本發明涉及植物組織培養和遺傳轉化方法，特別是涉及一種通過大豆未成熟胚作為外植體，進行真空輔助農桿菌侵染，誘導產生抗性的大豆愈傷組織，進而通過分化培養，產生轉基因大豆植株的方法。
背景技術：
大豆屬一年生豆科草本植物，是世界上食用油和植物蛋白的重要來源，中國擁有悠久的大豆種植歷史。通過分子育種及轉基因手段來改良大豆種質資源目前已成了大豆育種的趨勢。目前轉基因技術已廣泛應用到大豆生物技術育種和基因功能鑒定領域，基因轉化的主要手段有農桿菌介導轉化、基因槍轉化方法和花粉管通道法，其中常用的是農桿菌介導法。遺傳轉化過程中，通常的做法是利用大豆子葉節外植體進行遺傳轉化操作，這種方法嵌合體多，轉化效率低，工作量大。利用大豆未成熟胚進行遺傳轉化操作雖然也有報道(錢雪艷，郭東全，楊向東，等.安徽農業科學，2012，40(2)：658-661)，但是這種方法轉化周期長，工作量大，轉化效率低，轉化體少。因此，本領域的技術人員致力于開發一種新的大豆遺傳轉化方法。
技術實現要素：
本發明針對現有技術存在的上述不足，提供了一種真空輔助農肝菌侵染的大豆遺傳轉化方法。本發明將大豆未成熟胚作為外植體，用農桿菌真空輔助侵染，共培養基培養,除菌培養基清洗后轉移至含有篩選劑的誘導培養基中，形成抗性的愈傷組織。再誘導分化成抗性苗，生根后進行煉苗和移栽，較快地獲得大量的轉基因植株。本發明操作簡單，遺傳轉化率高，周期短，能夠快速地獲得大量的轉基因植株。
本發明提供一種真空輔助農桿菌侵染的大豆遺傳轉化方法，在一個具體實施方式中，包括以下步驟：
1)獲得大豆未成熟胚；
2)利用農桿菌侵染，真空輔助轉化步驟1)中所獲得的未成熟胚后將其轉移至共培養基培養；
3)利用除菌培養基清洗步驟2)中產生的未成熟胚，清洗后未成熟胚轉移至含篩選劑的誘導培養基進行誘導，產生抗性愈傷組織；
4)利用含篩選劑的分化培養基對步驟3)中產生的抗性愈傷組織進行分化形成誘導芽，通過繼代和生根培養獲得再生苗；
5)對步驟4)獲得的再生苗進行煉苗和移栽，收獲轉基因植株的種子。
進一步地，未成熟胚是大豆開花25-30天的未成熟種子，去掉種皮和胚芽后獲得的未成熟胚，長度3-6mm。優選地，挑選無病蟲害大豆嫰莢，用自來水沖洗10-30分鐘后，75％乙醇消毒1分鐘，然后用無菌水沖洗3-5次。在無菌臺內剝開莢皮，用鑷子取出未成熟種子。優選地，未成熟種子長度為4mm。
進一步地，在上述未成熟胚背面劃6-9刀，深度0.3-0.6mm，長度1-3mm。優選地，深度約為0.5mm，長度約為2mm。
進一步地，步驟2)中農桿菌的侵染濃度為OD600＝0.1-0.3。
進一步地，真空輔助轉化的程序為：抽真空，以0.1Mpa壓強維持5-10分鐘，然后緩慢釋放，在溫度25℃的搖床上侵染20-40分鐘。優選地，取對數生長期的新鮮菌液5000rpm室溫離心10分鐘后，加入侵染培養基重懸至OD600＝0.1-0.3。優選地，農桿菌加入侵染培養基重懸至OD600＝0.1。優選地，搖床上侵染30分鐘。將轉化后的未成熟胚轉移到共培養基中，暗培養1-2天。
進一步地，在步驟3)中，未成熟胚在無菌的條件下用除菌培養基中洗3-5次，放到濾紙上瀝干。在含篩選劑的誘導培養基中誘導未成熟胚2周。
進一步地，誘導培養基中的篩選劑濃度為8mg/L。
進一步地，分化培養基中的篩選劑濃度為4mg/L。
進一步地，步驟4)中，當誘導芽長到2-3cm時轉入生根培養基中培養，每兩周繼代一次，直至根長2-3cm，獲得再生苗。
進一步地，再生苗煉苗3-5天，然后移栽到滅菌過的含珍珠巖的土壤中，保持濕潤狀態，其中珍珠巖：土壤＝1:3，初期光照18h/天，溫度25-30℃培養，待植株高度為35-45cm時，光照變為11h/天，以促進其開花。
優選地，本發明中的大豆選自：天隆1號，william 82或Jack。
進一步地，所述共培養培養基為：1/10×MS鹽、1/10×B5維生素、3％蔗糖、3.9g/L MES、0.04g/L乙酰丁香酮、400mg\L L-半胱氨酸、154mg/L二硫蘇糖醇、瓊脂7g/L，pH值為5.4；
所述除菌培養基為：1×MS鹽、1×B5維生素、3％蔗糖、100mg/L頭孢霉素、50mg/L特美汀和50mg/L萬古霉素，pH值為7.0；
所述誘導培養基為：1×MS鹽、1×B5維生素、3％蔗糖、5mg/L 2,4-D、8mg/L篩選劑、100mg/L頭孢霉素、50mg/L特美汀和50mg/L萬古霉素、植物凝膠3g/L，pH值為5.7；
所述分化培養基為：1×MS鹽、1×B5維生素、6％的麥芽糖、4mg/L篩選劑、100mg/L頭孢霉素、50mg/L特美汀、50mg/L萬古霉素和0.3％植物凝膠，pH值為5.7。
本發明中直接使用大豆未成熟胚進行遺傳轉化，較常規遺傳轉化方法，減少了大豆種子培養的過程，縮短了以往大豆未成熟胚遺傳轉化的周期；通過真空輔助可以在大豆未成熟胚上制造許多微小的創口，提高農桿菌侵染效率；擴繁未成熟胚轉化后產生的愈傷組織，不需要加代，當代就能獲得大量的轉基因植株；同時該方法產生的嵌合體少，基因轉化快速，轉化后代遺傳穩定，基因組中只有一個整合位點，單拷貝比例高。
以下將結合具體實施例對本發明的構思、具體步驟及產生的技術效果作進一步說明，以充分地了解本發明的目的、特征和效果。
具體實施方式
實施例1
(1)挑選天隆1號開花后25-30天無病蟲害大豆嫰莢，用自來水沖洗15分鐘后，75％乙醇消毒1分鐘，然后用無菌水沖洗3次。在無菌臺內剝開莢皮，用鑷子取出未成熟種子，剝取2片未成熟胚，在未成熟胚背面劃7刀，深度0.5mm左右，長度2mm左右。
(2)侵染轉化試驗前3天，從-80冰箱取農桿菌(含待轉化的外源基因bar)劃平板。28℃培養兩天，挑平板上單克隆到2ml YEP液體培養基(含相應抗生素)，28℃搖菌過夜。按照1:50比例取菌液加入到新的YEP液體培養基中(含相應抗生素)，搖菌到OD600＝0.6-0.8。5000rpm室溫離心10分鐘后，加入侵染培養基重懸至OD600＝0.1-0.3，倒入無菌的三角瓶中。然后抽真空，0.1Mpa維持5分鐘，然后緩慢釋放，25℃搖床上繼續侵染30分鐘。將轉化后的未成熟胚轉移到共培養基中，共培養基上放置一張濾紙以防止農桿菌過度生長，暗培養2天，溫度為28℃。
其中侵染培養基配方為：1/10×MS鹽、1/10×B5維生素、3％蔗糖、3.9g/L MES、0.04g/L乙酰丁香酮、400mg\L L-半胱氨酸和154mg/L二硫蘇糖醇，pH值為5.4；共培養基的配方為：1/10×MS鹽、1/10×B5維生素、3％蔗糖、3.9g/L MES、0.04g/L乙酰丁香酮、400mg\L L-半胱氨酸、154mg/L二硫蘇糖醇，瓊脂7g/L，pH值為5.4。
(3)將共培養基中的未成熟胚轉移到無菌的條件下的除菌培養基中清洗3次，放到濾紙上瀝干。經過除菌培養基清洗的未成熟胚轉移到誘導培養基中誘導培養2周形成愈傷組織。
其中除菌培養基的配方為：1×MS鹽、1×B5維生素、3％蔗糖、100mg/L頭孢霉素、50mg/L特美汀和50mg/L萬古霉素，pH值為7.0；誘導培養基的配方為：1×MS鹽、1×B5維生素、3％蔗糖、5mg/L 2,4-D、8mg/L除草劑、100mg/L頭孢霉素、50mg/L特美汀和50mg/L萬古霉素、植物凝膠3g/L，pH值為5.7。
(4)將愈傷組織轉移到分化培養基中誘導成芽，待誘導芽伸長到2-3cm高時，移入到生根培養基，每兩周繼代一次，直至根長2-3cm，獲得再生苗。
其中分化培養基配方為：1×MS鹽、1×B5維生素、6％的麥芽糖、4mg/L除草劑、100mg/L頭孢霉素、50mg/L特美汀、50mg/L萬古霉素和0.3％植物凝膠，pH值為5.7；所述的生根培養基配方為：1/2×MS鹽、1/2×B5維生素、2％蔗糖、1mg/L IBA、0.3％植物凝膠，pH值為5.6。
(5)將獲得的再生苗煉苗3天，然后轉移到滅菌過的含珍珠巖的土壤中，保持濕潤狀態，其中珍珠巖：土壤＝1：3，初期光照18h/天，溫度25-30℃，待植株高度約為40cm左右時，光照變為11h/天，以促進其開花，收獲轉基因苗株的種子。
結果表明，與上述文獻所述的方法相比，通過真空輔助農桿菌侵染未成熟胚，誘導、分化培養，轉化周期縮短42天，轉基因植株量大，且轉化效率高，形成高比例單拷貝。
實施例2
(1)挑選Williams 82開花后25-30天無病蟲害大豆嫰莢，用自來水沖洗15分鐘后，75％乙醇消毒1分鐘，然后用無菌水沖洗3次。在無菌臺內剝開莢皮，用鑷子取出未成熟種子，剝取2片未成熟胚，在未成熟胚背面劃8刀，深度0.5mm左右，長度2mm左右。
(2)侵染轉化試驗前3天，從-80冰箱取農桿菌(含待轉化的外源基因bar)劃平板。28℃培養兩天，挑平板上單克隆到2ml YEP液體培養基(含相應抗生素)，28℃搖菌過夜。按照1:50比例取菌液加入到新的YEP液體培養基中(含相應抗生素)，搖菌到OD600＝0.6-0.8。5000rpm室溫離心10分鐘后，加入侵染培養基重懸至OD600＝0.1-0.3，倒入無菌的三角瓶中。然后抽真空，0.1Mpa維持8分鐘，然后緩慢釋放，25℃搖床上繼續侵染30分鐘。將轉化后的未成熟胚轉移到共培養基中，共培養基上放置一張濾紙以防止農桿菌過度生長，暗培養2天，溫度為28℃。
其中侵染培養基配方為：1/10×MS鹽、1/10×B5維生素、3％蔗糖、3.9g/L MES、0.04g/L乙酰丁香酮、400mg\L L-半胱氨酸和154mg/L二硫蘇糖醇，pH值為5.4；共培養基的配方為：1/10×MS鹽、1/10×B5維生素、3％蔗糖、3.9g/L MES、0.04g/L乙酰丁香酮、400mg\L L-半胱氨酸、154mg/L二硫蘇糖醇，瓊脂7g/L，pH值為5.4。
(3)將共培養基中的未成熟胚轉移到無菌的條件下的除菌培養基中清洗5次，放到濾紙上瀝干。經過除菌培養基清洗的未成熟胚轉移到誘導培養基中誘導培養2周形成愈傷組織。
其中除菌培養基的配方為：1×MS鹽、1×B5維生素、3％蔗糖、100mg/L頭孢霉素、50mg/L特美汀和50mg/L萬古霉素，pH值為7.0；誘導培養基的配方為：1×MS鹽、1×B5維生素、3％蔗糖、5mg/L 2,4-D、8mg/L除草劑、100mg/L頭孢霉素、50mg/L特美汀和50mg/L萬古霉素、植物凝膠3g/L，pH值為5.7。
(4)將愈傷組織轉移到分化培養基中誘導成芽，待誘導芽伸長到2-3cm高時，移入到生根培養基，每兩周繼代一次，直至根長2-3cm，獲得再生苗。
其中分化培養基配方為：1×MS鹽、1×B5維生素、6％的麥芽糖、4mg/L除草劑、100mg/L頭孢霉素、50mg/L特美汀、50mg/L萬古霉素和0.3％植物凝膠，pH值為5.7；所述的生根培養基配方為：1/2×MS鹽、1/2×B5維生素、2％蔗糖、1mg/L IBA、0.3％植物凝膠，pH值為5.6。
(5)將獲得的再生苗煉苗5天，然后轉移到滅菌過的含珍珠巖的土壤中，保持濕潤狀態，其中珍珠巖：土壤＝1：3，初期光照18h/天，溫度25-30℃，待植株高度約為40cm左右時，光照變為11h/天，以促進其開花，收獲轉基因苗株的種子。
結果表明，與上述文獻所述的方法相比，通過真空輔助農肝菌侵染未成熟胚，誘導、分化培養，轉化周期縮短50天，轉基因植株量大，且轉化效率高，形成高比例單拷貝。
實施例3
(1)挑選Jack開花后25-30天無病蟲害大豆嫰莢，用自來水沖洗15分鐘后，75％乙醇消毒1分鐘，然后用無菌水沖洗3次。在無菌臺內剝開莢皮，用鑷子取出未成熟種子，剝取2片未成熟胚，在未成熟胚背面劃7刀，深度0.5mm左右，長度2mm左右。
(2)侵染轉化試驗前3天，從-80冰箱取農桿菌(含待轉化的外源基因bar)劃平板。28℃培養兩天，挑平板上單克隆到2ml YEP液體培養基(含相應抗生素)，28℃搖菌過夜。按照1:50比例取菌液加入到新的YEP液體培養基中(含相應抗生素)，搖菌到OD600＝0.6-0.8。5000rpm室溫離心10分鐘后，加入侵染培養基重懸至OD600＝0.1-0.3，倒入無菌的三角瓶中。然后抽真空，0.1Mpa維持5分鐘，然后緩慢釋放，25℃搖床上繼續侵染30分鐘。將轉化后的未成熟胚轉移到共培養基中，共培養基上放置一張濾紙以防止農桿菌過度生長，暗培養2天，溫度為28℃。
其中侵染培養基配方為：1/10×MS鹽、1/10×B5維生素、3％蔗糖、3.9g/L MES、0.04g/L乙酰丁香酮、400mg\L L-半胱氨酸和154mg/L二硫蘇糖醇，pH值為5.4；共培養基的配方為：1/10×MS鹽、1/10×B5維生素、3％蔗糖、3.9g/L MES、0.04g/L乙酰丁香酮、400mg\L L-半胱氨酸、154mg/L二硫蘇糖醇，瓊脂7g/L，pH值為5.4。
(3)將共培養基中的未成熟胚轉移到無菌的條件下的除菌培養基中清洗4次，放到濾紙上瀝干。經過除菌培養基清洗的未成熟胚轉移到誘導培養基中誘導培養2周形成愈傷組織。
其中除菌培養基的配方為：1×MS鹽、1×B5維生素、3％蔗糖、100mg/L頭孢霉素、50mg/L特美汀和50mg/L萬古霉素，pH值為7.0；誘導培養基的配方為：1×MS鹽、1×B5維生素、3％蔗糖、5mg/L 2,4-D、8mg/L除草劑、100mg/L頭孢霉素、50mg/L特美汀和50mg/L萬古霉素、植物凝膠3g/L，pH值為5.7。
(4)將愈傷組織轉移到分化培養基中誘導成芽，待誘導芽伸長到2-3cm高時，移入到生根培養基，每兩周繼代一次，直至根長3cm，獲得再生苗。
其中分化培養基配方為：1×MS鹽、1×B5維生素、6％的麥芽糖、4mg/L除草劑、100mg/L頭孢霉素、50mg/L特美汀、50mg/L萬古霉素和0.3％植物凝膠，pH值為5.7；所述的生根培養基配方為：1/2×MS鹽、1/2×B5維生素、2％蔗糖、1mg/L IBA、0.3％植物凝膠，pH值為5.6。
(5)將獲得的再生苗煉苗4天，然后轉移到滅菌過的含珍珠巖的土壤中，保持濕潤狀態，其中珍珠巖：土壤＝1：3，初期光照18h/天，溫度25-30℃，待植株高度約為45cm左右時，光照變為11h/天，以促進其開花，收獲轉基因苗株的種子。
結果表明，與上述文獻所述的方法相比，通過真空輔助農肝菌侵染未成熟胚，誘導、分化培養，轉化周期縮短39天，轉基因植株量大，且轉化效率高，形成高比例單拷貝。
以上詳細描述了本發明的較佳具體實施例。應當理解，本領域的普通技術無需創造性勞動就可以根據本發明的構思作出諸多修改和變化。因此，凡本技術領域中技術人員依本發明的構思在現有技術的基礎上通過邏輯分析、推理或者有限的實驗可以得到的技術方案，皆應在由權利要求書所確定的保護范圍內。