本發(fā)明涉及一種微囊藻毒素脅迫抗性提高的乳酸乳球菌，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
食品安全是關(guān)系到人類健康和國(guó)計(jì)民生的重大問題。在眾多威脅食品安全的污染源中，微囊藻毒素(MCs)由于毒性強(qiáng)、在食物鏈中波及范圍廣，日益成為危害人類健康的重要?dú)⑹?。MCs是一類單環(huán)七肽物質(zhì)，其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，自然降解緩慢。由于微生物具有使用成本低、運(yùn)行周期短等特點(diǎn)，在生物防治MCs中具有較大的應(yīng)用潛力和研究?jī)r(jià)值。其中，益生菌對(duì)MCs的干預(yù)作用因其公認(rèn)的安全性(GRAS)成為真正能夠?qū)崿F(xiàn)在清除MCs過程中與水源、食品“零距離”接觸的生物防治劑。
然而，益生菌對(duì)MCs的干預(yù)作用的機(jī)理并不明確。一方面，益生菌自身的性能決定了其對(duì)MCs的干預(yù)能力以及特有的干預(yù)作用機(jī)制，這取決于其基因型，以及由此表現(xiàn)出的對(duì)MCs的代謝轉(zhuǎn)化性能，或是對(duì)MCs進(jìn)行結(jié)合、吸附的結(jié)構(gòu)或形態(tài)特征。另一方面，微生物的內(nèi)在、外在環(huán)境又影響并改變著它對(duì)MCs的干預(yù)過程和干預(yù)效果，如所處胃腸道的不同生理環(huán)境、MCs的脅迫條件等。這些改變可能涉及到益生菌的轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、代謝組的變化及整個(gè)代謝網(wǎng)絡(luò)的調(diào)整，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)MCs的轉(zhuǎn)化。因此，益生菌清除MCs技術(shù)的建立不僅建立在對(duì)益生菌性能及其去毒機(jī)制的解析之上，也建立在對(duì)益生菌干預(yù)過程的理解之上，這樣才能最終實(shí)現(xiàn)益生菌對(duì)MCs的高效干預(yù)與控制。
在利用乳桿菌對(duì)MCs進(jìn)行清除的研究中發(fā)現(xiàn)，由于菌株受到MCs的脅迫作用，導(dǎo)致菌株的活性受到影響，進(jìn)而影響其清除效果。但是MCs對(duì)菌株的脅迫機(jī)理也不明確。發(fā)明人研究了MCs脅迫條件下Lactobacillus casei ATCC334的蛋白質(zhì)組學(xué)，研究發(fā)現(xiàn)，其分子伴侶GroEL蛋白表達(dá)受到MCs脅迫的影響。
已有報(bào)道在L.lactis NZ9000中表達(dá)了GroEL蛋白后，菌株對(duì)MCs的耐受性顯著提高。然而，從已有報(bào)道的情況來(lái)看，耐受性還有待加強(qiáng)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為了克服上述問題，本發(fā)明對(duì)GroEL蛋白進(jìn)行了突變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)表達(dá)突變GroEL的乳酸菌具有更強(qiáng)的MCs耐受性。
本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供了一種分子伴侶蛋白GroEL-V，所述分子伴侶蛋白GroEL-V的氨基酸序列是在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的基礎(chǔ)上，將第249位的氨基酸A突變成為賴氨酸K且同時(shí)將第264位的賴氨酸K突變成為異亮氨酸I。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列由核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的序列編碼。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種提高乳酸乳球菌抵御MCs脅迫的方法，所述方法是在乳酸菌中過表達(dá)本發(fā)明的分子伴侶蛋白GroEL-V。
本發(fā)明的分子伴侶蛋白GroEL-V，其氨基酸序列是在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的基礎(chǔ)上，將第249位的氨基酸A突變成為賴氨酸K且同時(shí)將第264位的賴氨酸K突變成為異亮氨酸I。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述乳酸菌，為乳酸乳球菌或者干酪乳桿菌。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法是以L.lactis NZ9000為宿主，以表達(dá)質(zhì)粒pNZ8148、pNZ8048、pNZ5319中的一種為載體，過表達(dá)分子伴侶蛋白。
本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種微囊藻毒素脅迫抗性提高的乳酸菌，所述乳酸菌過表達(dá)本發(fā)明的分子伴侶蛋白GroEL-V。
本發(fā)明還要求保護(hù)所述乳酸菌在清除微囊藻毒素方面、制備生物防治劑方面的應(yīng)用。
本發(fā)明的有益效果：
本發(fā)明通過在乳酸乳球菌L.lactis NZ9000中過量表達(dá)GroEL-V蛋白，得到了一株MCs脅迫抗性能力顯著提高的重組乳酸乳球菌L.lactis NZ-GroEL-V。生長(zhǎng)性能試驗(yàn)表明，MCs脅迫條件下培養(yǎng)22h后，L.lactis NZ-GroEL-V菌株相比對(duì)照生物量提高了約35.4％；在MCs濃度分別為50μg/mL和100μg/mL的GM17中脅迫12h后的重組菌對(duì)MCs的耐受性分別比對(duì)照菌提高了32.1％和43.5％。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1重組菌株的構(gòu)建
重組菌Lactococcus lactis NZ-GroEL-V包括：
(1)以L.casei ATCC334的基因組為模板，根據(jù)GroEL的序列(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示、核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增獲得目的基因片段得到表達(dá)GroEL的基因片段。
(2)將步驟(1)得到的基因片段連接到PMD18-T載體上，再轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，得到重組菌；從重組菌中提取質(zhì)粒。
(3)根據(jù)要突變的第249位和第264位的前后序列，設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，引物上相應(yīng)的位點(diǎn)核苷酸為突變后的核苷酸。利用HS PCR酶(購(gòu)于TaKaRa公司)采用全質(zhì)粒PCR的方法進(jìn)行PCR，PCR產(chǎn)物線性化處理后轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞。
(4)分別利用針對(duì)第249位和第264位的位點(diǎn)突變?cè)O(shè)計(jì)的引物以質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR，先利用針對(duì)第249位突變?cè)O(shè)計(jì)的引物以質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR，再以針對(duì)第264位點(diǎn)突變?cè)O(shè)計(jì)的引物以PCR得到的產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR，可得到發(fā)生了兩個(gè)位點(diǎn)突變的A249K-K264I的核苷酸片段，得到表達(dá)突變的GroEL-V的片段。
(5)將步驟(1)和步驟(4)得到的片段，分別和載體pNZ8148酶切、連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)，氯霉素平板上篩選陽(yáng)性克隆，經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證和酶切驗(yàn)證，片段大小正確后再進(jìn)行測(cè)序鑒定，最終獲得含有正確序列的重組質(zhì)粒pNZ8148/GroEL、pNZ8148/GroEL-V。
(6)然后從重組大腸桿菌中提取重組質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)化L.lactis NZ9000感受態(tài)細(xì)胞，氯霉素平板上篩選陽(yáng)性克隆，經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證和酶切驗(yàn)證，片段大小正確后，最終獲得含有正確重組質(zhì)粒的菌株L.lactis NZ-GroEL、L.lactis NZ-GroEL-V。
實(shí)施例2重組菌株的誘導(dǎo)表達(dá)
將菌株L.lactis NZ-Vector、L.lactis NZ-GroEL、L.lactis NZ-GroEL-V接種于含有10μg/mL氯霉素的GM17(5mL)培養(yǎng)基中，30℃靜置培養(yǎng)過夜，以4％的接種量轉(zhuǎn)接至50mL含有10μg/mL氯霉素的GM17培養(yǎng)基中，待生長(zhǎng)至OD6000.4時(shí)加入10ng/mL的nisin誘導(dǎo)培養(yǎng)8h，收集誘導(dǎo)后的細(xì)胞，經(jīng)50mM Tris-HCl緩沖液(pH 7.4)離心洗滌兩次后重懸于相同的緩沖液中。將菌懸液置于冰上超聲破碎15min，離心收集上清液，進(jìn)行SDS-PAGE分析。
經(jīng)SDS-PAGE分析，重組菌L.lactis NZ-GroEL-V成功地表達(dá)了GroEL-V蛋白。
實(shí)施例3酸脅迫下的生長(zhǎng)性能比較
本發(fā)明考察了菌株在脅迫條件下的生長(zhǎng)情況。
將菌株L.lactis NZ-Vector、L.lactis NZ-GroEL、L.lactis NZ-GroEL-V接種于含有10μg/mL氯霉素的GM17(5mL)培養(yǎng)基中，30℃靜置培養(yǎng)過夜，以4％的接種量轉(zhuǎn)接至50mL含有10μg/mL氯霉素的GM17培養(yǎng)基中，待生長(zhǎng)至OD6000.4時(shí)加入10ng/mL的nisin，誘導(dǎo)培養(yǎng)至OD 2.0。將誘導(dǎo)后的培養(yǎng)液以4％的接種量轉(zhuǎn)接至新鮮的GM17(含10μg/mL氯霉素，10ng/mL nisin，MCs濃度為1μg/mL)培養(yǎng)基中。分別測(cè)定L.lactis NZ-Vector、L.lactis NZ-GroEL、L.lactis NZ-GroEL-V在脅迫條件下的生長(zhǎng)性能。
培養(yǎng)22h后重組菌生物量明顯高于對(duì)照，L.lactis NZ-GroEL菌株相對(duì)于L.lactis NZ-Vector生物量提高了約15.2％、L.lactis NZ-GroEL-V菌株相比對(duì)照生物量提高了約35.4％，說(shuō)明在L.lactis NZ9000中過表達(dá)了GroEL-V蛋白后，菌株的MCs耐受性顯著提高。
實(shí)施例4MCs脅迫耐受性能比較
本發(fā)明考察了菌株對(duì)MCs的耐受性，分別測(cè)定了重組菌株L.lactis NZ-GroEL、L.lactis NZ-GroEL-V和對(duì)照菌株在MCs濃度分別為50μg/mL和100μg/mL條件下的存活率。
具體操作方式如下：將菌株誘導(dǎo)培養(yǎng)至OD 2.0，離心收集細(xì)胞，經(jīng)0.85％的生理鹽水洗滌兩次后重懸于等體積的MCs濃度分別為50μg/mL和100μg/mL的GM17中，脅迫不同時(shí)間。脅迫后的菌懸液洗滌兩次后重懸于等體積生理鹽水中，取10μL重懸液，稀釋不同梯度點(diǎn)種于GM17平板上測(cè)定存活率。
結(jié)果表明，在MCs濃度分別為50μg/mL和100μg/mL的GM17中脅迫，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞仍然進(jìn)一步生長(zhǎng)，推測(cè)MCs對(duì)L.lactis NZ9000雖有一定的抑制作用，卻并無(wú)致死作用。在MCs濃度為50μg/mL的培養(yǎng)基中，脅迫12h時(shí)，重組菌L.lactis NZ-GroEL、L.lactis NZ-GroEL-V的存活率，與對(duì)照L.lactis NZ-Vector相比，分別提高了20.1％、32.1％；在MCs濃度為100μg/mL的培養(yǎng)基中，脅迫10-12h后，重組菌L.lactis NZ-GroEL、L.lactis NZ-GroEL-V的存活率，與對(duì)照L.lactis NZ-Vector相比，分別提高了20.1％、43.5％。
結(jié)論：經(jīng)MCs脅迫下的生長(zhǎng)性能試驗(yàn)和耐受性實(shí)驗(yàn)分析，在L.lactis NZ9000中表達(dá)了突變的GroEL-V蛋白后，菌株對(duì)MCs的耐受性顯著提高。
雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。
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<400> 1
Met Ala Lys Glu Ile Lys Phe Ser Glu Asp Ala Arg Ala Ala Met Leu
1 5 10 15
Arg Gly Val Asp Gln Leu Ala Asn Thr Val Lys Thr Thr Leu Gly Pro
20 25 30
Lys Gly Arg Asn Val Val Leu Asp Lys Ser Tyr Gly Ser Pro Glu Ile
35 40 45
Thr Asn Asp Gly Val Thr Ile Ala Lys Ser Ile Asp Leu Glu Asp His
50 55 60
Tyr Glu Asn Met Gly Ala Lys Leu Val Ala Glu Val Ala Ser Lys Thr
65 70 75 80
Asn Asp Ile Ala Gly Asp Gly Thr Thr Thr Ala Thr Val Leu Ala Gln
85 90 95
Ser Ile Ile Arg Glu Gly Met Lys Asn Val Thr Ala Gly Ala Asn Pro
100 105 110
Val Gly Ile Arg Thr Gly Ile Glu Lys Ala Thr Lys Ala Ala Val Asp
115 120 125
Glu Leu His Lys Ile Ser His Lys Val Asn Gly Lys Lys Glu Ile Ala
130 135 140
Gln Val Ala Ser Val Ser Ser Ser Asn Thr Glu Val Gly Ser Leu Ile
145 150 155 160
Ala Asp Ala Met Glu Lys Val Gly His Asp Gly Val Ile Thr Ile Glu
165 170 175
Glu Ser Lys Gly Ile Asp Thr Glu Leu Ser Val Val Glu Gly Met Gln
180 185 190
Phe Asp Arg Gly Tyr Leu Ser Gln Tyr Met Val Thr Asp Asn Asp Lys
195 200 205
Met Glu Ala Asp Leu Asp Asp Pro Tyr Ile Leu Ile Thr Asp Lys Lys
210 215 220
Ile Ser Asn Ile Gln Asp Ile Leu Pro Leu Leu Gln Glu Ile Val Gln
225 230 235 240
Gln Gly Lys Ala Leu Leu Ile Ile Ala Asp Asp Val Ala Gly Glu Ala
245 250 255
Leu Pro Thr Leu Val Leu Asn Lys Ile Arg Gly Thr Phe Asn Val Val
260 265 270
Ala Val Lys Ala Pro Gly Phe Gly Asp Arg Arg Lys Ala Gln Leu Glu
275 280 285
Asp Ile Ala Thr Leu Thr Gly Gly Thr Val Ile Ser Ser Asp Leu Gly
290 295 300
Leu Asp Leu Lys Asp Thr Lys Leu Glu Gln Leu Gly Arg Ala Gly Lys
305 310 315 320
Val Thr Val Thr Lys Asp Asn Thr Thr Ile Val Asp Gly Ala Gly Ser
325 330 335
Lys Asp Ala Ile Ala Glu Arg Val Asn Ile Ile Lys Lys Gln Ile Asp
340 345 350
Asp Thr Thr Ser Asp Phe Asp Arg Glu Lys Leu Gln Glu Arg Leu Ala
355 360 365
Lys Leu Ala Gly Gly Val Ala Val Val Lys Val Gly Ala Ala Thr Glu
370 375 380
Thr Glu Leu Lys Glu Arg Lys Tyr Arg Ile Glu Asp Ala Leu Asn Ala
385 390 395 400
Thr Arg Ala Ala Val Glu Glu Gly Tyr Val Ala Gly Gly Gly Thr Ala
405 410 415
Leu Val Asp Val Leu Pro Ala Val Ala Ala Leu Lys Glu Glu Gly Asp
420 425 430
Val Gln Thr Gly Ile Asn Ile Val Leu Arg Ala Leu Glu Glu Pro Val
435 440 445
Arg Gln Ile Ala Glu Asn Ala Gly Lys Glu Gly Ser Val Ile Val Glu
450 455 460
Gln Leu Lys Lys Glu Lys Gln Gly Val Gly Tyr Asn Ala Ala Thr Asp
465 470 475 480
Glu Trp Glu Asp Met Ala Lys Ser Gly Ile Ile Asp Pro Thr Lys Val
485 490 495
Thr Arg Ser Ala Leu Gln Asn Ala Ala Ser Val Ala Ala Leu Met Leu
500 505 510
Thr Thr Glu Ala Val Val Ala Asp Lys Pro Asp Pro Asn Ala Asn Asn
515 520 525
Asn Ala Ala Ala Gly Ala Asn Pro Ala Ala Gly Met Gly Gly Met Met
530 535 540
<210> 2
<211> 1635
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
atggcaaaag aaattaaatt ctctgaagac gcacgtgctg caatgctgcg cggcgttgat 60
cagttggcaa acacagttaa gacaacctta ggaccaaaag gccgcaacgt tgttttggac 120
aagagctatg gctcaccgga aattaccaat gacggtgtca caattgcgaa gtccattgac 180
ttggaagatc actacgaaaa catgggcgcc aagttggttg ccgaagttgc ttccaagaca 240
aatgacattg ctggtgatgg taccacaacc gcaacggttt tggcacaaag tattatccgc 300
gaaggcatga agaacgttac agccggtgct aatcctgttg gcattcgcac agggattgaa 360
aaggcaacta aggctgccgt tgacgaattg cacaagatta gccacaaagt taatggtaag 420
aaagaaatcg cgcaggttgc gtccgtttct tcctcaaata cagaagttgg tagtctgatt 480
gctgacgcca tggaaaaagt tggccacgat ggtgtgatta ccattgaaga aagcaaaggg 540
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tacatggtta ccgataatga taagatggaa gctgaccttg acgatcctta tatcttgatc 660
accgacaaaa agatttccaa tattcaggac attttgccgc tgttacaaga aatcgttcaa 720
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