本實用新型涉及環狀DNA拷貝數檢測，具體涉及一種檢測試劑盒。

背景技術：

線粒體是真核細胞內主管能量代謝的細胞器。不同類型細胞內線粒體的數量從幾百個到幾千個不等。線粒體DNA(mtDNA)是位于線粒體內裸露的雙鏈環狀DNA分子，通常每個線粒體含有2～10個拷貝。人類mtDNA全長16.6Kb，含37個基因，分別編碼13個蛋白、22個線粒體tRNA和2個線粒體rRNA。線粒體功能的實現依賴于mtDNA基因復制、轉錄，因而細胞內mtDNA數量變化必然引起線粒體功能的改變。線粒體是氧化磷酸化反應的中心，可產生大量自由基，對mtDNA造成損傷；加之mtDNA缺乏核DNA所具有的組蛋白保護及完備的DNA損傷修復機制，因而比基因組DNA更易受到損傷。損傷的mtDNA通過自噬途徑降解，細胞內mtDNA總數量減少，從而影響線粒體功能。

由于線粒體DNA量的變化導致線粒體故障已涉及癌癥、神經變性、糖尿病及老化，并在其他幾個臨床方面也已體現出影響(例如在體細胞或低質量的生殖細胞(卵母細胞)內逆轉錄病毒藥物誘導線粒體的耗竭)。因此，線粒體DNA的定量是至關重要的，不僅要了解病理表型和臨床進展，同時也可深入了解的線粒體DNA含量的一般變化。

研究表明，熒光定量PCR(Q-PCR)中每個模板的Ct(Cycle threshold)值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系，起始拷貝數越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數的標準品作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數的對數，縱坐標代Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。

目前已有的技術方案有mtDNA的全基因高通量測序，觀察突變位點，此方法測序周期長，而且需要專業的人員對測序結果進行分析并且需要大量的數據庫進行對比。

技術實現要素：

針對以上現有技術問題，本實用新型的目的在于提供一種檢測試劑盒，以解決現有技術中導致的上述缺陷。具體技術方案如下：

一種檢測試劑盒，包括方盒，泡沫墊以及試劑瓶，其中，所述方盒內置所述泡沫墊，方盒頂部設有盒蓋，盒蓋下表面設有定位塊；所述泡沫墊上開設有四個孔；所述試劑瓶分別為1號試劑瓶、2號試劑瓶、3號試劑瓶、4號試劑瓶，放置于所述四個孔內。

進一步地，所述塑料方盒的內尺寸為100～200mm(L)*20～40mm(W)*50～100mm(H)，所述泡沫板尺寸為100～200mm(L)*20～40mm(W)*25～50mm(H)。

進一步地，所述方盒為塑料方盒。

進一步地，所述試劑瓶均為透明試劑瓶。

進一步地，所述四個試劑瓶均具有瓶蓋。

進一步地，所述瓶蓋的顏色均不相同。

進一步地，所述瓶蓋上均設有圓形標識。

上述線粒體DNA拷貝數檢測試劑盒的使用方法，包含如下步驟：

(1)制備單細胞液；

(2)裂解定量細胞；

(3)Q-PCR反應；

(4)制備標準曲線；

(5)線粒體DNA拷貝數的絕對量化。

進一步地，包含如下步驟：

(1)制備單細胞液：通過酶促消化組織得到單細胞液，首先懸浮在1×PBS緩沖液中，使用細胞計數器計數；

(2)裂解定量細胞：轉移1000～10000個細胞到200μl薄壁PCR管中，加入等體積的2×蛋白消化液，40℃～60℃孵育6～12小時，接著80℃～95℃熱滅活10～30分鐘；

(3)Q-PCR反應：將每種樣品進行梯度稀釋并分別置于各PCR管中，然后加入PCR預混液、染色溶液，置于Q-PCR儀中進行反應；

(4)制備標準曲線：根據Q-PCR結果繪制標準曲線；

(5)線粒體DNA拷貝數的絕對量化：Ct值和標準的初始拷貝數的對數之間的關系應是線性的，相關系數R2>0.99。

與目前現有技術相比，本實用新型試劑盒大小適中，美觀。由于本試劑盒需要冷鏈運輸，內置泡沫板一方面可以固定試劑瓶，另一方面有隔熱的效果，經濟、實用。實驗方法簡單，易操作，無需很專業的技術要求。適合醫院及科研院所單位大范圍使用。

附圖說明

圖1為線粒體DNA拷貝數檢測試劑盒示意圖

具體實施方式

下面根據附圖對本實用新型進行詳細描述，其為本實用新型多種實施方式中的一種優選實施例。

圖1為線粒體DNA拷貝數檢測試劑盒示意圖，1號試劑瓶(稀釋緩沖液)，2號試劑瓶(蛋白消化液)，3號試劑瓶(PCR預混液)，4號試劑瓶(染色劑溶液)，還包括方盒和泡沫墊5，其中，所述方盒內置所述泡沫墊5，方盒頂部設有盒蓋6，盒蓋下表面設有定位塊7；所述泡沫墊5上開設有四個孔；所述試劑瓶分別為1號試劑瓶1、2號試劑瓶2、3號試劑瓶3、4號試劑瓶4，放置于所述四個孔內。

包括塑料方盒，所述塑料方盒內置大小合體的泡沫板5，所述泡沫板有四個孔洞，所述孔洞內放置四個試劑瓶，分別為1號試劑瓶1、2號試劑瓶2、3號試劑瓶3、4號試劑瓶4，所述1號試劑瓶1內盛放稀釋緩沖液，所述2號試劑瓶2內盛放蛋白消化液，所述3號試劑瓶3內盛放PCR預混液，所述PCR預混液(PCR Master Mix)包含dNTP、PCR緩沖液、MgCl2、ddH2O、Enhancer、引物對、Taq酶，所述4號試劑瓶4內盛放染色劑溶液。

在另一個優選實施例中，

一種線粒體DNA拷貝數檢測試劑盒及其應用，包括塑料方盒，所述塑料方盒內置大小合體的泡沫板，所述泡沫板有四個孔洞，所述孔洞內放置四個試劑瓶，分別為1號試劑瓶、2號試劑瓶、3號試劑瓶、4號試劑瓶，所述1號試劑瓶內盛放稀釋緩沖液，所述2號試劑瓶內盛放蛋白消化液，所述3號試劑瓶內盛放PCR預混液，所述PCR預混液(PCR Master Mix)包含dNTP、PCR緩沖液、MgCl2、ddH2O、Enhancer、引物對、Taq酶，所述4號試劑瓶內盛放染色劑溶液。

1、所述塑料方盒的內尺寸為100～200mm(L)*20～40mm(W)*50～100mm(H)，所述泡沫板尺寸為100～200mm(L)*20～40mm(W)*25～50mm(H)，所述稀釋緩沖液為PBS緩沖液、Hanks緩沖液及其他細胞緩沖液，優選PBS緩沖液，所述蛋白消化液為蛋白酶K、胃蛋白酶、胰蛋白酶，優選蛋白酶K，所述染色劑溶液為SYBR Green溶液、Eva Green溶液、LC Green溶液，優選10×SYBR Green工作液。使用方法包含如下步驟：

(1)制備單細胞液：通過酶(實驗室常規酶)促消化組織得到單細胞液，首先懸浮在1×PBS緩沖液中，使用細胞計數器計數。

(2)裂解定量細胞：轉移1000～10000個細胞到200μl薄壁PCR管中，加入等體積的2×蛋白消化液，40℃～60℃孵育6～12小時，接著80℃～95℃熱滅活10～30分鐘。

(3)Q-PCR反應：將每種樣品進行梯度稀釋并分別置于各PCR管中，然后加入PCR預混液、染色溶液，置于Q-PCR儀中進行反應。

(4)制備標準曲線：根據Q-PCR結果繪制標準曲線。

(5)線粒體DNA拷貝數的絕對量化：Ct值和標準的初始拷貝數的對數之間的關系應是線性的，相關系數R2>0.99。相關分析和回歸分析可以使用Microsoft Excel來完成。

引物對包含上引物和下引物，根據本試劑盒的具體應用可進行單獨設計合成，本試劑盒的應用包含乳腺癌、節直腸癌、衡量卵母細胞及胚胎質量，以上列出部分應用但本試劑盒的應用不限于此。

下述實施案例中所使用的試驗方法如無特殊說明，均為常規方法，下述實施案例中所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。

優選實施案例為小鼠胚胎組織細胞中線粒體DNA拷貝數的檢測：

通過酶促消化小鼠胚胎組織得到細胞液，首先懸浮在1×PBS中，使用細胞計數器計數(例如血球)。轉移1000的細胞到200μl薄壁PCR管中，加入等體積的2×裂解緩沖液，55℃孵育12小時，接著95℃熱滅活10分鐘。Q-PCR反應中應將每種樣品連續稀釋10¹-10³倍，用來建立標準曲線。

線粒體的絕對量化將通過標準曲線方法來進行。1ng線粒體標準品由1.24×10⁹的雙鏈DNA分子組成。1ng/μl標準10⁷-10²倍稀釋液實時PCR擴增范圍在1.0×10²至1.0×10⁷拷貝數內。Ct值和標準的初始拷貝數的對數之間的關系應是線性的，相關系數R2>0.99。相關分析和回歸分析可以使用Microsoft Excel來完成。

一個364孔PCR板上包括非稀釋、連續稀釋和標準的樣品測量。

1、PCR體系(試劑盒使用前將PCR預混液和染色劑溶液混合)

*可以推斷在每個反應中所用的細胞的數目。每個樣本個重復。

2、PCR條件

循環閾值數(Ct)由儀器提供的軟件來計算，例如ABI7900HT SDS2.3。每個PCR產物的量通過使用Ct值和標準濃度對數計算出的標準曲線的線性回歸模型進行校準標準曲線回歸方程為y＝–3.458x+41.491,其中y為Ct值,x為模板拷貝數以10為底的對數,相關系數為0.999。結果顯示,小鼠胚胎干細胞中mtDNA平均拷貝數/細胞為1 321±228,線粒體的含量比較豐富。反應體系具有較高的檢測敏感性,模板濃度在103～108拷貝/μL反應時,反應體系具有良好的重復性和特異性,結果可靠。

本實用新型的應用包含乳腺癌、節直腸癌、衡量卵母細胞及胚胎質量，以上列出部分應用但本試劑盒的應用不限于此。