本發明涉及一種利用海帶雌配子體生產重組玉米蛋白的方法，具體涉及通過基因轉化的方法將玉米蛋白的基因z108β在海帶雌配子體內表達，通過蛋白純化和提取，獲得具有應用價值的重組玉米蛋白z108β。

背景技術：

重組玉米蛋白是一種II型核糖體失活蛋白(RIP)，是植物體內一種抑制異源生物體活性的防衛蛋白，其主要功能表現在水解后的蛋白RIP具有兩個肽鏈——α肽和β肽，其中α肽具有N-糖苷酶活性，而β肽具有類凝聚素的Lectin活性。α肽可以專一切割核糖體28R rRNA 4324的腺苷，阻遏延伸因子EF-2與核糖體的結合，從而抑制外源生物有機體的蛋白合成。從玉米胚芽中獲得的z108基因經過重組以后，在大腸桿菌表達的重組蛋白對于黃曲霉(A.flavus)等多種植物病原菌具有抑制孢子萌發的作用，是一種具有抗菌特點的防衛蛋白；而它的β肽鏈能夠獨立地與細胞表面的糖元或半乳糖結合，抑制甜菜夜蛾(S.exigua)等害蟲的取食，表現出一種抑制鱗翅目昆蟲生長的作用。

發明人在過去的研究中已經將玉米的核糖體失活蛋白基因z108轉移到大腸桿菌BL21中，在實驗室條件下提取、純化并獲得重組的抗菌蛋白。2010年獲得了一項發明專利(一種玉米抗菌蛋白的基因及其編碼蛋白的應用ZL200810014139.6)。海帶(L.japonica)屬于褐藻門，是多年生的大型藻類，煙臺市及其周邊沿海的海帶養殖面積達15多萬畝，年產鮮海帶150多萬噸，占全國的80％。海帶中含有多種藥用活性成分，如巖藻聚糖硫酸酯——一種對巨噬細胞、T細胞有直接作用的抗癌藥物。用充氣懸浮培養的海帶雌配子體細胞，生長極快，生物量可每周翻一番，一個月的生物量可提高20倍。重組玉米蛋白z108β基因在海帶雌配子體上表達并實施大規模的細胞培養，是以玉米蛋白抗蟲功能表達作為一種廉價的生物反應器合成生物農藥。

技術實現要素：

本發明將重組玉米蛋白基因z108β在海帶雌配子體內表達，并進行大規模的細胞培養，有助于利用海帶作為海洋生物反應器來生產重組玉米蛋白。

重組玉米蛋白z108β是一個長度為375bp，共有124個氨基酸的小的肽鏈，重組玉米蛋白z108β的核苷酸序列為SEQ ID No.1，氨基酸序列為SEQ ID No.2。重組的玉米蛋白z108β是一個構建在重組質粒pBA002載體中的轉化載體pBA002-z108β，其轉化的作用就是將z108β基因整合到海帶的基因組中，并且讓海帶種苗在海水的生長中表達這樣一個基因，產生這樣一個蛋白。

轉化載體pBA002-z108β的構建：載體質粒pBA002用XbaI/SacI雙酶切，與pUCm-T-1192中的插入序列z108β基因(經過XbaI/SacI雙酶切)連接，其連接產物轉化到大腸桿菌DH5a中，獲得重組質粒載體pBA002-z108β，-70℃保存。

本發明中基因轉化的方法使用的是基因槍轟擊技術，通過金粒擊打海帶配子體細胞的細胞膜，讓重組質粒載體攜帶重組玉米蛋白的基因整合到海帶染色體的基因組中，并獲得遺傳上穩定的表達。該發明是用基因槍以金粒轟擊海帶配子體的方法再加入質粒共培養可以獲得更多的雌配子體轉化細胞，通過基因檢測也能夠大幅度提高海帶雌配子體細胞的轉化率。

本發明的技術方案如下：

一種利用海帶雌配子體生產重組玉米蛋白的方法，具體步驟如下：

(1)海帶雌配子體細胞的轉化

①生長中的海帶雌配子體細胞品系13號的細胞團，研磨使之成含有5-7個細胞的海帶雌配子體細胞團，細胞密度為5×10⁵-2×10⁶個/mL(用血球計數板計數)。轉化時用60mm的無菌培養皿，將雌雌配子體細胞均勻平鋪濾紙片中部，形成直徑2cm左右的圓形轟擊圈。

優選的，生長中的海帶雌配子體細胞品系13號的細胞團，研磨使之成含有5-7個細胞的海帶雌配子體細胞團，細胞密度為1×10⁶個/mL。

②用試劑盒提取質粒pBA002-z108β的DNA，用以轟擊后的共培養和基因轉化。

③對海帶雌配子體細胞團進行轟擊：打開PDS-1000\He型基因槍電源，打開氦氣瓶閥門，旋轉氦氣調節桿，使氣壓高于所選可裂膜壓力200psi左右，即1500psi；擋網與材料間距3cm時轟擊，轟擊壓力為1100psi；

④向轟擊后的海帶配子體細胞團內加入pBA002-z108β質粒DNA，培養溫度是11-13℃，光照為800Lux，共培養48小時；

優選的，向轟擊后的海帶配子體細胞團內加入pBA002-z108β質粒DNA，培養溫度是12℃，光照為800Lux。共培養48小時。

⑤在草丁膦40mg/L的濃度下篩選轉化的雌配子體細胞。

(2)重組玉米蛋白z108β在海帶雌配子體細胞中的表達

轉化后的雌配子體細胞培養28-35d，挑取克隆單獨培養。將海帶配子體均勻涂布在帶有濾紙的培養皿中，在解剖鏡下用毛細管挑取褐色的轉化體，加入培養液大量培養。培養海帶雌配子體細胞的營養液為：滅菌海水中添加濃度為10.0g/L的NaNO₃和濃度為1.0g/L的KH₂PO₄，其中，NaNO₃溶液的添加量為每升海水添加1.0-10.0mL；KH₂PO₄溶液的添加量為每升海水添加0.4-1.0mL。并且每天更換一次營養液，培養溫度是11-13℃，每天為光照培養14小時、暗培養10小時，光照為800Lux；將轉化體置于濃度為40mg/L的草丁膦中，選取仍為褐色的轉化體培養5-10d。

優選的，轉化后的雌配子體細胞培養30d；NaNO₃溶液的添加量為每升海水添加5.0mL，KH₂PO₄溶液的添加量為每升海水添加0.7mL；海帶雌配子體細胞的培養條件為：培養溫度是12℃，每天為光照培養14小時、暗培養10小時，光照為800Lux；將轉化體置于濃度為40mg/L的草丁膦中，選取仍為褐色的轉化體培養8d。

對篩選出來的海帶雌配子體細胞進行大規模培養，連續不停地進行PCR檢測，優化海帶配子體轉基因的方法，提高轉化率和轉化體的成活率，建立完整的海帶雌配子體細胞無性繁殖體系。

海帶雌配子體細胞培養兩周后在草丁膦40mg/L的濃度下保持褐色，未被草丁膦殺死，也有部分海帶配子體變綠，褪色，是未被轉化的、不含有重組玉米蛋白z108β的雌配子體細胞。

(3)重組玉米蛋白z108β的提取和純化

①海帶雌配子體轉化體細胞的破碎和分離

取0.1g樣品放入液氮中研磨，加入1×樣品緩沖液(sample buffer)200μL(1.0M tris-HCL(pH 6.8)1mL，10％SDS 6.0mL，β-巰基乙醇0.2mL，ddH₂O 2.8mL)，混合后煮沸5min，12000rpm離心10min；

②提取上清液并利用SDS-PAGE電泳鑒定

取20μL上清液，用于點樣檢驗；SDS-PAGE電泳采用10％的分離膠(去離子水9.9mL，30％丙烯酰胺8.3mL，Tris-HCL(pH 8.8)6.3mL，10％SDS 0.25mL，10％過硫酸銨(AP)0.25mL，TEMED 0.01mL)和積層膠(無離子水5.5mL，30％丙烯酰胺3.5mL，Tris-HCL(pH 8.8)1.5mL，10％SDS 0.08mL，10％AP 0.08mL，TEMED 0.008mL)。

蛋白樣品上樣，每孔20μL，80V電壓下電泳30分鐘后電壓120V電泳60-80分鐘。

③重組玉米蛋白z108β的蛋白印跡法驗證和純化

海帶雌配子體細胞轉化體的驗證使用Bio-Rad的標準濕式轉膜裝置進行PVDF轉膜，電流90mA，轉膜100min。轉膜完畢后，立即把蛋白膜放置到預先準備好的去離子水中，漂洗1分鐘，以洗去膜上的轉膜液。放入封閉液中，搖床上封閉2小時。清洗后將膜浸于稀釋好的一抗(新西蘭大白兔的Z108抗血清與5％脫脂奶粉的比例為1：1000)中，37℃孵育1-2h；用10mLTBST洗膜3次；再將膜浸于稀釋好的二抗(HRP標記的羊抗兔IgG與5％脫脂奶粉的比例為1：2000)中，37℃孵育1h；用10mLTBST洗膜3次，用10mLTBS洗一次；增強型HRP-DAB底物顯色試劑盒顯色拍照。

優選的，清洗后將膜浸于稀釋好的一抗中，37℃孵育1.5h。

獲得的重組玉米蛋白用8kD的再生棉絨纖維素透析膜(貨號F128056-0001，上海生工)透析除鹽，并12000rpm離心20分鐘沉淀。

④重組蛋白的濃縮和保藏

將離心純化的蛋白集中收集，離心純化后的重組玉米蛋白z108β在-20℃條件下保存。

經電泳蛋白標準測試，重組玉米蛋白z108β的含量達到0.2μg/μL；純度達到99.9％。

本發明中除特殊說明外，“％”均表示質量濃度。

本發明與現有技術相比具有以下優點：

1、本發明首次通過海帶配子體細胞的大量培養獲得純度達到99.9％的重組玉米蛋白，這一發明使得人工條件下實現目標基因編碼蛋白的表達量能夠滿足實際應用的要求；

2、重組玉米蛋白z108β是一種具有抑制鱗翅目昆蟲發育的作用，該基因在海帶配子體細胞的表達使得海帶雌配子體細胞成為一種可以生產生物農藥的生物反應器。

3、海帶配子體細胞大量培養的條件必須滿足：

(1)滅菌海水中添加終濃度為10mg/L的NaNO₃和1.0mg/L的KH₂PO₄作為生長的營養物質，并且每天更換一次營養液，培養溫度11-12℃。光照為800Lux。每天為光照培養14小時、暗培養10小時。

(2)持續使用40mg/L草丁膦作為雌配子體細胞大規模培養的篩選壓力，維持重組玉米蛋白表達海帶配子體細胞具有目標蛋白的表達能力。

4、在水生植物中表達陸生植物的重組蛋白，而且大規模培養條件下分裂的雌配子體細胞具有目標基因的遺傳穩定性。

附圖說明

圖1為重組玉米蛋白基因z108β的酶切電泳驗證圖；用XbaI/SacI雙酶切后的片段長度為389bp。

圖2為大規模培養的表達重組玉米蛋白的海帶雌配子體細胞圖；圖A為篩選后顯微鏡下存活的褐色海帶雌配子體細胞；圖B為表達重組玉米蛋白的海帶雌配子體細胞形態；圖C為不表達的海帶雌配子體細胞變綠并漸漸發白凋亡。

圖3為重組玉米蛋白z108βPCR擴增產物的凝膠電泳圖；DNA片段大小為375bp。

圖4為SDS-PAGE電泳顯示海帶配子體細胞中分離的重組玉米蛋白圖；蛋白大小為20.5kDa。

具體實施方式

下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。

本發明具體實施例中使用的海水取自山東省煙臺市沿海，而適合海帶生長的海水都適用于本發明。

實施例1一種利用海帶雌配子體生產重組玉米蛋白的方法，具體步驟如下：

(1)海帶雌配子體細胞的轉化

①生長中的海帶雌配子體細胞品系13號(來源于中國科學院海洋研究所藻類生物學實驗室)的細胞團，研磨使之成含有5-7個細胞的海帶雌配子體細胞團，細胞密度為1×10⁶個/mL左右(用血球計數板計數)。轉化時用60mm的無菌培養皿，將雌雌配子體細胞均勻平鋪濾紙片中部，形成直徑2cm左右的圓形轟擊圈。

②用試劑盒提取質粒pBA002-z108β的DNA，用以轟擊后的共培養和基因轉化。

轉化載體pBA002-z108β的構建：載體質粒pBA002用XbaI/SacI雙酶切，與pUCm-T-1192中的插入序列z108β基因(經過XbaI/SacI雙酶切)連接，其連接產物轉化到大腸桿菌DH5a中，獲得重組質粒載體pBA002-z108β，-70℃保存。用XbaI/SacI雙酶切重組玉米蛋白z108β的酶切電泳驗證圖，如圖1所示。

③對海帶雌配子體細胞團進行轟擊：打開PDS-1000\He型基因槍電源，打開氦氣瓶閥門，旋轉氦氣調節桿，使氣壓高于所選可裂膜壓力200psi左右，即1500psi；擋網與材料間距3cm時轟擊，轟擊壓力為1100psi；

④向轟擊后的海帶配子體細胞團內加入pBA002-z108β質粒DNA，培養溫度是12℃，光照為800Lux。共培養48個小時。

⑤在草丁膦40mg/L的濃度下篩選轉化的雌配子體細胞。

(2)重組玉米蛋白z108β在海帶雌配子體細胞中的表達

轉化后的雌配子體細胞培養30d，挑取克隆單獨培養。將海帶配子體均勻涂布在帶有濾紙的培養皿中，在解剖鏡下用毛細管挑取褐色的轉化體，加入培養液大量培養。培養海帶雌配子體細胞的營養液為：滅菌海水中添加濃度為10.0g/L的NaNO₃和濃度為1.0g/L的KH₂PO₄，其中，NaNO₃溶液的添加量為每升海水添加5.0mL；KH₂PO₄溶液的添加量為每升海水添加0.7mL。并且每天更換營養液一次，培養溫度是12℃。光照為800Lux。每天為光照培養14小時、暗培養10小時。將轉化體置于濃度為40mg/L的草丁膦中，選取仍為褐色的轉化體培養8d。

對篩選出來的海帶雌配子體細胞進行大規模培養，連續不停地進行PCR檢測，優化海帶配子體轉基因的方法，提高轉化率和轉化體的成活率，建立完整的海帶雌配子體細胞無性繁殖體系。轉化方式分別為轟擊后加入質粒與轟擊時加入質粒，二者細胞轉化率的平均值分別達到39.87％和23.89％，如表1所示：

表1基因槍轉化效率的測試

海帶雌配子體細胞培養兩周后在草丁膦40mg/L的濃度下保持褐色，未被草丁膦殺死，也有部分海帶配子體變綠，褪色，是未被轉化的、不含有重組玉米蛋白z108β的雌配子體細胞。

大規模培養的表達重組玉米蛋白的海帶雌配子體細胞圖如圖2所示；圖A為篩選后顯微鏡下存活的褐色海帶雌配子體細胞；圖B為表達重組玉米蛋白的海帶雌配子體細胞形態；圖C為不表達的海帶雌配子體細胞變綠并漸漸發白凋亡。

(3)重組玉米蛋白z108β的提取和純化

①海帶雌配子體細胞轉化體的破碎和分離

取0.1g樣品放入液氮中研磨，加入1×樣品緩沖液(sample buffer)200μL(1.0M tris-HCL(pH 6.8)1mL，10％SDS 6.0mL，β-巰基乙醇0.2mL，ddH₂O 2.8mL)，混合后煮沸5min，12000rpm離心10min；

②提取上清液并利用SDS-PAGE電泳鑒定

取20μL上清液，用于點樣檢驗；SDS-PAGE電泳采用10％的分離膠(去離子水9.9mL，30％丙烯酰胺8.3mL，Tris-HCL(pH 8.8)6.3mL，10％SDS 0.25mL，10％過硫酸銨(AP)0.25mL，TEMED 0.01mL)和積層膠(無離子水5.5mL，30％丙烯酰胺3.5mL，Tris-HCL(pH 8.8)1.5mL，10％SDS 0.08mL，10％AP 0.08mL，TEMED 0.008mL)。

蛋白樣品上樣，每孔20uL，80V電壓下電泳30分鐘后電壓120V電泳60-80分鐘，結果如圖3所示，蛋白大小為20.5KD，與玉米胚乳中產生的一種核糖體失活蛋白z108的β肽鏈大小一致。

③重組玉米蛋白z108β的蛋白印跡法驗證和純化

海帶雌配子體細胞轉化體的驗證使用Bio-Rad的標準濕式轉膜裝置進行PVDF轉膜，電流90mA，轉膜1h40min。轉膜完畢后，立即把蛋白膜放置到預先準備好的去離子水中，漂洗1分鐘，以洗去膜上的轉膜液。放入封閉液中，搖床上封閉2小時。清洗后將膜浸于稀釋好的一抗(新西蘭大白兔的Z108抗血清于5％脫脂奶粉的比例為1：1000)中，37℃孵育1.5h；用10mLTBST洗膜3次；再將膜浸于稀釋好的二抗(HRP標記的羊抗兔IgG與5％脫脂奶粉的比例為1：2000)中，37℃孵育1h；用10mLTBST洗膜3次，用10mLTBS洗一次；增強型HRP-DAB底物顯色試劑盒顯色拍照。

獲得的重組玉米蛋白用8kD的再生棉絨纖維素透析膜(貨號F128056-0001，上海生工)透析除鹽，并12000rpm離心20分鐘沉淀。

④重組蛋白的濃縮和保藏

將離心純化的蛋白集中收集，離心純化后的重組玉米蛋白z108β在-20℃條件下保存。

經電泳蛋白標準測試，重組玉米蛋白z108β的含量達到0.2μg/μL；純度達到99.9％。

試驗例1海帶雌配子體細胞轉化體的提取和PCR驗證

(1)DNA提?。喝≡?0mg/L除草劑條件下的海帶雌配子體轉化體細胞放入液氮中研磨，加入200μLDNA提取液(1.0MTris-HCL(PH 6.8)1mL，CTAB 200mM 2mL，ddH₂O 7.mL，適量巰基乙醇)，65℃溫浴20分鐘，12000rpm離心10min；

取離心管加入兩倍體積的預冷的異丙醇，1/10體積的NaAC，加入離心后的上清液，置于-70℃冰箱中保存20min，充分沉淀。12000rpm，離心10min，棄上清；沉淀加入預冷的75％的乙醇，重復洗滌兩次后離心。吹干后，用TE溶解DNA，加1μL RNase 37℃保溫1小時后進行1％瓊脂糖凝膠電泳。

(2)PCR反應體系：40μLddH₂O，5μL10×PCR Buffer，1μL10mM dNTP，1μL模板，1μLPfu，上、下游引物各1μL。引物序列為：

Jpri-1191(204)F ATGGCCGAGATAACCCTAGAGCCGAGT

Jpri-1191(204)R TCAGGCCTCGTCGTCGTCGTTGTCAGCACT

(3)PCR反應程序：95℃預變性10min；然后95℃、30S；55℃、50S；72℃、80S，進行34個循環；最后72℃延伸10min。4℃保存。0.8％瓊脂糖凝膠電泳點樣，TAC緩沖液，90V，40分鐘，紫外燈下檢測擴增片段的大小為375bp，如圖4所示。

〈110〉中國農業大學煙臺研究院、青島農業大學

〈120〉一種利用海帶雌配子體生產重組玉米蛋白的方法

〈130〉16-1-1166

〈160〉2

〈170〉PatentIn Version 3.5

〈210〉1

〈211〉375 bp

〈212〉DNA

〈213〉重組玉米蛋白基因z108β

〈400〉1

atggccgaga taaccctaga gccgagtgat cttgacccac aggccgacac gaagagcaag 60

ctggtgaagc tggtggtcat ggtgtgcgag gggctgcggt tcaacaccgt gtcccgcacg 120

gtggacgcgg ggttcaacag ccagcacggg gtgaccttga ccgtgacgca ggggaagcag 180

gtgcagaagt gggacaggat ctccaaggcg gccttcgagt gggctgacca ccccaccgct 240

gtgatccccg acatgcagaa gcttggcatc aaggataaga acgaagcagc gaggatcgtt 300

gcgctcgtta agaatcaaac tactgccgct gccgctactg ctgccagtgc tgacaacgac 360

gacgacgagg cctga 375

〈210〉2

〈211〉124AA

〈212〉氨基酸

〈213〉重組玉米蛋白z108β

〈400〉2

MET Ala Glu Ile Thr Leu Glu Pro Ser Asp Leu Asp Pro Gln Ala Asp Thr Lys Ser Lys 20

Leu Val Lys Leu Val Val MET Val Cys Glu Gly Leu Arg Phe Asn Thr Val Ser Arg Thr 40

Val Asp Ala Gly Phe Asn Ser Gln His Gly Val Thr Leu Thr Val Thr Gln Gly Lys Gln 60

Val Gln Lys Trp Asp Arg Ile Ser Lys Ala Ala Phe Glu Trp Ala Asp His Pro Thr Ala 80

Val Ile Pro Asp MET Gln Lys Leu Gly Ile Lys Asp Lys Asn Glu Ala Ala Arg Ile Val 100

Ala Leu Val Lys Asn Gln Thr Thr Ala Ala Ala Ala Thr Ala Ala Ser Ala Asp Asn Asp 120

Asp Asp Glu Ala * 124