本發(fā)明涉及生物化工領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及利用順酐制備L-天冬氨酸和L-丙氨酸的方法。
背景技術(shù)：
L-丙氨酸為白色結(jié)晶或結(jié)晶性粉末，無(wú)異臭，帶有甜味。化學(xué)性能穩(wěn)定，易溶于水(16.5％，25℃)，不溶于乙醚或丙酮。分解溫度為297℃，等電點(diǎn)5.79，pKa-COOH＝2.34，pKa-NH3＝9.60，[α]25D+14.6(C＝0.5～2.0g/ml，5mol/L HCl)。5％L-丙氨酸水溶液的pH值為5.5-7.0。化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：
L-丙氨酸的分子式為C3H7O2N，分子量89.09，包括α-丙氨酸和β-丙氨酸兩種同分異構(gòu)體。
L-丙氨酸是人體非必需氨基酸，在生物體內(nèi)甘氨酸的氨基轉(zhuǎn)移至丙酮酸而成。在葡萄糖-丙氨酸循環(huán)中，保持低血氨水平。丙氨酸是血液中氮的優(yōu)良運(yùn)輸工具。另外，L-丙氨酸是一種有效生糖氨基酸。丙氨酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位，是組成人體蛋白質(zhì)的20種氨基酸之一。目前，它主要用于生化研究、組織培養(yǎng)、肝功能測(cè)定，作為增味劑，可增加調(diào)味品的調(diào)味效果，還可用作酸味矯正劑，改善有機(jī)酸的酸味。
L-丙氨酸自1993年開(kāi)始在國(guó)內(nèi)小批量生產(chǎn)，1993-2013年采用的技術(shù)主要是酶催化技術(shù)，以L-天門冬氨酸為原料，利用L-天門冬氨酸-β-脫羧酶進(jìn)行催化，脫去L-天門冬氨酸β位上的羧基生成L-丙氨酸。期間，由安徽省應(yīng)用技術(shù)研究所從日本引進(jìn)該技術(shù)，并進(jìn)行技術(shù)改進(jìn)。
從2013年開(kāi)始，采用發(fā)酵法生產(chǎn)L-丙氨酸，主要原料為葡萄糖，旨在替代價(jià)格較高的L-天門冬氨酸原料，降低L-丙氨酸的生產(chǎn)成本。
目前，國(guó)內(nèi)L-丙氨酸實(shí)際生產(chǎn)的企業(yè)有三家，安徽華恒生物科技股份有限公司(產(chǎn)能20000t/a)、煙臺(tái)恒源生物工程股份有限公司(產(chǎn)能2600t/a)和淮北新旗氨基酸有限公司(產(chǎn)能4000t/a)。德國(guó)BASF公司年需求量在4000噸以上，主要用于合成日化產(chǎn)品，該公司2014年1-5月份總計(jì)進(jìn)口L-丙氨酸超過(guò)2000噸。美國(guó)年需求量約為2000噸，主要作為食品添加劑。其它國(guó)家和地區(qū)年需求量約為2000噸，主要用于醫(yī)藥原料和食品添加劑。國(guó)外正在開(kāi)發(fā)環(huán)保新材料聚合乳酸，該產(chǎn)品需要L-丙氨酸作為助劑，一旦市場(chǎng)推廣應(yīng)用，將會(huì)極大拓展L-丙氨酸的應(yīng)用市場(chǎng)空間。
L-天冬氨酸又稱L-天門冬氨酸，是一種酸性氨基酸，其化學(xué)名為L(zhǎng)(+)-氨基丁二酸，分子式為C4H7NO4，分子量133.1，化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：
L-天冬氨酸生產(chǎn)應(yīng)用十分廣泛，因其具有酸味，可作為酸味調(diào)節(jié)劑，其具有兩個(gè)羧基，容易生產(chǎn)穩(wěn)定的天冬氨酸鹽，適用于各種食品的營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化和風(fēng)味調(diào)節(jié)，如天冬氨酸鈉是一種鮮味劑，也可以與呈味核苷酸等聯(lián)用，具有解除人體疲勞的作用。L-天冬氨酸作為主要原料可以合成甜味劑阿斯巴甜，阿斯巴甜作為代替蔗糖的首選甜味劑，歐美國(guó)家需求強(qiáng)勁。天冬氨酸能調(diào)節(jié)腦和神經(jīng)的代謝功能，其左旋體L-天冬氨酸廣泛用做氨解毒劑，肝機(jī)能促進(jìn)劑，疲勞恢復(fù)劑等醫(yī)藥用品和各種清涼飲料的添加劑；其外消旋體DL-天冬氨酸(DL-Asp)可用于合成DL-天冬氨酸鉀鎂鹽(脈安定)，可用于治療心律失常、心動(dòng)過(guò)速、心力衰竭、心肌梗塞、心絞痛、肝炎和肝硬化等疾病。DL-天冬氨酸還可作為合成多肽的原料，其氨基酸的取代衍生物(NMDLA)可以作為治療神經(jīng)類疾病和大腦疾病的藥物，如天冬氨酸的衍生物N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)能明顯增強(qiáng)視神經(jīng)單元放電單元的興奮作用，可作為哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的興奮神經(jīng)遞質(zhì)受體之一。
L-天冬氨酸的工業(yè)生產(chǎn)始于上世紀(jì)七十年代的日本，早期采用傳統(tǒng)的微生物發(fā)酵法，即以糖類物質(zhì)為基礎(chǔ)原料，通過(guò)細(xì)胞的新陳代謝來(lái)積累，再經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)奶崛【乒に嚩瞥伞Ｓ捎谠摴に嚿a(chǎn)周期長(zhǎng)，副產(chǎn)物多且技術(shù)風(fēng)險(xiǎn)大，導(dǎo)致生產(chǎn)成本高。隨著生物酶技術(shù)的發(fā)展，特別是固定化酶技術(shù)研究的不斷深入，到了八十年代，由于采用酶法生產(chǎn)所需的主要原料富馬酸能得以大量廉價(jià)生產(chǎn)，據(jù)此開(kāi)發(fā)出以固定化酶法進(jìn)行生產(chǎn)的技術(shù)，并且逐步取代了傳統(tǒng)的發(fā)酵工藝，成為當(dāng)時(shí)主要的生產(chǎn)方法。該工藝設(shè)備投入多，技術(shù)要求高，使產(chǎn)品的生產(chǎn)成本相對(duì)較高。近年來(lái)隨著市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)的日趨激烈，如何有效降低生產(chǎn)成本，提高產(chǎn)品質(zhì)量成為關(guān)鍵；而固定化酶法由于自身工藝上的限制，決定了其無(wú)法進(jìn)一步降低成本。
由于L－天冬氨酸主要用于食品添加劑、合成阿斯巴甜、丙氨酸、聚天冬氨酸方面，而這些產(chǎn)品的市場(chǎng)需求逐年加大，尤其是阿斯巴甜，目前全球有一百多個(gè)國(guó)家在使用，產(chǎn)量已增至1.8萬(wàn)t/a。隨著肥胖和糖尿病的高發(fā)，對(duì)低熱量食品的需求不斷加大，阿斯巴甜作為代替蔗糖的首選甜味劑，歐美國(guó)家需求強(qiáng)勁。L-天冬氨酸在我國(guó)的生產(chǎn)歷史不長(zhǎng)，規(guī)模化生產(chǎn)始于上世紀(jì)九十年代中后期，經(jīng)過(guò)十多年的發(fā)展，已形成一定的產(chǎn)業(yè)規(guī)模，合計(jì)年生產(chǎn)能力約在8～10萬(wàn)噸左右，但生產(chǎn)規(guī)模在5000噸以上的僅有為數(shù)不多的幾個(gè)廠家。近幾年由于L-天冬氨酸的應(yīng)用領(lǐng)域不斷擴(kuò)大，需求大幅度增長(zhǎng)，尤其在合成阿斯巴甜和聚天冬氨酸方面，國(guó)際國(guó)內(nèi)需求量的增加導(dǎo)致產(chǎn)量也在逐年增加，有較大的潛在市場(chǎng)需求。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供利用順酐制備L-天冬氨酸和L-丙氨酸的方法。
目前生產(chǎn)L-天冬氨酸的工藝多以富馬酸為原料經(jīng)過(guò)酶轉(zhuǎn)化獲得L-天冬氨酸，其中富馬酸由馬來(lái)酸經(jīng)過(guò)異構(gòu)化獲得，但異構(gòu)化過(guò)程副產(chǎn)物蘋(píng)果酸的含量較高，需進(jìn)行多步分離純化得到富馬酸，利用此種工藝生產(chǎn)L-天冬氨酸較為繁瑣。本發(fā)明旨在提供一種從順酐一步酶轉(zhuǎn)化法獲得L-天冬氨酸，中間不經(jīng)過(guò)富馬酸過(guò)程，工藝簡(jiǎn)便，轉(zhuǎn)化率高，產(chǎn)品質(zhì)量好，同時(shí)采用膜分離技術(shù)對(duì)L-天冬氨酸結(jié)晶母液進(jìn)行凈化，去除雜質(zhì)和無(wú)機(jī)鹽，母液可重復(fù)循環(huán)套用，廢水排放量低，L-天冬氨酸收率高。
為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的利用順酐制備L-天冬氨酸和L-丙氨酸的方法，包括以下步驟：
S1、以順酐為原料，加熱進(jìn)行水合反應(yīng)得到馬來(lái)酸溶液；
S2、向馬來(lái)酸溶液中加入馬來(lái)酸異構(gòu)酶和L-天冬氨酸酶，在一定pH值下進(jìn)行酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)，所得酶轉(zhuǎn)化液依次經(jīng)過(guò)微孔過(guò)濾、納濾膜過(guò)濾；
S3、濾液經(jīng)濃縮脫氨后，以馬來(lái)酸溶液作為酸化劑調(diào)pH值至L-天冬氨酸等電點(diǎn)2.8，采用連續(xù)等電結(jié)晶的方式結(jié)晶析出L-天冬氨酸，晶漿液經(jīng)離心、洗滌、干燥后制得L-天冬氨酸晶體。
S4、為了進(jìn)一步制備L-丙氨酸，向細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)生的pH8.8-9.0的L-天冬氨酸脫羧酶發(fā)酵液中加入上述制得的L-天冬氨酸晶體，采用少量多次連續(xù)性投料方式，于48-50℃反應(yīng)60-72h，控制反應(yīng)體系pH值不低于6.5；反應(yīng)結(jié)束后，離心收集沉淀(濕晶體)，用水洗滌，烘干即得L-丙氨酸成品，產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。
S1具體為：稱取一定量順酐加水于20-80℃(優(yōu)選60℃)溶解，得到15-80％(優(yōu)選60％)的馬來(lái)酸溶液。
S2具體步驟如下：
S21、將馬來(lái)酸溶液加入酶反應(yīng)釜中，調(diào)節(jié)反應(yīng)釜溫度為30-50℃，用氨水調(diào)pH值至7.0-9.0，作為反應(yīng)底物。
S22、按反應(yīng)底物體積的2％-30％分別加入馬來(lái)酸異構(gòu)酶酶液和L-天冬氨酸酶酶液，于30-50℃反應(yīng)8-18h，然后加熱至80-105℃保持30-60min(優(yōu)選80℃保持30min)，對(duì)酶進(jìn)行滅活，得到酶轉(zhuǎn)化液。其中，所述馬來(lái)酸異構(gòu)酶酶液和L-天冬氨酸酶酶液的酶活力分別為120-150U/mL。
S23、酶轉(zhuǎn)化液依次經(jīng)過(guò)陶瓷膜微孔過(guò)濾及納濾膜過(guò)濾。
其中，S23中使用0.05-0.2μm孔徑的陶瓷膜過(guò)濾，進(jìn)膜壓力0.2-0.3MPa，出膜壓力0.15-0.2Mpa，運(yùn)行溫度50-70℃，收集微濾液，然后采用截留分子量0.5-3KD的納濾膜過(guò)濾，以去除大分子蛋白、色素及無(wú)機(jī)鹽等雜質(zhì)，膜運(yùn)行壓力15-20MPa，運(yùn)行溫度40-45℃，收集濾液。
S3具體步驟如下：
S31、濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在60-70℃下進(jìn)行真空濃縮脫氨，真空度為-0.08～-0.09Mpa，濃縮至固含量25-30％(優(yōu)選25％)；
S32、所得濃縮液分成兩份，將其中一份濃縮液加入結(jié)晶釜中，于50-70℃(優(yōu)選60℃)條件下，流加濃度15-80％的馬來(lái)酸溶液至pH2.8；然后流加另一份濃縮液，同時(shí)流加濃度15-80％的馬來(lái)酸溶液，使結(jié)晶釜中體系pH值始終維持在2.8，直至濃縮液流加完畢；
S33、待體系溫度降至15-35℃，所得晶漿液用離心機(jī)進(jìn)行離心，沉淀加水洗滌，收集濕晶體，干燥后即得L-天冬氨酸晶體。
其中，S33中水的用量為晶漿液體積的7％-10％。
S33中所得濕晶體用流化床于50-60℃烘干。制得的L-天冬氨酸晶體為白色針狀，產(chǎn)品質(zhì)量達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。
前述的方法，S4中向細(xì)菌(例如芽孢桿菌)發(fā)酵產(chǎn)生的pH8.8-9.0的L-天冬氨酸脫羧酶發(fā)酵液中加入上述制得的L-天冬氨酸晶體，料液比為(1±0.5)g：100mL。優(yōu)選地，按照20g-30g/次/5min的投料速度投入L-天冬氨酸脫羧酶液中。
前述方法還包括對(duì)S3中晶漿液離心后所得母液以及水洗后所得洗液進(jìn)行合并、濃縮，重新作為反應(yīng)底物進(jìn)行循環(huán)利用的步驟。具體方法如下：將所得母液與洗液合并，然后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在60-70℃下進(jìn)行真空濃縮，真空度為-0.08～-0.09Mpa，濃縮至馬來(lái)酸含量15-80％，再用氨水調(diào)pH值至7.0-9.0，作為反應(yīng)底物循環(huán)套用。
本發(fā)明所用馬來(lái)酸異構(gòu)酶、L-天冬氨酸酶購(gòu)自安徽豐原發(fā)酵技術(shù)工程研究有限公司。L-天冬氨酸脫羧酶由淮北新旗氨基酸股份有限公司生產(chǎn)。
本發(fā)明采用雙酶法一步反應(yīng)制備L-天冬氨酸，工藝簡(jiǎn)便，轉(zhuǎn)化率達(dá)98％以上，可有效控制副產(chǎn)物蘋(píng)果酸的產(chǎn)生，產(chǎn)品質(zhì)量好；采用膜分離技術(shù)對(duì)L-天冬氨酸酶轉(zhuǎn)化液進(jìn)行凈化，除雜，同時(shí)利用馬來(lái)酸作為酸化劑等點(diǎn)結(jié)晶制備L-天冬氨酸，結(jié)晶母液可用作酶反應(yīng)底物反復(fù)套用，實(shí)現(xiàn)了順酐制備L-天冬氨酸的循環(huán)生產(chǎn)，大大降低廢水排放量，符合綠色環(huán)保理念。此外，利用L-天冬氨酸脫羧酶，進(jìn)一步將L-天冬氨酸轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-丙氨酸，使整套工藝獲得的產(chǎn)品多元化，更具有市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。
具體實(shí)施方式
以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。
本發(fā)明中涉及到的百分號(hào)“％”，若未特別說(shuō)明，是指質(zhì)量百分比；但溶液的百分比，除另有規(guī)定外，是指100mL溶液中含有溶質(zhì)的克數(shù)。
實(shí)施例1-3中涉及到馬來(lái)酸異構(gòu)酶酶液和L-天冬氨酸酶酶液，其酶活力分別為120-150U/mL。
實(shí)施例1 L-天冬氨酸的制備
1)將順酐加純水于60℃水浴攪拌溶解，配制成濃度為60％的馬來(lái)酸溶液備用。
2)將步驟1)所得馬來(lái)酸溶液加入50L酶反應(yīng)釜，調(diào)節(jié)反應(yīng)溫度40℃，用30％氨水調(diào)節(jié)pH值，控制在7.0-9.0，作為反應(yīng)底物。按反應(yīng)底物的體積計(jì)算，分別加入8％馬來(lái)酸異構(gòu)酶酶液和10％L-天冬氨酸酶酶液進(jìn)行反應(yīng)，于40℃反應(yīng)12h，反應(yīng)終點(diǎn)轉(zhuǎn)化液加熱至80℃并保持30min。
3)將步驟2)所得酶反應(yīng)液使用0.05-0.2μm孔徑的陶瓷膜過(guò)濾，進(jìn)膜壓力0.3MPa，出膜壓力0.15Mpa，運(yùn)行溫度60℃，收集過(guò)濾清液。
4)將步驟3)所得微濾液使用截留分子量0.5-3.0KD的納濾膜過(guò)濾，去除大分子蛋白、色素及無(wú)機(jī)鹽，收集濾液，膜運(yùn)行壓力18MPa,溫度42℃。
5)將步驟4)所得納濾液使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器進(jìn)行真空濃縮脫氨，真空度為-0.08～-0.09Mpa，溫度65℃，濃縮至固含量25％。
6)將步驟5)所得濃縮液1L加入體積為5L的1號(hào)結(jié)晶釜，攪拌加熱維持結(jié)晶釜溫度為60℃，流加60％的馬來(lái)酸溶液至pH2.8時(shí)停止流加，60℃保溫2h后一邊流加濃縮液，一邊流加60％的馬來(lái)酸溶液，控制1號(hào)結(jié)晶釜中pH始終維持在2.8，直至1號(hào)結(jié)晶釜滿后，打開(kāi)溢流閥使1號(hào)結(jié)晶釜中的晶漿液溢流至體積為50L的2號(hào)結(jié)晶釜，打開(kāi)2號(hào)結(jié)晶釜降溫水閥門控制2號(hào)結(jié)晶釜溫度在18℃。
7)將步驟6)所得全部晶漿液用離心機(jī)進(jìn)行離心，沉淀加水洗滌，洗水加量為晶漿液體積的7％-10％，收集濕晶體、離心所得母液和洗水。
8)將晶體用流化床于55℃烘干后得到含量為98.7％的L-天冬氨酸成品。
實(shí)施例2 L-天冬氨酸的制備
1)將順酐加純水于60℃水浴攪拌溶解，配制成濃度為15％的馬來(lái)酸溶液備用。
2)將步驟1)所得馬來(lái)酸溶液加入50L酶反應(yīng)釜，調(diào)節(jié)反應(yīng)溫度40℃，用30％氨水調(diào)節(jié)pH值，控制在7.0-9.0，作為反應(yīng)底物，按反應(yīng)底物的體積計(jì)算，按反應(yīng)底物的體積計(jì)算，分別加入10％馬來(lái)酸異構(gòu)酶酶液和15％L-天冬氨酸酶酶液進(jìn)行反應(yīng)，于40℃反應(yīng)10h，反應(yīng)終點(diǎn)轉(zhuǎn)化液加熱至105℃并保持30min滅活。
3)將步驟2)所得酶反應(yīng)液使用0.05-0.2μm孔徑的陶瓷膜過(guò)濾，進(jìn)膜壓力0.2MPa，出膜壓力0.15Mpa，運(yùn)行溫度50℃，收集過(guò)濾清液。
4)將步驟3)所得微濾液使用截留分子量0.5-3.0KD的納濾膜過(guò)濾，去除大分子蛋白、色素及無(wú)機(jī)鹽，收集濾液，膜運(yùn)行壓力15MPa，溫度40℃。
5)將步驟4)所得納濾液使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器進(jìn)行真空濃縮脫氨，真空度為-0.08～-0.09Mpa，溫度60℃，濃縮至固含量25％。
6)將步驟5)所得濃縮液1L加入體積為5L的1號(hào)結(jié)晶釜，攪拌加熱維持結(jié)晶釜溫度于60℃，流加60％的馬來(lái)酸溶液至pH3.0時(shí)停止流加，60℃保溫2h后一邊流加濃縮液，一邊流加40％的馬來(lái)酸溶液，控制1號(hào)結(jié)晶釜中pH始終維持在3.0，直至1號(hào)結(jié)晶釜滿后，打開(kāi)溢流閥使1號(hào)結(jié)晶釜中的晶漿液溢流至體積為50L的2號(hào)結(jié)晶釜，打開(kāi)2號(hào)結(jié)晶釜降溫水閥門控制2號(hào)結(jié)晶釜溫度在15℃。
7)將步驟6)所得全部晶漿液用離心機(jī)進(jìn)行離心，沉淀加水洗滌，洗水加量為晶漿液體積的7％-10％，收集濕晶體、離心所得母液和洗水。
8)將晶體用流化床于50-60℃烘干后得到含量為98.8％的L-天冬氨酸成品。
實(shí)施例3 L-天冬氨酸的制備
1)將順酐加純水于60℃水浴攪拌溶解，配制成濃度為60％的馬來(lái)酸溶液備用。
2))將步驟1)所得馬來(lái)酸溶液加入50L酶反應(yīng)釜，調(diào)節(jié)反應(yīng)溫度40℃，用30％氨水調(diào)節(jié)pH值，控制在7.0-9.0，作為反應(yīng)底物，按反應(yīng)底物的體積計(jì)算，按反應(yīng)底物的體積計(jì)算，分別加入8％馬來(lái)酸異構(gòu)酶酶液和10％L-天冬氨酸酶酶液進(jìn)行反應(yīng)，于40℃反應(yīng)16h，反應(yīng)終點(diǎn)轉(zhuǎn)化液加熱至90℃并保持60min滅活。
3)將步驟2)所得酶反應(yīng)液使用0.05-0.2μm孔徑的陶瓷膜過(guò)濾，進(jìn)膜壓力0.3MPa，出膜壓力0.2Mpa，運(yùn)行溫度70℃，收集過(guò)濾清液。
4)將步驟3)所得微濾液使用截留分子量0.5-3.0KD的納濾膜過(guò)濾，去除大分子蛋白、色素及無(wú)機(jī)鹽，收集濾液，膜運(yùn)行壓力20MPa，溫度45℃。
5)將步驟4)所得納濾液使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器進(jìn)行真空濃縮脫氨，真空度為-0.08～-0.09Mpa，溫度70℃，濃縮至固含量25％。
6)將步驟5)所得濃縮液1L加入體積為5L的1號(hào)結(jié)晶釜，攪拌加熱維持結(jié)晶釜溫度于60℃，流加60％的馬來(lái)酸溶液至pH2.8時(shí)停止流加，60℃保溫2h后一邊流加濃縮液，一邊流加50％的馬來(lái)酸溶液，控制1號(hào)結(jié)晶釜中pH始終維持在2.8，直至1號(hào)結(jié)晶釜滿后，打開(kāi)溢流閥使1號(hào)結(jié)晶釜中的晶漿液溢流至體積為50L的2號(hào)結(jié)晶釜，打開(kāi)2號(hào)結(jié)晶釜降溫水閥門控制2號(hào)結(jié)晶釜溫度在15℃。
7)將步驟6)所得全部晶漿液用離心機(jī)進(jìn)行離心，沉淀加水洗滌，洗水加量為晶漿液體積的7％-10％，收集濕晶體、離心所得母液和洗水。
8)將晶體用流化床于50-60℃烘干后得到含量為99.0％的L-天冬氨酸成品。
實(shí)施例4 L-丙氨酸的制備
1、按實(shí)施例1步驟1)～7)進(jìn)行操作，將離心所得母液與洗水合并，然后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在60-70℃下進(jìn)行真空濃縮，真空度為-0.08～-0.09Mpa，濃縮至馬來(lái)酸含量為60％，再用氨水調(diào)pH值至7.0-9.0，作為反應(yīng)底物循環(huán)套用。再按反應(yīng)底物體積的12％加入發(fā)酵獲得的馬來(lái)酸異構(gòu)酶和L-天冬氨酸酶酶發(fā)酵液(發(fā)酵液酶活力分別為120-150U/mL)反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間10h，反應(yīng)終點(diǎn)轉(zhuǎn)化液加熱至80℃并保持30min。
2、將步驟1所得酶反應(yīng)液使用0.05-0.2μm孔徑的陶瓷膜過(guò)濾，進(jìn)膜壓力0.3MPa，出膜壓力0.15Mpa，運(yùn)行溫度60℃，收集過(guò)濾清液。
3、將步驟2所得微濾液使用截留分子量0.5-3.0KD的納濾膜過(guò)濾，去除大分子蛋白、色素及無(wú)機(jī)鹽，收集濾液，膜運(yùn)行壓力18MPa,溫度42℃。
4、將步驟3所得納濾液使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器進(jìn)行真空濃縮脫氨，真空度為-0.08～-0.09Mpa，溫度65℃，濃縮至固含量25％。
5、將步驟5)所得濃縮液1L加入體積為5L的1號(hào)結(jié)晶釜，攪拌加熱維持結(jié)晶釜溫度于60℃，流加60％的馬來(lái)酸溶液至pH2.8時(shí)停止流加，60℃保溫2h后一邊流加濃縮液，一邊流加50％的馬來(lái)酸溶液，控制1號(hào)結(jié)晶釜中pH始終維持在2.8，直至1號(hào)結(jié)晶釜滿后，打開(kāi)溢流閥使1號(hào)結(jié)晶釜中的晶漿液溢流至體積為50L的2號(hào)結(jié)晶釜，打開(kāi)2號(hào)結(jié)晶釜降溫水閥門控制2號(hào)結(jié)晶釜溫度在15℃。
6、將步驟5所得全部晶漿液用離心機(jī)進(jìn)行離心，沉淀加水洗滌，洗水加量為晶漿液體積的7％-10％，收集濕晶體、離心所得母液和洗水。
7、將晶體用流化床于55℃烘干后得到含量為98.8％的L-天冬氨酸成品。
8、取芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)的L-天冬氨酸脫羧酶發(fā)酵液5L(pH值8.98)，酶發(fā)酵液采用水浴升溫至48℃，將步驟7獲得的L-天冬氨酸成品按照20g-30g/次/5min的投料速度投入L-天冬氨酸脫羧酶發(fā)酵液中，共加入L-天冬氨酸4000克，控制酶反應(yīng)溫度48℃，反應(yīng)pH值不低于6.5，酶轉(zhuǎn)化周期65h。反應(yīng)結(jié)束后，通過(guò)離心機(jī)分離酶反應(yīng)液，濕晶體用純水洗滌，烘干后包裝得L-丙氨酸成品。反應(yīng)轉(zhuǎn)化率>99.5％，L-丙氨酸收率>95％。
雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。