雙酶切驗證，得到正確的重組載體（圖5）。

三）重組載體電轉化到膠狀溶桿菌OH17感受態細胞；

1）將重組載體pJQ-Lg2296（200 ng~2 μg）加入100 μL OH17感受態細胞輕輕混勻，轉至1 mm電轉化杯（Bio-Rad）中，電擊參數設為：電壓1.8 kv（電轉化儀為Bio-Rad）。

2）經電轉化后，立即在無菌條件下向電轉化杯中加入800 μL的10% TSB培養液，然后將菌液轉移至2 mL離心管中，放入28℃搖床中180 rpm，3 h。

3）離心濃縮后均勻涂布在LA培養基（Gm 25 μg/mL）上，待平板干燥后，在28℃溫箱中培養2~3 d。

4）篩選獲得一次交換子，進行PCR驗證一次交換子。

5）挑取單菌落在無抗生素LB培養基中培養6-8 h后，涂布于含10%蔗糖的LB平板上。

6）通過PCR篩選驗證基因敲除突變株，驗證引物為Lg2296-F1/Lg2296-R2（圖6）。

實施例4 ：本實施例說明膠狀溶桿菌OH17中pilR基因敲除突變株的回補菌株構建。

一）pilR基因敲除突變株的回補菌株構建；

1）根據pilR基因序列設計一對引物如下，以OH17基因組DNA為模板，進行PCR反應，擴增產物包括基因及其自身啟動子。

pilR-F: CGGGATCCCTGTTTCCGCATCCGCCTTG

pilR-R: CCCAAGCTTTAAATAAGTCGCCGGGTTCG

2）片段用BamHI/HindIII進行酶切后，嘗試多種自主復制性載體構建互補菌株連接，熱激轉化導入到大腸桿菌DH5α中，最終選擇質粒pSEVA321。

3）LA培養基（Cm 34 μg/mL，X-gal 100 μg/mL）進行篩選，并進行PCR和雙酶切驗證，得到正確的重組載體（圖7，圖8）。

4）將重組載體電轉導入pilR敲除突變體感受態細胞中，長出后的菌落通過菌落形態及HSAF產量恢復情況進行篩選獲得回補菌株。

二）菌落形態的檢測；

挑取LA培養基上的野生型及其衍生菌株單菌落于10% TSB培養基中培養，搖至OD_{600 nm}≈1.0，取2 μL菌液點于LA培養基上，28℃培養24-48h，與野生型進行比較，恢復為野生型菌落形態的菌株則為回補成功（圖9）。

三）HSAF的提取與HPLC檢測；

1）挑取LA培養基上的單菌落于10% TSB液體培養基中，28℃，200 rpm過夜培養；

2）以1%的接種量轉接至5 mL的10% TSB培養基中，28℃，200 rpm培養12 h（OD_{600 nm}≈1.0）；

3）以1%的接種量轉接至25 mL的10% TSB培養基中，28℃，200 rpm發酵24 h；

4）取4 mL上述發酵液于大試管中，在發酵液中加入12 μL濃鹽酸和4 mL的乙酸乙酯抽提1 h；

5）取2 mL上清于新的2 mL的離心管中，通風櫥中制成干樣；

6）在上述2 mL的離心管，加入200 μL甲醇溶解殘留物，用有機過濾器過濾，待下一步實驗使用；

7）HSAF的HPLC檢測。

HPLC檢測采用Agilent SB-C18柱（4.6×250 mm），HPLC為Agilent。具體條件如下：流速：1 mL/min；檢測波長：318 nm；柱溫：20-30℃，進樣量20 μL。采用梯度洗脫的方法進行高效液相色譜檢測，流動相比例如表1。與野生型及突變體菌株相比，HSAF產量有部分恢復的菌株為pilR基因回補成功的菌株（圖10）。

表1 HSAF檢測條件

實施例5：（回補部分重組載體檢測對比試驗）

將重組載體pBBR-pilR、pUFR047-pilR、pLAFR6TET-pilR、pSEVA321- pilR分別電轉化進入pilR突變體中，分別在LA平板（Gm 25 μg/mL，Gm 25 μg/mL，Tet 50 μg/mL，Cm 34 μg/mL）篩選轉化子，利用表型測定篩選互補菌株，只有重組載體pSEVA321- pilR電轉化進入pilR突變體獲得的轉化子能使表型得到回補。而重組載體pLAFR6TET-pilR無法進入pilR突變體中（圖11），空載體pBBR和pUFR047電轉化入pilR突變體后影響其表型回補，故無法使用（圖12）。

實施例6：（抗生素濃度測試試驗）

遺傳操作體系的建立需要適當的篩選標記，檢測了膠狀溶桿菌OH17的抗生素耐受水平，使用實驗室7種常用的抗生素：Str、Km、Tet、Amp、Cm、Gm和Rif，分別配成2-3個濃度梯度的抗性平板，即5 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL。將OH17菌液搖至OD_{600 nm}≈1.0，取100 μL菌液涂布于各個抗性平板，另設一個空白對照。28℃培養，12-24 h后觀察結果。結果發現，OH17對Amp、Gm、Cm和Rif較敏感，對Tet有較小的耐藥性，對Str和Km不敏感（圖13）。