本發明屬于多肽合成技術領域，具體涉及一種通過片段法合成六勝肽的方法。

背景技術：

六勝肽是一種含有六個氨基酸的活性多肽，其序列為Ac-Glu-Glu-Met-Gln-Arg-Arg-NH2，具有皮膚除皺的生物活性，廣泛應用于各種高級美容化妝品中。

目前，六勝肽的合成方法主要有固相合成法和液相合成法。固相合成法所使用的Fmoc-AM Resin和Fmoc-MBHA Resin價格昂貴，樹脂取代度較小，造成了六勝肽固相合成成本較高。液相合成法雖然原材料價格大大降低，但液相合成法合成過程繁雜，周期長，效率低，純化成本高。六勝肽作為化妝品原料，降低生產成本，提高生產效率，簡化合成工藝的研究具有重要意義。

因此，開發一種高效率低成本合成六勝肽的方法成為本領域急需解決的技術問題。

技術實現要素：

本發明解決的技術問題是提供一種合成成本低、合成效率高、合成方法簡單的優點，可用于規模化合成六勝肽的方法，其克服了現有經典固相合成六勝肽樹脂成本高、載量低的問題，也克服了液相合成六勝肽過程復雜、合成周期長、效率低的缺點。

具體來說，本發明公開了一種六勝肽的合成方法，通過2-Chlorotrityl Ch loride Resin合成Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH全保護片段肽，然后用全保護片段肽Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Ar g(pbf)-Arg(pbf)-OH和六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷、1-羥基苯丙三唑、氯化銨、N,N′-二異丙基乙胺合成Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH2，再將Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH2脫除保護基得到六勝肽。

更具體來說，本發明通過如下技術方案實現的。

一種六勝肽的制備方法，所述方法包括如下步驟：

(1)合成Fmoc-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin；

(2)合成Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin；

(3)合成Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin；

(4)合成Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH；以及

(5)將步驟(4)得到產物進行切割、分離和純化得到六勝肽產品。

其中所述步驟(1)是將2-Chlorotrityl Chloride Resin用二氯甲烷溶脹后，加入二氯甲烷、Fmoc-Arg(pbf)-OH、N,N′-二異丙基乙胺進行反應得到Fmoc-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin；

其中所述步驟(2)是將步驟(1)得到的Fmoc-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin脫Fmoc兩次，加入N,N-二甲基甲酰胺、Fmoc-Arg(pbf)-OH、1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺進行反應得到Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin；然后按照所述方法在Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin上依次連接Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH，得到Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin。

其中所述步驟(3)是將步驟(2)得到的Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin脫Fmoc-兩次，加入二氯甲烷、乙酸酐、N,N′-二異丙基乙胺的混合液進行反應得Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin。

所述步驟(1)、步驟(2)和步驟(3)中所述反應是在在氮氣保護下，常溫攪拌0.5-2小時；所述步驟(1)、步驟(2)和步驟(3)中脫Fmoc是用哌啶與N,N-二甲基甲酰胺的體積比為1:4的混合液脫Fmoc；優選步驟(4)中加入二氯甲烷、乙酸酐、N,N′-二異丙基乙胺體積比9:1:0.5的混合液。

其中所述步驟(4)是將Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin中加入切割液進行切割反應經過分離、純化、干燥得到Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH；

其中步驟(4)所述分離、純化、干燥步驟是將切割后的產物過濾，濾液用兩倍飽和食鹽水洗滌3次，然后再加入與切割液等體積的飽和食鹽水，用飽和碳酸氫鈉溶液調pH為7.0，35℃減壓蒸發蒸除有機溶劑并析出沉淀，過濾，沉淀用純水洗滌3次，40～45℃烘干得Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH。

其中所述步驟(5)是將Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH用N,N-二甲基甲酰胺溶解，加入六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷、1-羥基苯丙三唑、氯化銨、N,N′-二異丙基乙胺進行反應得到反應液，進行處理、分離、純化、烘干得Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH2；然后向Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH2中加入切割液進行切割，之后分離得到粗品，經純化、干燥得到產品。

其中所述步驟(5)切割之后經過濾，將濾液加入冷乙醚中，析出沉淀，得到六勝肽粗品，六勝肽粗品經反相色譜純化、冷凍干燥，得Ac-Glu-Glu-Met-Gln-Arg-Arg-NH2產品。

其中所述步驟(4)所述切割液是三氟乙醇與乙酸、二氯甲烷的體積比為2:0.75:7.25的混合液；優選步驟(5)所述切割液是質量百分比組成為三氟乙酸83％、苯酚5％、苯甲硫醚4％、水3％、三異丙基硅烷5％的混合液。

其中步驟(1)中2-chlorotrityl chloride resin與Fmoc-Arg(pbf)-OH、N,N′-二異丙基乙胺的摩爾比為1:1:4。

所述的步驟(2)中，2-chlorotrityl chloride resin與Fmoc-Arg(pbf)-OH、1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺的摩爾比1:2:(2.5～3):(2.5～3):(2.5～3)。

所述的步驟(2)中，Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH與六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷、1-羥基苯丙三唑、氯化銨、N,N′-二異丙基乙胺的摩爾比1:3:3:(3～5):(3～5)。

本發明還提供所述制備方法制備得到的六勝肽產品，其純度高于95％。

更具體來說，本發明提供一種六勝肽的固相片段合成方法，包括下述步驟：

一種六勝肽的合成方法，其特征在于它由下述步驟組成：

(1)合成Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH

①合成Fmoc-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin

將2-Chlorotrityl Chloride Resin用二氯甲烷溶脹15分鐘后，加入二氯甲烷、Fmoc-Arg(pbf)-OH、N,N′-二異丙基乙胺，在氮氣保護下，常溫攪拌1.5小時，得到Fmoc-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin；

②合成Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin

將Fmoc-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin用哌啶與N,N-二甲基甲酰胺的體積比為1:4的混合液脫Fmoc-兩次，加入N,N-二甲基甲酰胺、Fmoc-Ar g(pbf)-OH、1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺，在氮氣保護下，常溫攪拌2小時，得到Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin；

③合成Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chlor otrityl Chloride Resin

按照步驟②的方法向Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resi n上依次連接Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH，得到Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(p bf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin；

④合成Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chlorotr ityl Chloride Resin

將Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chlorotrit yl Chloride Resin用哌啶與N,N-二甲基甲酰胺的體積比為1:4的混合液脫Fm oc-兩次，加入二氯甲烷、乙酸酐、N,N′-二異丙基乙胺體積比9:1:0.5的混合液，在氮氣保護下，常溫攪拌30分鐘，得Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin；

⑤切割處理

向Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin中加入切割液，常溫攪拌1.5小時，過濾，將濾液用飽和食鹽水洗滌3次，然后再加入與切割液等體積的飽和食鹽水，用飽和碳酸氫鈉溶液調PH為7.0，旋轉蒸發儀35℃蒸除有機溶劑并析出沉淀，過濾，沉淀用純水洗滌3次，40～45℃烘干得Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH；

上述的切割液是三氟乙醇與乙酸、二氯甲烷的體積比為2:0.75:7.25的混合液；

(2)合成Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH2

將Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH用N,N-二甲基甲酰胺溶解，加入六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷、1-羥基苯丙三唑、氯化銨、N,N′-二異丙基乙胺，攪拌反應3小時，向反應液加入2倍體積的飽和食鹽水并析出沉淀，過濾，沉淀用純水洗滌3次，40～45℃烘干得Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH2；

(3)合成六勝肽Ac-Glu-Glu-Met-Gln-Arg-Arg-NH2

向Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH2中加入切割液，每克Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH2用切割液3～5mL，室溫攪拌1.5～2.5小時，過濾，將濾液加入冷乙醚中，析出沉淀，得到六勝肽粗品，六勝肽粗品經反相色譜純化、冷凍干燥，得Ac-Glu-Glu-Met-Gln-Arg-Arg-NH2；

上述的切割液是質量百分比組成為三氟乙酸83％、苯酚5％、苯甲硫醚4％、水3％、三異丙基硅烷5％的混合液。

其中，所述的步驟(1)的①中，2-chlorotrityl chloride resin與Fmoc-Arg(pbf)-OH、N,N′-二異丙基乙胺的摩爾比為1:1:4。

其中，所述的步驟(1)的②中，2-chlorotrityl chloride resin與Fmoc-Arg(pbf)-OH、1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺的摩爾比1:2:2.5～3:2.5～3:2.5～3。

其中，所述的步驟(1)的③中，2-chlorotrityl chloride resin與Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH的摩爾比均為1:2，2-chlorotrityl chloride resin與1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺的摩爾比1:2.5～3:2.5～3:2.5～3。

其中，所述的步驟(1)的⑤中，得到Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH的方法是將切割液用2倍體積的飽和食鹽水洗滌3次，然后再加入與切割液等體積的飽和食鹽水，用飽和碳酸氫鈉溶液調PH為7.0，旋轉蒸發儀35℃蒸除有機溶劑并析出沉淀，過濾，沉淀用純水洗滌3次，40～45℃烘干。

其中，所述的步驟(2)中，Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH與六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷、1-羥基苯丙三唑、氯化銨、N,N′-二異丙基乙胺的摩爾比1:3:3:3～5:3～5。

其中，所述的步驟(2)中，得到Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH2的方法是向反應液加入2倍體積的飽和食鹽水并析出沉淀，過濾，沉淀用純水洗滌3次，40～45℃烘干。

本發明有益效果如下：

本發明采用較廉價的2-Chlorotrityl Chloride Resin首先合成了全保護的六勝肽片段Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH，然后將全保護的六勝肽片段羧基端用六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷、1-羥基苯丙三唑、氯化銨、N,N′-二異丙基乙胺在N,N-二甲基甲酰胺溶液中酰胺化得到Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH2，再將Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH2脫保護基得到六勝肽Ac-Glu-Glu-Met-Gln-Arg-Arg-NH₂。

本發明克服了傳統六勝肽固相合成法所使用的Fmoc-AM Resin和Fmoc-MBHA Resin價格昂貴，樹脂取代度較小，造成了六勝肽固相合成成本較高的問題，也克服了六勝肽液相合成法合成過程繁雜，周期長，效率低，純化成本高的問題，為六勝肽規模化生產提供一種工藝方法簡單、生產成本較低、易純化、效率高的合成方法。

本發明方法既克服了現有經典固相合成六勝肽樹脂成本高、載量低的問題，也克服了液相合成六勝肽過程復雜、合成周期長、效率低的缺點，具有合成成本低、合成效率高、合成方法簡單的優點，可用于規模化合成六勝肽。

附圖說明

圖1是實施例1合成的六勝肽的質譜圖。

圖2是實施例1合成的六勝肽的液相色譜圖，其中(a)是液相色譜圖，(b)是處理通道。

具體實施方式

下面結合附圖和實施例對本發明進一步詳細說明，但本發明不限于這些實施例。

下面對說明書中的簡寫進行說明：

2-chlorotrityl chloride Resin，其名稱為2-氯三苯甲基氯樹脂

Fmoc：9-笏亞甲氧羰基

pbf、OtBu、Trt都是保護基，名稱分別是2,2,4,6,7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺酰基、叔丁氧基、三苯甲基。

本發明提供一種六勝肽的制備方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：(1)合成Fmoc-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin；(2)合成Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin；(3)合成Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin；(4)合成Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH；以及(5)將步驟(4)得到產物進行切割、分離和純化得到六勝肽產品。其中所述步驟(1)是將2-Chlorotrityl Chloride Resin用二氯甲烷溶脹后，加入二氯甲烷、Fmoc-Arg(pbf)-OH、N,N′-二異丙基乙胺進行反應得到Fmoc-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin。所述合成方法是發明人創造性勞動的結果，步驟(1)中Fmoc-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin的合成方案可以避免使用高成本的Rink Amide-AM Resin或Rink Amide-MBHA Resin等氨基樹脂的不利因素，有效降低成本；使用的原料是2-chlorotrityl chloride Resin，其價格相對低廉，從而在原料上降低了成本。所述2-chlorotrityl chloride Resin，其名稱為2-氯三苯甲基氯樹脂，本發明使用的是取代度為1.74mmol/g，但其他取代度的2-chlorotrityl chloride Resin也可以達到相同或類似的技術效果，也在本發明的保護范圍內。2-chlorotrityl chloride Resin的取代度可以是現有商品化的所有取代度，本發明使用的取代度1.74mmol/g是從合成片段的產率、純度、樹脂的利用率等因素平衡的最佳取值。

其中所述步驟(2)是將步驟(1)得到的Fmoc-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin脫Fmoc兩次，加入N,N-二甲基甲酰胺、Fmoc-Arg(pbf)-OH、1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺進行反應得到Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin；然后按照所述方法在Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin上依次連接Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH，得到Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin。該步驟是將氨基酸鏈延長的步驟，其中各個氨基酸側鏈保護選擇的保護基可以是與Fmoc有正交保護效果的任意保護基，只要能夠達到所希望的可以保護的技術效果即可，但發明人經過優選上述取代基效果最好。

其中，所述步驟(3)是將步驟(2)得到的Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin脫Fmoc-兩次，加入二氯甲烷、乙酸酐、N,N′-二異丙基乙胺的混合液進行反應得Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin；其中，所述步驟(1)、步驟(2)和步驟(3)中所述反應是在在氮氣保護下，常溫攪拌40分鐘-2小時；所述步驟(1)、步驟(2)和步驟(3)中脫Fmoc是用哌啶與N,N-二甲基甲酰胺的體積比為1:4的混合液脫Fmoc；優選步驟(4)中加入二氯甲烷、乙酸酐、N,N′-二異丙基乙胺體積比9:1:0.5的混合液；其中所述步驟(4)是將Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin中加入切割液進行切割反應經過分離、純化、干燥得到Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH；其中步驟(4)所述分離、純化、干燥步驟是將切割后的產物過濾，濾液用兩倍飽和食鹽水洗滌3次，然后再加入與切割液等體積的飽和食鹽水，用飽和碳酸氫鈉溶液調pH為7.0，35℃減壓蒸發蒸除有機溶劑并析出沉淀，過濾，沉淀用純水洗滌3次，40～45℃烘干得Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH。在制備過程中各個物質之間的比例可以進行適當調節，獲得的產品仍舊能夠滿足要求，因此，對制備過程中的各個物質之間的比例以及反應條件的參數的數值進行適當調整也在本發明的保護范圍內。在一般的固相多肽合成中，如果以樹脂為基準取1，那么氨基酸和其它試劑的使用量都要過量，一般會取1.8-3倍，如出現難反應的步驟加量可能更高，1.8-3倍是一個經濟的加量。

其中所述步驟(5)是將Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH用N,N-二甲基甲酰胺溶解，加入六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷、1-羥基苯丙三唑、氯化銨、N,N′-二異丙基乙胺進行反應得到反應液，進行處理、分離、純化、烘干得Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH2；然后向Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH2中加入切割液進行切割，之后分離得到粗品，經純化、干燥得到產品。

其中，所述步驟(4)所述切割液是三氟乙醇與乙酸、二氯甲烷的體積比為2:0.75:7.25的混合液；優選步驟(5)所述切割液是質量百分比組成為三氟乙酸83％、苯酚5％、苯甲硫醚4％、水3％、三異丙基硅烷5％的混合液。上述各個切割步驟不同，切割的原料不同，因此選擇的切割液不同。

其中，步驟(1)中2-chlorotrityl chloride resin與Fmoc-Arg(pbf)-OH、N,N′-二異丙基乙胺的摩爾比為1:1:4。

其中所述的步驟(2)中，2-chlorotrityl chloride resin與Fmoc-Arg(pbf)-OH、1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺的摩爾比1:2:(2.5～3):(2.5～3):(2.5～3)。所述的步驟(2)中，

Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH與六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷、1-羥基苯丙三唑、氯化銨、N,N′-二異丙基乙胺的摩爾比1:3:3:(3～5):(3～5)。

在制備步驟中控制各個物質之間的配料比在上述范圍內，這是發明人對各個步驟的制備方法配料比經過多個因素的考慮得到的結果，在上述保護范圍內進行上下10％的浮動依然可以達到所述的技術效果。優選技術方案如上。

本發明還提供所述制備方法制備得到的六勝肽產品，其純度高于95％。

在一種具體實施方式中，六勝肽的合成方法包括如下步驟：(1)合成Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH

①合成Fmoc-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin

將2-Chlorotrityl Chloride Resin用二氯甲烷溶脹15分鐘后，抽濾，按2-Chlorotrityl Chloride Resin:Fmoc-Arg(pbf)-OH:N,N′-二異丙基乙胺摩爾比為1:1:4，每克2-Chlorotrityl Chloride Resin加入10mL二氯甲烷為溶劑，在氮氣保護下，常溫攪拌1.5小時，得Fmoc-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chlori de Resin。

②合成Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin

將Fmoc-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin用哌啶與N,N-二甲基甲酰胺的體積比為1:4的混合液脫Fmoc-兩次，按2-Chlorotrityl Chloride Resin、Fmoc-Arg(pbf)-OH、1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺摩爾比為1:2:2.5～3:2.5～3:2.5～3，每克2-Chlorotrityl Chloride Resin加入10mLN,N-二甲基甲酰胺為溶劑，在氮氣保護下，常溫攪拌2小時，得Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chlor ide Resin。

③合成Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-C hlorotrityl Chloride Resin

按照步驟(1)中②的方法向Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chlor ide Resin上依次連接Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH，得到Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin。

④合成Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chl orotrityl Chloride Resin

將Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chlor otrityl Chloride Resin用哌啶與N,N-二甲基甲酰胺的體積比為1:4的混合液脫Fmoc-兩次，按二氯甲烷、乙酸酐、N,N′-二異丙基乙胺體積比為9:1:0.5(v:v:v)配制反應液，每克2-Chlorotrityl Chloride Resin加入10mL反應液，在氮氣保護下，常溫攪拌30分鐘，得Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin。

⑤切割處理

按三氟乙醇、乙酸、二氯甲烷體積比為2:0.75:7.25(v:v:v)配制切割液，每克肽樹脂Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin加入10mL切割液，常溫攪拌1.5小時，過濾，將濾液用2倍體積的飽和食鹽水洗滌3次，然后再加入與切割液等體積的飽和食鹽水，用飽和碳酸氫鈉溶液調PH為7.0，旋轉蒸發儀35℃蒸除有機溶劑并析出沉淀，過濾，沉淀用純水洗滌3次，40～45℃烘干得Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH。

(2)合成Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH2

將每克Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH用10mLN,N-二甲基甲酰胺溶解，按Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷、1-羥基苯丙三唑、氯化銨、N,N′-二異丙基乙胺摩爾比為1:3:3:3～5:3～5加入六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷、1-羥基苯丙三唑、氯化銨、N,N′-二異丙基乙胺，攪拌反應3小時，向反應液加入2倍體積的飽和食鹽水并析出沉淀，過濾，沉淀用純水洗滌3次，40～45℃烘干得Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH2。

(3)合成六勝肽Ac-Glu-Glu-Met-Gln-Arg-Arg-NH2

按三氟乙酸、苯酚、苯甲硫醚、水、三異丙基硅烷的比例為83mL:5g:4mL:3mL:5mL配制切割液，每克Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH2加入3～5mL切割液，室溫攪拌1.5～2.5小時，過濾，將濾液加入5～8倍冷無水乙醚中，析出沉淀，過濾，沉淀用無水乙醚洗3次，真空干燥，得到六勝肽粗品，六勝肽粗品經反相色譜純化、凍干，得Ac-Glu-Glu-Met-Gln-Arg-Arg-NH2。

實施例

下面對實施例中使用的各個物質的來源進行說明，如果沒有特別說明，所使用的原料和儀器均是商購獲得，是本領域常規使用儀器和原料，只要其能滿足實驗需要即可。

本發明的2-chlorotrityl chloride resin的取代度為1.74mmol/g，均由天津南開和成科技有限公司商購獲得。

固相多肽合成反應器為通用的多肽合成反應器，可以購自成都斯諾進出口貿易有限公司的CS936X CSBio Peptide Synthesizer。

分析型高效液相色譜儀為日立全自動L2000。

制備型高效液相色譜儀為創新恒通LC3000，C18分析色譜柱為大連物理化學研究所4.6mm×250mm，C18制備色譜柱為成都科普生物有限公司40.1mm×450mm。

所用各型氨基酸及1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺購自上海吉爾生化有限公司。

LTQ-XL電噴霧電離質譜儀為美國Thermo Finnigan公司。

實驗中使用的各個有機溶劑、有機試劑均為國產AR或CP。

實施例1

本實施例六勝肽的制備方法包括如下步驟：

(1)合成Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH

①合成Fmoc-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin

將50.0g2-Chlorotrityl Chloride Resin加入合成器中，加入500mL二氯甲烷浸泡、溶脹15分鐘后，抽濾，向合成器中加入500mL二氯甲烷、56.45gFmoc-Arg(pbf)-OH、61.0mLN,N′-二異丙基乙胺，2-Chlorotrityl Chloride Resin、Fmoc-Arg(pbf)-OH、N,N′-二異丙基乙胺的摩爾比為1:1:4，在氮氣保護下，常溫攪拌1.5小時，抽濾，用異丙醇和N,N-二甲基甲酰胺各洗滌樹脂2次，每次500mL，得Fmoc-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin。

②合成Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin

向合成器中的Fmoc-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin中加入500mL哌啶與N,N-二甲基甲酰胺的體積比為1:4的混合液反應10分鐘，抽濾除去混合液，再加入500mL哌啶與N,N-二甲基甲酰胺的體積比為1:4的混合液，反應20分鐘，抽濾，用異丙醇和N,N-二甲基甲酰胺各洗滌樹脂2次，每次500mL，完成Fmoc-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin脫Fmoc-兩次，向合成器中加入500mL N,N-二甲基甲酰胺、112.89g Fmoc-Arg(pbf)-OH、35.26g 1-羥基苯丙三唑、83.81g苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、45.6mL N,N′-二異丙基乙胺，在氮氣保護下，常溫攪拌2小時，抽濾，用異丙醇和N,N-二甲基甲酰胺各洗滌樹脂2次，每次500mL，抽濾，得Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin。

③合成Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin

按照步驟(1)中②的方法，向合成器中的Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin上依次連接106.26gFmoc-Gln(Trt)-OH、64.64gFmoc-Met-OH、74.04gFmoc-Glu(OtBu)-OH、74.04gFmoc-Glu(OtBu)-OH，其他試劑的用量為：1-羥基苯丙三唑35.26g、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸83.81g、N,N′-二異丙基乙胺45.6mL，用異丙醇和N,N-二甲基甲酰胺各洗滌樹脂2次，每次500mL，得Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin。

上述的Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH與2-chlorotrityl chloride resin的摩爾比均為2:1，2-chlorotrityl chloride resin與1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺的摩爾比1:2.5～3:2.5～3:2.5～3。

④合成Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin

向合成器中的Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin中加入500mL哌啶與N,N-二甲基甲酰胺的體積比為1:4的混合液反應10分鐘，抽濾除去混合液，再加入500mL哌啶與N,N-二甲基甲酰胺的體積比為1:4的混合液，反應20分鐘，抽濾，用異丙醇和N,N-二甲基甲酰胺各洗滌樹脂2次，每次500mL，完成Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin脫Fmoc-兩次，向合成器中加入450mL二氯甲烷、50mL乙酸酐、25mLN,N′-二異丙基乙胺，在氮氣保護下，常溫攪拌30分鐘，抽濾，用異丙醇和N,N-二甲基甲酰胺各洗滌樹脂2次，每次500mL，抽濾，甲醇洗滌樹脂3次，每次500mL，抽濾，干燥，得Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin。

⑤切割處理

向Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-2-Chlorotrityl Chloride Resin加入500mL切割液，所用的切割液是三氟乙醇、乙酸、二氯甲烷體積比為2:0.75:7.25(v:v:v)的混合液，常溫攪拌1.5小時，過濾，將濾液移入1000mL分液漏斗中，用1000mL飽和食鹽水洗滌3次，再將濾液移入2000mL茄型瓶中，加入500mL飽和食鹽水，用飽和碳酸氫鈉溶液調PH為7.0，旋轉蒸發儀35℃蒸除有機溶劑并析出沉淀，用4號砂芯漏斗抽濾，沉淀用純水洗滌3次，40～45℃烘干，得120.16gAc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH，收率78.94％。

(2)合成Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH₂

將120.16g(68.68mmol)Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH加入5L燒杯中，加入1200mLN,N-二甲基甲酰胺、107.22g六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷、27.84g1-羥基苯丙三唑、18.37g氯化銨、59.8mLN,N′-二異丙基乙胺，攪拌反應3小時，向反應液加入2400mL飽和食鹽水并析出沉淀，用4號砂芯漏斗抽濾，沉淀用純水洗滌3次，40～45℃烘干,得113.11gAc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH2，收率94.13％。

(3)合成六勝肽Ac-Glu-Glu-Met-Gln-Arg-Arg-NH₂

向113.11gAc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH₂中加入300mL切割液，所用的切割液是三氟乙酸、苯酚、苯甲硫醚、水、三異丙基硅烷比例為83mL:5g:4mL:3mL:5mL混合溶液，室溫攪拌2小時，用3號砂芯漏斗抽濾，將濾液加入2400mL冷無水乙醚中，析出沉淀，用4號砂芯漏斗抽濾，沉淀用無水乙醚洗3次，真空干燥，得到六勝肽粗品，六勝肽粗品經反相色譜純化、凍干，得63.35g六勝肽，收率81.79％。

采用質譜儀對合成產物的結構進行表征，結果見圖1，由圖可見，所合成的產物的分子量及分子離子峰與六勝肽的分子量及分子離子峰一致，說明合成產物為六勝肽。采用液相色譜儀對合成的六勝肽進行純度測定，液相色譜圖見圖2(a)，結合圖2(b)可見，六勝肽的純度大于95％。

實施例2

本實施的步驟(1)中，Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH與2-Chlorotrityl Chloride Resin的摩爾比均為2:1，2-Chlorotrityl Chloride Resin與1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺的摩爾比為1:2.5:2.5:2.5，該步驟的其他步驟與實施例(1)相同。本實施例的步驟(2)中，Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷、1-羥基苯丙三唑、氯化銨、N,N′-二異丙基乙胺摩爾比為1:3:3:3:3，該步驟的其他步驟與實施例(1)相同。本實施的步驟(3)與實施例(1)相同，得62.51g六勝肽，收率80.71％。采用實施例1相同的條件對產品采用質譜儀對合成產物的結構進行表征，所合成的產物的分子量及分子離子峰與六勝肽的分子量及分子離子峰一致。采用液相色譜儀對合成的六勝肽進行純度測定，純度大于95％。

實施例3

本實施的步驟(1)與實施例(1)相同。本實施例的步驟(2)中，Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷、1-羥基苯丙三唑、氯化銨、N,N′-二異丙基乙胺摩爾比為1:3:3:4:4，該步驟的其他步驟與實施例(1)相同。本實施的步驟(3)與實施例(1)相同，得62.78g六勝肽，收率81.06％。采用實施例1相同的條件對產品采用質譜儀對合成產物的結構進行表征，所合成的產物的分子量及分子離子峰與六勝肽的分子量及分子離子峰一致。采用液相色譜儀對合成的六勝肽進行純度測定，純度大于95％。