專利名稱：一種維持魚類腸細(xì)胞增殖分化的原代培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種動物腸細(xì)胞分離和培養(yǎng)方法，具體涉及一種魚腸細(xì)胞分離、純化和原代培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
魚類腸細(xì)胞為腸道主要功能性細(xì)胞，參與腸道營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收、免疫屏障和應(yīng)激反應(yīng)等多種重要生理過程。同時，腸細(xì)胞還是增殖分化最快的一類細(xì)胞，對維持腸道黏膜上皮功能正常非常重要。由于神經(jīng)、體液和許多類群細(xì)胞與腸細(xì)胞間存在廣泛的相互作用，使體內(nèi)試驗研究腸細(xì)胞非常困難。而腸細(xì)胞體外培養(yǎng)研究模型為研究腸細(xì)胞增殖、分化凋亡，營養(yǎng)物質(zhì)吸收利用及轉(zhuǎn)化提供了準(zhǔn)確的手段，是探討營養(yǎng)物質(zhì)對腸細(xì)胞營養(yǎng)作用機(jī)制、重金屬及其它有毒有害物質(zhì)對腸道損傷與腸道修復(fù)機(jī)制、篩選有益魚類腸道健康的功能性飼料的理想模型。因此，依據(jù)腸細(xì)胞的生物學(xué)特點，建立體外魚腸細(xì)胞培養(yǎng)研究模型， 對于各相關(guān)領(lǐng)域的研究非常重要。目前魚類腸細(xì)胞原代培養(yǎng)已有研究。其方法是采用單一的膠原蛋白酶分離魚腸細(xì)胞，利用魚皮膠原蛋白為腸細(xì)胞貼壁支持物，在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。由于現(xiàn)有培養(yǎng)方法條件要求高，在科學(xué)試驗研究中應(yīng)用很少。主要問題表現(xiàn)在以下幾個方面(1)現(xiàn)有的魚腸細(xì)胞分離單一使用膠原蛋白酶，需要酶量較大，細(xì)胞損傷嚴(yán)重，產(chǎn)率低。腸細(xì)胞團(tuán)比例小，腸細(xì)胞貼壁生長困難，細(xì)胞接種數(shù)量需要量大。因此，需要研究一種更有效的魚腸細(xì)胞分離方法，使分離的腸細(xì)胞受損更小，細(xì)胞團(tuán)比例大，增殖分化能力更強(qiáng)。(2)現(xiàn)有的魚腸細(xì)胞貼壁培養(yǎng)方法使用魚皮膠原蛋白涂抹促進(jìn)腸細(xì)胞貼壁，由于魚皮膠原蛋白制作程序繁復(fù)，無商品試劑購買，實踐使用比較困難。因此，需找一種更方便的涂抹材料，以保證接種魚類腸細(xì)胞的貼壁生長效果更好。(3)現(xiàn)有魚腸細(xì)胞原代培養(yǎng)方法采用二氧化碳培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，易受污染，使得培養(yǎng)操作過程比較復(fù)雜。因此，尋找一種更為簡便的培養(yǎng)方法非常必要。(4)谷氨酰胺是細(xì)胞體外培養(yǎng)生長的重要營養(yǎng)物質(zhì)之一。由于魚類對谷氨酰胺的代謝利用與陸生溫血動物相比差異很大。因此，有必要優(yōu)化調(diào)整谷氨酰胺的使用量。故本研究主要致力于建立簡便有效的魚腸細(xì)胞分離和方法，以供研究魚腸細(xì)胞增殖分化和代謝等的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種簡便有效魚類腸細(xì)胞的分離和原代培養(yǎng)方法。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種魚類腸細(xì)胞分離和原代培養(yǎng)方法，依次包括以下步驟1、按常規(guī)方法將魚體表消毒，無菌取出整個內(nèi)臟，去除腸道表面的系膜組織，洗凈
3腸道內(nèi)容物。2、用眼科剪將腸道剪切成2 3mm的組織小塊。3、用膠原酶和中性蛋白酶混合液消化分離腸細(xì)胞，得到魚腸細(xì)胞和細(xì)胞團(tuán)。4、用離心方法分離純化得到魚腸細(xì)胞團(tuán)。5、將分離純化的魚腸細(xì)胞團(tuán)計數(shù)接種于膠原蛋白涂抹的培養(yǎng)板中進(jìn)行培養(yǎng)。6、接種的魚腸細(xì)胞團(tuán)在M 條件下原代培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁生長，增殖分化。作為本發(fā)明的魚腸細(xì)胞體外培養(yǎng)方法的改進(jìn)步驟幻腸細(xì)胞消化分離處理包括以下內(nèi)容A、混合酶消化液中膠原蛋白酶XI濃度為50IU/ml，中性蛋白酶I濃度為20ug/ ml οB、腸道組織小塊與混合消化液的質(zhì)量體積比大約為1 10。C、組織小塊消化液溫度為25°C恒溫?fù)u床中，100轉(zhuǎn)/分振蕩消化70分鐘。作為本發(fā)明的魚腸細(xì)胞體外培養(yǎng)方法的改進(jìn)步驟4)腸細(xì)胞團(tuán)的分離純化包括以下內(nèi)容用S-DMEM液(含3. 5%山梨醇的DNEM培養(yǎng)液)洗滌分離純化得到的細(xì)胞團(tuán)。作為本發(fā)明的魚腸細(xì)胞體外培養(yǎng)方法的改進(jìn)步驟幻腸細(xì)胞團(tuán)的適宜接種數(shù)量處理包括以下內(nèi)容A、利用商品膠原蛋白涂抹細(xì)胞培養(yǎng)器皿。B、將分離到的細(xì)胞團(tuán)懸液稀釋后在血細(xì)胞計數(shù)板上計數(shù)，以350個細(xì)胞團(tuán)/平方厘米的濃度接于膠原蛋白包被的培養(yǎng)器皿。作為本發(fā)明的魚腸細(xì)胞體外培養(yǎng)方法的改進(jìn)步驟6)腸細(xì)胞團(tuán)的培養(yǎng)條件處理包括以下內(nèi)容A、培養(yǎng)溫度以25 為宜。B、所用細(xì)胞生長培養(yǎng)液含2. 5%胎牛血清，10yg/ml胰島素，40μ g/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白，1. lmg/ml谷氨酰胺，3. 7g/L碳酸氫鈉，200IU/ml青霉素，200IU/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液。C、培養(yǎng)液中加入lOmmol/1 Hepes維持pH穩(wěn)定，密閉培養(yǎng)細(xì)胞。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的魚腸細(xì)胞原代培養(yǎng)方法具有以下明顯的優(yōu)點1、本發(fā)明首次提出用混合酶液消化分離魚類腸細(xì)胞的方法。2、本發(fā)明根據(jù)魚類腸道組織結(jié)構(gòu)特點，摸索了最佳的魚腸細(xì)胞分離酶的種類、使用濃度和腸細(xì)胞團(tuán)的純化方法。3、采用商品膠原蛋白涂抹方便涂抹細(xì)胞培養(yǎng)器皿，摸索了最佳的魚腸細(xì)胞接種和密閉培養(yǎng)條件。4、本發(fā)明所述的培養(yǎng)條件和方法，能夠幫助初次進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的研究人員，比較順利的完成魚類腸細(xì)胞的分離和原代培養(yǎng)。


圖1分離良好的鯉魚腸細(xì)胞團(tuán)；分離的腸細(xì)胞團(tuán)結(jié)構(gòu)完整，數(shù)量多，所占比大。圖2接種時的鯉魚腸細(xì)胞團(tuán)；細(xì)胞團(tuán)和細(xì)胞已附著在培養(yǎng)器皿的膠原大白涂抹層上。
圖3接種培養(yǎng)160小時后生長良好的鯉魚腸細(xì)胞形態(tài)；細(xì)胞數(shù)迅速增加，形成單層并融合成片，為典型的上皮型細(xì)胞。圖4不同濃度谷氨酰胺對魚腸細(xì)胞增殖的影響。谷氨酰胺能促進(jìn)魚腸細(xì)胞增殖， 各處理組細(xì)胞增殖率分別為35. 24%,81. 53%U08. 07%U16. 56%和114. 65%。
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。以下實施例中所用生長培養(yǎng)液的具體配方為01^11培養(yǎng)基，2.5%胎牛血清， 10 μ g/ml胰島素，40μ g/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白，1. lmg/ml谷氨酰胺，3. 7g/L碳酸氫鈉，200IU/ml青霉素，200IU/ml鏈霉素。其配制方法如下在200ml DMEM培養(yǎng)基中加入5ml標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清、0. 2mg胰島素、0. 4mg轉(zhuǎn)鐵蛋白、220mg谷氨酰胺、0. 84g碳酸氫鈉、40000IU的青霉素、 40000IU的鏈霉素。實施例1 一種魚腸細(xì)胞分離和原代培養(yǎng)方法，依次進(jìn)行以下步驟1、將體重50克左右鯉魚2尾，去頭，破壞脊髓。體表用75%酒精棉球常規(guī)擦拭滅菌，用眼科剪開腹腔，取出整個內(nèi)臟，放入一個盛有30ml Hanks液的培養(yǎng)皿中。2、用不銹鋼小鑷子將腸道分離出來，剪取腸道從腸球后面到腸道最后一個自然折前面所有的部分，放入盛有30ml Hanks液的培養(yǎng)皿，小心去除腸道表面的系膜組織，后用注射器將腸腔沖洗干凈。3、稱重沖凈后的腸道組織，然后用眼科剪剪切成2 3mm的組織小塊。用Hanks液將沖洗腸道組織小塊沖洗干凈后，移到50毫升的細(xì)胞培養(yǎng)瓶，待到組織小塊沉淀下來后， 移去多余的Hanks液，得到大約3g組織小塊。4、加入30ml混合消化液，混合消化液中膠原蛋白酶XI為50IU/ml，中性蛋白酶I 為20ug/ml，并加入30000IU青霉素，30000單位鏈霉素，于25 °C恒溫?fù)u床中，振蕩器轉(zhuǎn)速 100轉(zhuǎn)/分，振蕩消化70分鐘。不同消化酶濃度所對應(yīng)的消化結(jié)果如表1所示表1 不同消化酶濃度分離細(xì)胞、細(xì)胞團(tuán)的比例(％ )
膠原蛋白酶XI(U/ml)中性蛋白酶I(20ug/ml)細(xì)胞細(xì)胞團(tuán)30010088121506083178040802050207030 不同濃度消化試驗確定其最佳消化酶濃度為膠原蛋白酶XI為50IU/ml，中性蛋白酶 I 為 20ug/ml。 5、輕輕反復(fù)吹打消化后的組織塊3分鐘后，用15毫升S-DMEM液(含3. 5%山梨醇的DNEM培養(yǎng)液)洗滌分離消化細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的殘留物，將洗液轉(zhuǎn)移到50ml離心管中，蓋好蓋子，1000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘。圖1示分離良好的鯉魚腸細(xì)胞團(tuán)。
6、離心結(jié)束后，移去上清液，加入30毫升S-DMEM液將沉淀細(xì)胞團(tuán)輕輕吹打均勻， 靜置1分鐘，待管內(nèi)未消化的組織塊全部沉降后，輕輕將懸浮有細(xì)胞團(tuán)的上清液移入50ml
離心管中。7、重復(fù)用S-DMEM液提取消化產(chǎn)物中的細(xì)胞團(tuán)7_8次，每次用10毫升S-DMEM液， 直到上清液變得清亮，最后將離心管中未消化的組織塊沉淀棄去。8、將收集的上清液250g離心^iin后，去上清液，用30ml S-DMEM液將離心后的細(xì)胞團(tuán)沉淀重新懸浮，輕彈離心管底部，使細(xì)胞團(tuán)分散均勻后，再250g離心％iin，重復(fù)洗滌離心6次。9、分離得到的細(xì)胞團(tuán)沉淀用IOml生長培養(yǎng)液(添加lOmmol/1 Hepes)重新懸浮。 移取細(xì)胞團(tuán)懸液20μ 1，稀釋后在倒置顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞團(tuán)計數(shù)。根據(jù)細(xì)胞團(tuán)的計數(shù)結(jié)果， 以350個細(xì)胞團(tuán)/平方厘米的濃度接于商品膠原蛋白包被的M孔培養(yǎng)板(涂抹商品膠原蛋白)中。不同接種數(shù)量的腸細(xì)胞團(tuán)對腸細(xì)胞分化成熟的影響見表2。不同接種濃度試驗確定其最佳接種濃度為350個細(xì)胞團(tuán)/平方厘米。表2不同接種數(shù)量的腸細(xì)胞團(tuán)對腸細(xì)胞分化成熟的影響
細(xì)胞團(tuán)接種數(shù)量(個/CM2)502003505006508009501100腸細(xì)胞AKP活性(U/MTT0D)0. 0020. 0130. 0150. 0140. 0120. 0100.0040.00510、將接種好的培養(yǎng)板放在倒置顯微鏡的載物臺上(溫度為25 )，整體觀察細(xì)胞培養(yǎng)板每一孔細(xì)胞團(tuán)的數(shù)量和分布情況，并作描述和照相記錄，從中隨機(jī)選擇六個細(xì)胞團(tuán)，用記號筆在培養(yǎng)板上作上標(biāo)記，定位觀察細(xì)胞團(tuán)分散貼壁生長的過程。圖2示接種時的鯉魚腸細(xì)胞團(tuán)。11、接種培養(yǎng)96小時后，將培養(yǎng)板每孔中的細(xì)胞培養(yǎng)液、細(xì)胞碎片和未貼壁的細(xì)胞一并移出，細(xì)胞培養(yǎng)板的每一孔中加入200 μ 1 DMEM培養(yǎng)液，輕輕振蕩洗滌1次，移出洗滌液后，每孔中加入新的生長培養(yǎng)液lml，在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)，或并根據(jù)不同實驗需要利用培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行試驗。圖3示接種培養(yǎng)160小時后生長良好的鯉魚腸細(xì)胞形態(tài)。不同濃度谷氨酰胺對魚腸細(xì)胞增殖的影響見圖4。不同濃度谷氨酰胺對魚腸細(xì)胞增殖的影響試驗結(jié)果確定其最佳濃度為1100mg/L。最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個具體實施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種維持魚類腸細(xì)胞增殖分化的原代培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟1)、按常規(guī)方法將魚體表消毒，無菌取出整個內(nèi)臟，去除腸道表面的系膜組織，洗凈腸道內(nèi)容物；2)、將腸道剪切成2 3mm的組織小塊；3)、用混合液消化分離腸細(xì)胞，得到魚腸細(xì)胞和細(xì)胞團(tuán)；4)、用離心方法分離純化得到魚腸細(xì)胞團(tuán)；5)、將分離純化的魚腸細(xì)胞團(tuán)計數(shù)接種于膠原蛋白涂抹的培養(yǎng)板中進(jìn)行培養(yǎng)；6)、接種的魚腸細(xì)胞團(tuán)在24 ^TC條件下原代培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁生長，增殖分化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的原代培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟3)腸細(xì)胞消化分離處理包括以下內(nèi)容A、混合酶消化液中膠原蛋白酶XI濃度為50IU/ml，中性蛋白酶I濃度為20ug/ml；B、腸道組織小塊與混合消化液的質(zhì)量體積比大約為1 10;C、組織小塊消化液溫度為25°C恒溫?fù)u床中，100轉(zhuǎn)/分振蕩消化70分鐘。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的原代培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟4)腸細(xì)胞團(tuán)的分離純化包括以下內(nèi)容用S-DMEM液(含3. 5%山梨醇的DNEM培養(yǎng)液)洗滌分離純化得到的細(xì)胞團(tuán)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的原代培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟5)腸細(xì)胞團(tuán)的適宜接種數(shù)量處理包括以下內(nèi)容A、利用商品膠原蛋白涂抹細(xì)胞培養(yǎng)器皿；B、將分離到的細(xì)胞團(tuán)懸液稀釋后在血細(xì)胞計數(shù)板上計數(shù)，以350個細(xì)胞團(tuán)/平方厘米的濃度接于膠原蛋白包被的培養(yǎng)器皿。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的原代培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟6)腸細(xì)胞團(tuán)的培養(yǎng)條件處理包括以下內(nèi)容A、培養(yǎng)溫度25 ；B、所用細(xì)胞生長培養(yǎng)液含2.5%胎牛血清，10yg/ml胰島素，40μ g/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白， 1. lmg/ml谷氨酰胺，3. 7g/L碳酸氫鈉，200IU/ml青霉素，200IU/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液；C、培養(yǎng)液中加入lOmmol/1Hepes維持pH穩(wěn)定，密閉培養(yǎng)細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了維持魚類腸細(xì)胞增殖分化的原代培養(yǎng)方法，包括以下步驟1)、按常規(guī)方法將魚體表消毒，無菌取出整個內(nèi)臟，去除腸道表面的系膜組織，洗凈腸道內(nèi)容物；2)、將腸道剪切成2～3mm的組織小塊；3)、用混合液消化分離腸細(xì)胞，得到魚腸細(xì)胞和細(xì)胞團(tuán)；4)、用離心方法分離純化得到魚腸細(xì)胞團(tuán)；5)、將分離純化的魚腸細(xì)胞團(tuán)計數(shù)接種于膠原蛋白涂抹的培養(yǎng)板中進(jìn)行培養(yǎng)；6)、接種的魚腸細(xì)胞團(tuán)在24～26℃條件下原代培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁生長，增殖分化。本發(fā)明根據(jù)魚類腸道組織結(jié)構(gòu)特點，摸索了最佳的魚腸細(xì)胞分離酶的種類、使用濃度和腸細(xì)胞團(tuán)的純化方法。采用商品膠原蛋白涂抹方便涂抹細(xì)胞培養(yǎng)器皿，摸索了最佳的魚腸細(xì)胞接種和密閉培養(yǎng)條件。
文檔編號C12N5/071GK102382795SQ20111034882
公開日2012年3月21日 申請日期2011年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月8日
發(fā)明者馮琳, 劉揚(yáng), 周小秋, 姜俊, 姜維丹, 胡凱 申請人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)