本發明屬于分子生物學
技術領域：
，具體涉及一種用于鑒定魚類增殖放流個體的引物及鑒別方法。
背景技術：
：增殖放流指用人工方式向海洋、江河、湖泊等公共水域放流水生生物苗種或親體的活動。對于瀕危物種，通過增殖放流不僅可以補充和恢復生物資源的群體，保護瀕危物種、增加漁業資源產量和修復生態環境，還具有培養漁民環保意識和增加漁民收入等多方面的重要意義。在增殖放流過程中，通常通過體外標志法或體內標志方法跟蹤增殖放流的魚類。體外標志法主要包括剪鰭法、烙印法、掛牌法等。該方法操作簡單、易于識別，不需要專門的儀器，但可能會影響魚類行為活動、易脫落，所以準確率不高。體內標志法主要包括線碼標志法、檔案式標志法、被動式整合雷達標志法和分離式衛星標志法等。該方法幾乎不影響魚類的生長，也不會遺失，準確率高于體外標志，但費用比較昂貴。近年來，微衛星分子標記作為一種新型的標志方法，已在國內外開始逐步試用。與傳統標志方法相比，分子標記技術是以個體間遺傳物質為基礎的遺傳標記，不存在脫落或改變的情況，最大程度減少了傳統標志方法對魚體造成的傷害，適用于魚類的放流活動。微衛星，亦稱簡單重復序列(SimpleSequenceRepeat，SSR)，一般為2～6個堿基單元重復，如(CA)n、(CAA)n、(GACA)n。微衛星DNA作為一種分子標記，具有分布廣且均勻、多態信息含量高、共顯性遺傳等特點，已被廣泛應用于群體遺傳研究、生物遺傳作圖、個體鑒定以及親子鑒定等方面。技術實現要素：解決的技術問題：本發明的目的是提供一種用于鑒定魚類增殖放流個體的引物及鑒別方法，采用本發明的鑒別方法可準確的鑒定出漁獲物中哪些是放流的個體，為魚類的增殖放流效果評估提供依據，準確率能達到99.99％，可應用于魚類的增殖放流效果評估研究中。技術方案：一種用于鑒定魚類增殖放流個體的引物，包括有用于擴增的15對微衛星引物，其序列如下：F1SEQIDNO.1～2、F2SEQIDNO.3～4、F3SEQIDNO.5～6、F4SEQIDNO.7～8、F5SEQIDNO.9～10、F6SEQIDNO.11～12、F7SEQIDNO.13～14、F8SEQIDNO.15～16、F9SEQIDNO.17～18、F10SEQIDNO.19～20、F11SEQIDNO.21～22、F12SEQIDNO.23～24、F13SEQIDNO.25～26、F14SEQIDNO.27～28、F15SEQIDNO.29～30。所述的每對引物對中至少有一個引物的5’端進行熒光染料標記。每對引物進行標記時是采用PET、6FAM、NED和VIC中的任意一種進行染色。所述的引物對是經過分組的。具體分組為：F1、F2、F3、F4、F5為第一組；F6、F7、F8、F9、F10為第二組；F11、F12、F13、F14、F15為第三組。根據本發明的另一個方面，還提供了包含有上述引物組的檢測試劑盒。所述的試劑盒由如下組成：DNA模板，2×TaqPCRMix，正向和反向引物，去離子水。根據本發明的另一個方面，還提供了上述試劑盒用于鑒定魚類增殖放流個體的方法，包括以下步驟：步驟1，在放流前收集放流魚類的鱗片樣本、在調查水域采集和放流品種一致的魚類鱗片樣本，提取兩種來源樣本的基因組DNA；步驟2，以步驟1得到的DNA為模板進行PCR擴增；步驟3，運用Cervus軟件分析兩種來源的魚類微衛星標記，鑒定得到調查水域采集的魚類增殖放流個體。所述的鑒定魚類增殖放流個體的方法中，步驟2中PCR擴增體系為：PCR反應總體積為15μL，其中16.6ng/μLDNA模板2μL，2×TaqPCRMix5μL，10μmol/L正向和反向引物各0.5μL，去離子水7μL。有益效果：本發明利用分子標記來進行個體鑒定，通過提取魚類鱗片DNA，篩選微衛星引物，多重PCR擴增，Cervus軟件分析微衛星標記等步驟鑒定出放流的個體，準確率達到99.99％。該方法具有不損傷魚體，操作性強，準確率高等優點。通過本方法建立的一套操作流程，可應用于魚類的增殖放流效果評估研究中。具體實施方式下面通過具體實施方式對本發明作進一步詳細說明。但本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發明，而不應視為限定本發明的范圍。實施例中未注明具體技術或條件者，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件(例如參考J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯的《分子克隆實驗指南》，第三版，科學出版社)或者按照產品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規產品。實施例11.用磁珠富集法開發微衛星標記，篩選出擴增效率好，多態性高的引物。取15對微衛星引物，用PET6，FAM，NED和VIC等不同熒光標記引物，根據擴增片段大小及標記的熒光構成三組多重PCR，建立穩定的PCR反應體系。其中Multiplex1含有5對PCR引物，Multiplex2含有5對PCR引物，Multiplex3含有5對PCR引物，見表1。在三組多重PCR中，每對引物的濃度均一致。表1擴增的微衛星引物及其熒光標記引物名稱熒光標記引物序列(5’-3’)多重PCRF1-FPETCGTAATGGAAGTCAGTGGACTGGMultiplex1F1-RCTGATTTAGCTTTTTAGTGCCCAATGCF2-FNEDTTATTATCCAAAGGGGTCAAAAMultiplex1F2-RGAGGTCGCTGGGGTTTACTATF3-FPETCTTTACAAATAGACAGACTMultiplex1F3-RGTCATACAGTCACTATCATCF4-FNEDCCTTTTGACAGATTTAGGATTTCMultiplex1F4-RCAAACCAAACATACCTAAAGCCF5-F6FAMGGCCCAGACAGATAAACAAACACGCMultiplex1F5-RGCCAACAGCAGCATCTACACCCAGF6-FNEDTTGTGAAGGGGCTGACTAACMultiplex2F6-RTCAATTGTTGGGTGCACATAGF7-F6FAMCTTGGAATATCTAGAATATGGCMultiplex2F7-RGTTCATGTGTTAATGTTGCGTGF8-FPETCTTGGTCCCGTTCTTACGACAACCMultiplex2F8-RTGCACGCTGCTTGGTCCTTGF9-FPETTTAGATGGTGGGATACTGGGAGGCMultiplex2F9-RCGGGAGCCCCATAACCCTACTAATAACF10-FNEDATCGAAATGGAACTTTTGAATGMultiplex2F10-RGCTTAGGGCTGAGAGAGGAATACF11-FPETTGGCAGGGATTTGACATAACMultiplex3F11-RGGGTTGAGTAGGGAGGCTTGF12-FNEDTCGCTGTGTATCAGTATTTTGGMultiplex3F12-RACTCGGATAACACTCACAGGTCF13-F6FAMTGTGGATTTTTGTATTATGTTAMultiplex3F13-RATACATTTCCTCCTCATTCAGTF14-FVICAGGAAGGTGCTGAAGAGGAACMultiplex3F14-RCAATTACCACAAGCCCGCTCF15-FVICGATGGCAAAGAGGAAAGTGAGMultiplex3F15-RTTGTTATGCTCTACCTCTGAA2.放流前，用鑷子取1143尾三文魚尾部鱗片，同樣方法取河流上游垂釣到的210尾三文魚尾部鱗片放入牛皮樣品袋中保存。取上述不同來源樣品的三片鱗片放入96孔板中的樣品孔中，加入75μl堿性裂解液(0.25mMNaOH,0.2mMEDTA)，加熱樣品到95℃，持續10分鐘，迅速冷卻樣品到4℃，加75μl中性液(40mMTris-HCl)，得到樣品的DNA。4℃保存備用。3.運用PCR儀同時擴增兩種來源的三文魚DNA，ABI3730測序儀分析擴增的微衛星片段大小。三組多重PCR擴增的反應體系為：PCR反應總體積為15μL，其中DNA模板(約16.6ng/μL)2μL，2×TaqPCRMix5μL，正向和反向引物(10μmol/L)各0.5μL，去離子水7μL。其中multiplex1和MultiplexPCR2的反應程序均為：95℃預變性3min；94℃變性45s，55℃退火溫度45s，72℃延伸1min，循環28次；72℃延伸5min；4℃保存。MultiplexPCR3的反應程序為：95℃預變性3min；94℃變性45s，57℃退火溫度45s，72℃延伸1min，循環30次；72℃延伸5min；4℃保存。PCR產物直接通過ABI3730測序儀分析，獲得擴增的微衛星片段大小。4.運用Cervus軟件分析放流和垂釣的三文魚個體微衛星標記，Allowfuzzymatching選項設為2。分析得出210尾垂釣到的三文魚中有135尾是來自放流的三文魚，見表2。其中第一列是垂釣到的三文魚個體編號，第三列是來自放流的三文魚個體編號。從表2中可看出，除了SF138和V386有一個位點錯配外，其它的垂釣到的三文魚基因型和放流的三文魚基因型完全匹配，可認定這135尾三文魚來自放流的，而另外65尾三文魚則來自其它源頭。表2放流和垂釣的三文魚個體微衛星標記比對由上表可知，采用本發明的鑒別方法可準確的鑒定出漁獲物中哪些是放流的個體，為魚類的增殖放流效果評估提供依據，準確率能達到99.99％，可應用于魚類的增殖放流效果評估研究中。SEQUENCELISTING<110>中國水產科學研究院淡水漁業研究中心<120>一種用于鑒定魚類增殖放流個體的引物、試劑盒及鑒別方法<130>2016<160>30<170>PatentInversion3.3<210>1<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>1cgtaatggaagtcagtggactgg23<210>2<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>2ctgatttagctttttagtgcccaatgc27<210>3<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>3ttattatccaaaggggtcaaaa22<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>4gaggtcgctggggtttactat21<210>5<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>5ctttacaaatagacagact19<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>6gtcatacagtcactatcatc20<210>7<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>7ccttttgacagatttaggatttc23<210>8<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>8caaaccaaacatacctaaagcc22<210>9<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>9ggcccagacagataaacaaacacgc25<210>10<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>10gccaacagcagcatctacacccag24<210>11<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>11ttgtgaaggggctgactaac20<210>12<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>12tcaattgttgggtgcacatag21<210>13<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>13cttggaatatctagaatatggc22<210>14<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>14gttcatgtgttaatgttgcgtg22<210>15<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>15cttggtcccgttcttacgacaacc24<210>16<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>16tgcacgctgcttggtccttg20<210>17<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>17ttagatggtgggatactgggaggc24<210>18<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>18cgggagccccataaccctactaataac27<210>19<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>19atcgaaatggaacttttgaatg22<210>20<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>20gcttagggctgagagaggaatac23<210>21<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>21tggcagggatttgacataac20<210>22<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>22gggttgagtagggaggcttg20<210>23<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>23tcgctgtgtatcagtattttgg22<210>24<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>24actcggataacactcacaggtc22<210>25<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>25tgtggatttttgtattatgtta22<210>26<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>26atacatttcctcctcattcagt22<210>27<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>27aggaaggtgctgaagaggaac21<210>28<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>28caattaccacaagcccgctc20<210>29<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>29gatggcaaagaggaaagtgag21<210>30<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>30ttgttatgctctacctctgaa21當前第1頁1 2 3