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一種片段法固液結合制備替度魯肽的方法與流程

文檔序號:12399363閱讀:785來源:國知局

本發明涉及多肽合成領域,特別涉及一種以片段法固液結合制備替度魯肽的方法。



背景技術:

替度魯肽,英文名稱為Teduglutide,由33個天然氨基酸組成,可減少胃排空和分泌,并調節小腸內膜細胞的生長、增殖和修復,是一種天然生成的激素,在臨床上用于治療成人短腸綜合征,其肽序為:H-His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-OH。

目前,替度魯肽的制備方法有以下報道;專利CN104072603A先合成替度魯肽2-33位氨基酸片段,而后采用特殊保護基保護的His進行1位偶聯,該方法減少了1位His的消旋雜質生成,但與逐個氨基酸偶聯的方法無異,固相合成步數多,溶劑用量大,三廢嚴重;專利CN104418949A公開的替度魯肽合成方法是將肽序分為兩段,先合成1-3位和4-33位氨基酸片段,而后再偶聯而成,該方法降低了合成過程中3-Asu雜質的生成,但并未解決長肽鏈合成后期偶聯困難,粗肽純度不高,工藝雜質繁多的問題;專利CN104072605A采取了片段法進行替度魯肽合成,先將肽鏈分為三個片段,再將三個片段偶聯得替度魯肽,粗肽純度有較大的改善,但片段法成本太大,且片段純化費時費力,工業規模生產時成本不可控,且該專利在進行片段法合成時,并未針對性的控制特殊雜質,例如1-His消旋,3-Asu雜質。

替度魯肽是由33個氨基酸組成的多肽,從固相合成的角度而言,肽鏈較長,隨著肽鏈的延伸偶聯反應會較為困難,容易產生較多工藝雜質而不利于后期純化。目前存在的替度魯肽固相合成方法主要分為兩類,其一為針對性控制重點雜質,但忽視了長肽鏈偶聯困難,粗肽純度不高,工藝雜質繁多,溶劑用量巨大的問題;其二為著重解決長鏈偶聯困難而采用片段法合成,但并未對重點雜質進行針對性控制,導致后期純化困難,總體收率不高。



技術實現要素:

為解決替度魯肽合成中存在的以上缺陷,本發明提供了一種片段法固液結合制備替度魯肽的新方法。具體技術方案如下:

一種片段法固液結合制備替度魯肽的方法,包括如下步驟:

(a)液相條件下合成所需短肽片段:Fmoc-His(Trt)-Gly-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-OH,Fmoc-Ser(tBu)-Phe-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-Met-OH,Fmoc-Thr(tBu)-Ile-Leu-OH,Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-Ile-OH,Fmoc-Trp(Boc)-Leu-Ile-OH,Fmoc-Lys(Boc)-Ile-OH;

(b)以Wang Resin或CTC樹脂為固相載體,在偶聯劑存在下,依次與Fmoc-Asp(OtBu)-OH,Fmoc-Thr(tBu)-OH,Fmoc-Lys(Boc)-Ile-OH,Fmoc-Thr(tBu)-OH,Fmoc-Gln(Trt)-OH,Fmoc-Trp(Boc)-Leu-Ile-OH,Fmoc-Asn(Trt)-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-Ile-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-OH,Fmoc-Thr(tBu)-Ile-Leu-OH,Fmoc-Asn(Trt)-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-Met-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Ser(tBu)-Phe-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-OH,Fmoc-His(Trt)-Gly-OH,

得側鏈保護的替度魯肽肽樹脂,其結構如下:

Fmoc-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ile-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-Arg(Pbf)-Asp(OtBu)-Phe-Ile-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Gln(OtBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Resin;

(c)替度魯肽肽樹脂經過裂解,純化,凍干得到替度魯肽精肽。

其中步驟(a)中,

Fmoc-His(Trt)-Gly-OH的制備方法為:首先將Fmoc-His(Trt)-OH和HOSu在DCC條件下生成Fmoc-His(Trt)-OSu,然后將生成的Fmoc-His(Trt)-OSu和H-Gly-OH在堿A條件下生成Fmoc-His(Trt)-Gly-OH;

Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-OH的制備方法為:首先將Fmoc-Asp(OtBu)-OH和HOSu在DCC條件下生成Fmoc-Asp(OtBu)-OSu,然后將生成的Fmoc-Asp(OtBu)-OSu和H-Gly-OH在堿A條件下生成Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-OH;

Fmoc-Ser(tBu)-Phe-OH的制備方法為:首先將Fmoc-Ser(tBu)-OH和HOSu在DCC條件下生成Fmoc-Ser(tBu)-OSu,然后將生成的Fmoc-Ser(tBu)-OSu和H-Phe-OH在堿A條件下生成Fmoc-Ser(tBu)-Phe-OH;

Fmoc-Glu(OtBu)-Met-OH的制備方法為:首先將Fmoc-Glu(OtBu)-OH和HOSu在DCC條件下生成Fmoc-Glu(OtBu)-OSu,然后將生成的Fmoc-Glu(OtBu)-OSu和H-Met-OH在堿A條件下生成Fmoc-Glu(OtBu)-Met-OH;

Fmoc-Thr(tBu)-Ile-Leu-OH的制備方法為:首先將Fmoc-Thr(tBu)-OH和HOSu在DCC條件下生成Fmoc-Thr(tBu)-OSu,然后將生成的Fmoc-Thr(tBu)-OSu和H-Ile-OH在堿A條件下生成Fmoc-Thr(tBu)-Ile-OH,Fmoc-Thr(tBu)-Ile-OH和HOSu在DCC條件下生成Fmoc-Thr(tBu)-Ile-OSu,最后將生成的Fmoc-Thr(tBu)-Ile-OSu和H-Leu-OH在堿A條件下生成Fmoc-Thr(tBu)-Ile-Leu-OH;

Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-OH的制備方法為:首先將Fmoc-Asn(Trt)-OH和HOSu在DCC條件下生成Fmoc-Asn(Trt)-OSu,然后將生成的Fmoc-Asn(Trt)-OSu和H-Leu-OH在堿A條件下生成Fmoc-Asn(Trt)-Leu-OH,Fmoc-Asn(Trt)-Leu-OH和HOSu在DCC條件下生成Fmoc-Asn(Trt)-Leu-OSu,將生成的Fmoc-Asn(Trt)-Leu-OSu和H-Ala-OH在堿A條件下生成Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-OH,Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-OH和HOSu在DCC條件下生成Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-OSu,將生成的Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-OSu和H-Ala-OH在堿A條件下生成Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-OH;

Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-Ile-OH的制備方法為:首先將Fmoc-Asp(OtBu)-OH和HOSu在DCC條件下生成Fmoc-Asp(OtBu)-OSu,然后將生成的Fmoc-Asp(OtBu)-OSu和H-Phe-OH在堿A條件下生成Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-OH和HOSu在DCC條件下生成Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-OSu,然后將生成的Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-OSu和H-Ile-OH在堿A條件下生成Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-Ile-OH;

Fmoc-Trp(Boc)-Leu-Ile-OH的制備方法為:首先將Fmoc-Trp(Boc)-OH和HOSu在DCC條件下生成Fmoc-Trp(Boc)-OSu,然后將生成的Fmoc-Trp(Boc)-OSu和H-Leu-OH在堿A條件下生成Fmoc-Trp(Boc)-Leu-OH,Fmoc-Trp(Boc)-Leu-OH和HOSu在DCC條件下生成Fmoc-Trp(Boc)-Leu-OSu,最后將生成的Fmoc-Trp(Boc)-Leu-OSu和H-Ile-OH在堿A條件下生成Fmoc-Trp(Boc)-Leu-Ile-OH;

Fmoc-Lys(Boc)-Ile-OH的制備方法為:首先將Fmoc-Lys(Boc)-OH和HOSu在DCC條件下生成Fmoc-Lys(Boc)-OSu,然后將生成的Fmoc-Lys(Boc)-OSu和H-Ile-OH在堿A條件下生成Fmoc-Lys(Boc)-Ile-OH。

優選的,步驟(a)中二肽片段Fmoc-His(Trt)-Gly-OH的具體制備方法為:

步驟1)首先制備Fmoc-His(Trt)-OSu:將Fmoc-His(Trt)-OH和HOSu按照1:1.0-1.2的物質量比例溶于有機溶劑B中,冰水浴下將1.0-1.2倍物質量的DCC/有機溶劑B(以Fmoc-His(Trt)-OH的量計)溶液滴加到Fmoc-His(Trt)-OH/HOSu溶液中,1h內滴加完畢,撤冰浴,25℃繼續攪拌反應2h;反應完成后抽濾,濾液濃縮,減壓蒸去80%的有機溶劑,剩余油狀物加入石油醚,直至上層溶液不再變白為止,析出白色固體,抽濾,干燥,得Fmoc-His(Trt)-OSu。

步驟2)制備二肽片段Fmoc-His(Trt)-Gly-OH:將H-Gly-OH和堿A按照摩爾比1:1~2的比例溶解在水中,加入5~20%體積的有機溶劑B助溶,完全溶解后,冰浴攪拌下將步驟1)中制備Fmoc-His(Trt)-OSu的有機溶劑B溶液滴加到H-Gly-OH的溶液中,其中H-Gly-OH的摩爾量為Fmoc-His(Trt)-OSu的1.2~1.5倍;TLC監測反應終點,待反應結束后減壓蒸餾除去有機溶劑B,再以10%的檸檬酸/水將反應液pH值調至2~3,乙酸乙酯萃取,析晶得Fmoc-His(Trt)-Gly-OH。

其中以上步驟中堿A為碳酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸氫鉀、碳酸鉀中的一種;有機溶劑B為四氫呋喃、二氧六環、丙酮、乙腈中的一種或幾種。

優選的,步驟(a)中三肽片段Fmoc-Thr(tBu)-Ile-Leu-OH制備方法為:

步驟1)首先制備Fmoc-Thr(tBu)-OSu:將Fmoc-Thr(tBu)-OH和HOSu按照1:1.0-1.2的物質量比例溶于有機溶劑B中,冰水浴下將1.0-1.2倍物質量的DCC/有機溶劑B(以Fmoc-Thr(tBu)-OH的量計)溶液滴加到Fmoc-Thr(tBu)-OH/HOSu溶液中,1h內滴加完畢,撤冰浴,25℃繼續攪拌反應2h;反應完成后抽濾,濾液濃縮,減壓蒸去80%的有機溶劑,剩余油狀物加入石油醚,直至上層溶液不再變白為止,析出白色固體,抽濾,干燥,得Fmoc-Thr(tBu)-OSu;

步驟2)然后制備Fmoc-Thr(tBu)-Ile-OH:將H-Ile-OH和堿A按照摩爾比1:1~2的比例溶解在水中,加入5~20%體積的有機溶劑B助溶,完全溶解后,冰浴攪拌下將步驟1)中制備的Fmoc-Thr(tBu)-OSu有機溶劑B溶液滴加入至H-Ile-OH溶液中,其中,H-Ile-OH的摩爾量為Fmoc-Thr(tBu)-OSu摩爾量的1.2~1.5倍,TLC監測反應終點,待反應結束,減壓蒸發去掉有機溶劑B后,再以10%的檸檬酸/水將反應液pH值調至2~3,乙酸乙酯萃取,析晶得Fmoc-Thr(tBu)-Ile-OH;

步驟3)Fmoc-Thr(tBu)-Ile-OSu的制備方法為:將步驟2)中的Fmoc-Thr(tBu)-Ile-OH和HOSu按照1:1.0-1.2的物質量比例溶于有機溶劑B中,冰水浴下將1.0-1.2倍物質量的DCC/有機溶劑B(以Fmoc-Thr(tBu)-OH的量計)溶液滴加到Fmoc-Thr(tBu)-Ile-OH/HOSu溶液中,1h內滴加完畢,撤冰浴,25℃繼續攪拌反應2h;反應完成后抽濾,濾液濃縮,減壓蒸去60%的有機溶劑,剩余油狀物加入石油醚,直至上層溶液不再變白為止,析出白色固體,抽濾,干燥,得Fmoc-Thr(tBu)-Ile-OSu;

步驟4)三肽片段Fmoc-Thr(tBu)-Ile-Leu-OH制備方法為:

將H-Leu-OH和堿A按照摩爾比1:1~2的比例溶解在水中,加入5~20%體積的有機溶劑B助溶;完全溶解后,冰浴攪拌下將步驟3)中制備的Fmoc-Thr(tBu)-Ile-OSu的有機溶劑B溶液滴加入H-Leu-OH溶液中,其中,H-Leu-OH的摩爾量為Fmoc-Thr(tBu)-Ile-OSu摩爾量的1.2~1.5;TLC監測反應終點,待反應結束減壓蒸餾除去有機溶劑B后,再以10%的檸檬酸/水將反應液pH值調至2~3,乙酸乙酯萃取,析晶得Fmoc-Thr(tBu)-Ile-Leu-OH。

其中以上步驟中堿A為碳酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸氫鉀、碳酸鉀中的一種。有機溶劑B為四氫呋喃、二氧六環、丙酮、乙腈中的一種或幾種。

優選的,步驟(a)中四肽片段Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-OH制備方法為,

步驟1)制備Fmoc-Asn(Trt)-OSu:將Fmoc-Asn(Trt)-OH和HOSu按照1:1.0-1.2的物質量比例溶于有機溶劑B中,冰水浴下將1.0-1.2倍物質量的DCC/有機溶劑B(以Fmoc-Asn(Trt)-OH的量計)溶液滴加到Fmoc-Asn(Trt)-OH/HOSu溶液中,1h內滴加完畢,撤冰浴,25℃繼續攪拌反應2h;反應完成后抽濾,濾液濃縮,減壓蒸去80%的有機溶劑,剩余油狀物加入石油醚,直至上層溶液不再變白為止,析出白色固體,抽濾,干燥,得Fmoc-Asn(Trt)-OSu;

步驟2)制備Fmoc-Asn(Trt)-Leu-OH:將H-Leu-OH和堿A按照摩爾比1:1~2的比例溶解在水中,加入5~20%體積的有機溶劑B助溶。完全溶解后,冰浴攪拌下將步驟1)中的Fmoc-Asn(Trt)-OSu的有機溶劑B溶液滴加入至H-Leu-OH溶液中,其中,H-Leu-OH的摩爾量為Fmoc-Asn(Trt)-OSu摩爾量的1.2~1.5倍;TLC監測反應終點,待反應結束,減壓蒸發去掉有機溶劑B后,再以10%的檸檬酸/水將反應液pH值調至2~3,乙酸乙酯萃取,析晶得Fmoc-Asn(Trt)-Leu-OH;

步驟3)制備Fmoc-Asn(Trt)-Leu-OSu:將步驟2)中的Fmoc-Asn(Trt)-Leu-OH和HOSu按照1:1.0-1.2的物質量比例溶于有機溶劑B中,冰水浴下將1.0-1.2倍物質量的DCC/有機溶劑B(以Fmoc-Asn(Trt)-Leu-OH的量計)溶液滴加到Fmoc-Asn(Trt)-Leu-OH/HOSu溶液中,1h內滴加完畢,撤冰浴,25℃繼續攪拌反應2h;反應完成后抽濾,濾液濃縮,減壓蒸去80%的有機溶劑,剩余油狀物加入石油醚,直至上層溶液不再變白為止,析出白色固體,抽濾,干燥,得Fmoc-Asn(Trt)-Leu-OSu;

步驟4)制備Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-OH:將H-Ala-OH和堿A按照摩爾比1:1~2的比例溶解在水中,加入5~20%體積的有機溶劑B助溶。完全溶解后,冰浴攪拌下將步驟3)中的Fmoc-Asn(Trt)-Leu-OSu的有機溶劑B溶液滴加入至H-Ala-OH溶液中,其中,H-Ala-OH的摩爾量為Fmoc-Asn(Trt)-Leu-OSu摩爾量的1.2~1.5倍;TLC監測反應終點,待反應結束,減壓蒸發去掉有機溶劑B后,再以10%的檸檬酸/水將反應液pH值調至2~3,乙酸乙酯萃取,析晶得Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-OH;

步驟5)制備Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-OSu:將步驟4)中的Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-OH和HOSu按照1:1.0-1.2的物質量比例溶于有機溶劑B中,冰水浴下將1.0-1.2倍物質量的DCC/有機溶劑B(以Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-OH的量計)溶液滴加到Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-OH/HOSu溶液中,1h內滴加完畢,撤冰浴,25℃繼續攪拌反應2h。反應完成后抽濾,濾液濃縮,減壓蒸去60%的有機溶劑,剩余油狀物加入石油醚,直至上層溶液不再變白為止,析出白色固體,抽濾,干燥,得Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-OSu;

步驟6)四肽片段Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-OH的制備:將H-Ala-OH和堿A按照摩爾比1:1~2的比例溶解在水中,加入5~20%體積的有機溶劑B助溶;完全溶解后,冰浴攪拌下將步驟5)中的Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-OSu的有機溶劑B溶液滴加入H-Ala-OH溶液中,其中,H-Ala-OH的摩爾量為Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-OSu摩爾量的1.2~1.5倍。TLC監測反應終點,待反應結束減壓蒸餾除去有機溶劑B后,再以10%的檸檬酸/水將反應液pH值調至2~3,乙酸乙酯萃取,析晶得Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-OH。

其中以上步驟中堿A為碳酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸氫鉀、碳酸鉀中的一種。有機溶劑B為四氫呋喃、二氧六環、丙酮、乙腈中的一種或幾種。

其中步驟(b)中,以Fmoc-Lys(Boc)-Ile-OH投料偶聯30~31位,以Fmoc-Trp(Boc)-Leu-Ile-OH投料偶聯25~27,以Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-Ile-OH投料偶聯21~23位,以Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-OH投料偶聯16~19位,以Fmoc-Thr(tBu)-Ile-Leu-OH投料偶聯12~14位,以Fmoc-Glu(OtBu)-Met-OH投料偶聯9~10位,以Fmoc-Ser(tBu)-Phe-OH投料偶聯5~6位,以Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-OH投料偶聯3~4位,以Fmoc-His(Trt)-Gly-OH投料偶聯1~2位。

步驟(b)中,Fmoc-Lys(Boc)-Ile-OH,Fmoc-Trp(Boc)-Leu-Ile-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-Ile-OH,Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-OH,Fmoc-Thr(tBu)-Ile-Leu-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-Met-OH,Fmoc-Ser(tBu)-Phe-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-OH,Fmoc-His(Trt)-Gly-OH的摩爾投料比為樹脂的3~5倍,其余單個氨基酸的摩爾投料比為樹脂的2~3倍。

步驟(b)中的Wang Resin或CTC Resin初始替代度為0.3~0.5mmol/g,改造后樹脂替代度為0.25~0.45mmol/g,改造后樹脂優選替代度為0.30~0.35mmol/g;步驟(b)中偶聯劑為HOBt/DIC,HOAt/DIC,HOBt/HBTU/DIEA,HOAt/HATU/DIEA,PyBOP/DIEA,TBTU/DIEA中的一種或幾種;步驟(c)中的裂解試劑為加入體積比1-5%清除劑的TFA溶液,所述清除劑為苯甲醚、苯甲硫醚、乙二硫醇、苯酚、水中的一種或幾種。

相對于現有技術,本發明的有益效果是:

1、本申請將替度魯肽中所有不帶功能側鏈的氨基酸Ile,Leu,Ala,Phe,Met,Gly做成二肽,三肽,及四肽片段,將固相合成步數由33步降低為19步,使31位,27位,26位,23位,22位,19位,18位,17位,14位,13位,10位,6位,4位,2位這些位點的固相偶聯效率達到了百分之百,提高了目標肽純度,粗肽純度達到70%以上,同時避免了這些位點缺失肽的形成,降低了工藝雜質的個數,提升了后期純化的效率,最終收率達到45.08%。

2、1位2位以Fmoc-His(OH)-Gly-OH的方式進行投料,從原料角度上杜絕了1位His的消旋雜質的產生;3位4位以Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-OH的方式投料,同樣從原料角度上避免了引入3-Asu雜質。

3、固相偶聯步數由33步縮短至19步,大大降低固相合成中溶劑的用量,降低了物料成本,減少了三廢排放。

4、選取Ile,Leu,Ala,Phe,Met,Gly這些不含側鏈功能基團的氨基酸進行短肽片段的合成,結合成熟的HOSu/DCC偶聯方法,可大大降低片段液相合成的成本,能夠應用于工業大規模生產。

說明書和權利要求書中所使用的縮寫含義如下:

Fmoc 9-芴甲氧羰基

CTC樹脂 2-氯三苯甲基氯樹脂

Wang Resin 王樹脂

tBu 叔丁基

Trt 三苯甲基

DCM 二氯甲烷

DMF N,N-二甲基甲酰胺

DMAP 4-二甲氨基吡啶

DIEA N,N-二異丙基乙胺

DIC N,N-二異丙基碳二亞胺

HBTU 苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸鹽

HATU 2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯

TBTU O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸

HOBT 1-羥基苯并三唑

HOAT 1-羥基-7-偶氮苯并三氮唑

TFA 三氟乙酸

HOSu N-羥基琥珀酰亞胺

EA 乙酸乙酯

THF 四氫呋喃

PE 石油醚

DCC 二環己基碳二亞胺

具體實施方式

下面用具體實施例對本發明進行詳細說明,但不限定本專利;根據本發明改變原料的投料比,或是反應溶劑或及縮合劑等,均在本發明的保護范圍內。

實施例1:Fmoc-His(Trt)-OSu的制備

準確稱取Fmoc-His(Trt)-OH 1239.4g(2mol)和HOSu 230g(2mol)溶于4000ml四氫呋喃中,冰水浴攪拌。準確稱取DCC 412.8g(2mol),溶于2400ml四氫呋喃中,緩慢滴加到上述溶液中,冰浴攪拌1h后25度繼續反應2h。反應完成后抽濾,濾液旋蒸濃縮至2000~2500ml。濃縮完成后抽濾,濾液加入8000ml石油醚,析出大量白色固體,溶液-20度冰箱靜置1h。靜置后抽濾,濾餅以2000ml乙酸乙酯溶解,加入6000ml石油醚,溶液澄清。置于-20度冰箱中,2h后析出大量白色固體,抽濾,濾餅干燥,稱重,得Fmoc-His(Trt)-OSu 1340.4g,收率93.5%。

實施例2:Fmoc-His(Trt)-Gly-OH的制備

準確稱取H-Gly-OH 202.7g(2.7mol)和碳酸鈉343.4g(3.24mol)溶于4000mL水中,冰浴下(2~8℃)緩慢加入實施例1中制備的Fmoc-His(Trt)-OSu(1290.2g,1.8mol)的四氫呋喃溶液3000ml,攪拌反應,TLC監測反應終點。反應完全后,減壓旋蒸除去四氫呋喃,剩余水溶液抽濾后冰水浴下加入10%的檸檬酸水溶液調溶液pH值至2~3,8000ml乙酸乙酯分三次萃取,合并有機相,以3000ml飽和食鹽水分三次洗滌,無水硫酸鈉干燥,旋蒸抽去乙酸乙酯,剩余油狀物加入2000ml甲醇,溶液澄清透明,置于-20℃冰箱中靜置過夜,析出大量白色固體,抽濾,干燥得Fmoc-His(Trt)-Gly-OH 916.1g,收率75.2%。

實施例3:Fmoc-Asp(OtBu)-OSu的制備

準確稱取Fmoc-Asp(OtBu)-OH 822.3g(2mol)和HOSu 230g(2mol)溶于4000ml乙睛中,冰水浴攪拌。準確稱取DCC 412.8g(2mol),溶于2400ml乙睛中,緩慢滴加到上述溶液中,冰浴攪拌1h后25度繼續反應2h。反應完成后抽濾,濾液旋蒸濃縮至2000~2500ml。濃縮完成后抽濾,濾液加入8000ml石油醚,析出大量白色固體,溶液-20度冰箱靜置1h。靜置后抽濾,濾餅以2000ml乙酸乙酯溶解,加入6000ml石油醚,溶液澄清。置于-20度冰箱中,2h后析出大量白色固體,抽濾,濾餅干燥,稱重,得Fmoc-Asp(OtBu)-OSu937.8g,收率92.3%。

實施例4:Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-OH的制備

準確稱取H-Gly-OH 202.7g(2.7mol)和碳酸鉀447.7g(3.24mol)溶于4000mL水中,冰浴下(2~8℃)緩慢加入實施例3中制備的Fmoc-Asp(OtBu)-OSu(914.42g,1.8mol)的乙睛溶液3000ml,攪拌反應,TLC監測反應終點。反應完全后,減壓旋蒸除去乙睛,剩余水溶液抽濾后冰水浴下加入10%的檸檬酸水溶液調溶液pH值至2~3,8000ml乙酸乙酯分三次萃取,合并有機相,以3000ml飽和食鹽水分三次洗滌,無水硫酸鈉干燥,旋蒸抽去乙酸乙酯,剩余油狀物加入2000ml甲醇,溶液澄清透明,置于-20℃冰箱中靜置過夜,析出大量白色固體,抽濾,干燥得Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-OH 686.6g,收率81.5%。

實施例5:Fmoc-Ser(tBu)-OSu的制備

準確稱取Fmoc-Ser(tBu)-OH 766.9g(2mol)和HOSu 230g(2mol)溶于4000ml二氧六環中,冰水浴攪拌。準確稱取DCC 412.8g(2mol),溶于2400ml二氧六環中,緩慢滴加到上述溶液中,冰浴攪拌1h后25度繼續反應2h。反應完成后抽濾,濾液旋蒸濃縮至2000~2500ml。濃縮完成后抽濾,濾液加入8000ml石油醚,析出大量白色固體,溶液-20度冰箱靜置1h。靜置后抽濾,濾餅以2000ml乙酸乙酯溶解,加入6000ml石油醚,溶液澄清。置于-20度冰箱中,2h后析出大量白色固體,抽濾,濾餅干燥,稱重,得Fmoc-Ser(tBu)-OSu884.2g,收率92.1%。

實施例6:Fmoc-Ser(tBu)-Phe-OH的制備

準確稱取H-Phe-OH 483.3g(2.7mol)和碳酸氫鈉272.16g(3.24mol)溶于4000mL水中,冰浴下(2~8℃)緩慢加入實施例5中制備的Fmoc-Ser(tBu)-OSu(864.9g,1.8mol)的二氧六環溶液3000ml,攪拌反應,TLC監測反應終點。反應完全后,減壓旋蒸除去二氧六環,剩余水溶液抽濾后冰水浴下加入10%的檸檬酸水溶液調溶液pH值至2~3,8000ml乙酸乙酯分三次萃取,合并有機相,以3000ml飽和食鹽水分三次洗滌,無水硫酸鈉干燥,旋蒸濃縮至3000ml,加入石油醚4000ml析晶,得Fmoc-Ser(tBu)-Phe-OH 838.2g,收率85.6%。

實施例7:Fmoc-Glu(OtBu)-OSu的制備

準確稱取Fmoc-Glu(OtBu)-OH 850.9g(2mol)和HOSu 230g(2mol)溶于4000ml二氧六環中,冰水浴攪拌。準確稱取DCC 412.8g(2mol),溶于2400ml二氧六環中,緩慢滴加到上述溶液中,冰浴攪拌1h后25度繼續反應2h。反應完成后抽濾,濾液旋蒸濃縮至2000~2500ml。濃縮完成后抽濾,濾液加入8000ml石油醚,析出大量白色固體,溶液-20度冰箱靜置1h。靜置后抽濾,濾餅以2000ml乙酸乙酯溶解,加入6000ml石油醚,溶液澄清。置于-20度冰箱中,2h后析出大量白色固體,抽濾,濾餅干燥,稱重,得Fmoc-Glu(OtBu)-OSu 941.7g,收率90.2%。

實施例8:Fmoc-Glu(OtBu)-Met-OH的制備

準確稱取H-Met-OH 402.3g(2.7mol)和碳酸氫鉀324.5g(3.24mol)溶于4000mL水中,冰浴下(2~8℃)緩慢加入實施例7中制備的Fmoc-Glu(OtBu)-OSu(940.6g,1.8mol)的二氧六環溶液3000ml,攪拌反應,TLC監測反應終點。反應完全后,減壓旋蒸除去二氧六環,剩余水溶液抽濾后冰水浴下加入10%的檸檬酸水溶液調溶液pH值至2~3,8000ml乙酸乙酯分三次萃取,合并有機相,以3000ml飽和食鹽水分三次洗滌,無水硫酸鈉干燥,旋蒸濃縮至4000ml,加入石油醚4000ml析晶,得Fmoc-Glu(OtBu)-Met-OH 832.6g,收率83.2%。

實施例9:Fmoc-Thr(tBu)-OSu的制備

準確稱取Fmoc-Thr(tBu)-OH 794.6g(2mol)和HOSu 230g(2mol)溶于4000ml丙酮中,冰水浴攪拌。準確稱取DCC 412.8g(2mol),溶于2400ml丙酮中,緩慢滴加到上述溶液中,冰浴攪拌1h后25度繼續反應2h。反應完成后抽濾,濾液旋蒸濃縮至2000~2500ml。濃縮完成后抽濾,濾液加入8000ml石油醚,析出大量白色固體,溶液-20度冰箱靜置1h。靜置后抽濾,濾餅以2000ml乙酸乙酯溶解,加入6000ml石油醚,溶液澄清。置于-20度冰箱中,2h后析出大量白色固體,抽濾,濾餅干燥,稱重,得Fmoc-Thr(tBu)-OSu910.9g,收率92.2%。

實施例10:Fmoc-Thr(tBu)-Ile-OH的制備

準確稱取H-Ile-OH 354.2g(2.7mol)和碳酸鈉343.4g(3.24mol)溶于4000mL水中,冰浴下(2~8℃)緩慢加入實施例9中制備的Fmoc-Thr(tBu)-OSu(1248.7g,1.8mol)的丙酮溶液3000ml,攪拌反應,TLC監測反應終點。反應完全后,減壓旋蒸除去丙酮,剩余水溶液抽濾后冰水浴下加入10%的檸檬酸水溶液調溶液pH值至2~3,8000ml乙酸乙酯分三次萃取,合并有機相,以3000ml飽和食鹽水分三次洗滌,無水硫酸鈉干燥,旋蒸除去乙酸乙酯,剩余油狀物加入2000ml甲醇復溶,溶液澄清透明,置于-20℃冰箱中析晶,得Fmoc-Thr(tBu)-Ile-OH 773.8g,收率84.3%。

實施例11:Fmoc-Thr(tBu)-Ile-OSu的制備

準確稱取實施例10中制備的Fmoc-Thr(tBu)-Ile-OH 765.2g(1.5mol)和HOSu 172.5g(1.5mol)溶于4000ml丙酮中,冰水浴攪拌。準確稱取DCC 309.6g(1.5mol),溶于2400ml丙酮中,緩慢滴加到上述溶液中,冰浴攪拌1h后25度繼續反應2h。反應完成后抽濾,濾液旋蒸濃縮至3000~3500ml。濃縮完成后抽濾,濾液加入8000ml石油醚,析出大量白色固體,溶液-20度冰箱靜置1h。靜置后抽濾,濾餅以2000ml乙酸乙酯溶解,加入6000ml石油醚,溶液澄清。置于-20度冰箱中,2h后析出大量白色固體,抽濾,濾餅干燥,稱重,得Fmoc-Thr(tBu)-Ile-OSu 812.2g,收率89.2%。

實施例12:Fmoc-Thr(tBu)-Ile-Leu-OH的制備

準確稱取H-Leu-OH 235.8g(1.8mol)和碳酸鈉228.9g(2.16mol)溶于2000mL水中,冰浴下(2~8℃)緩慢加入實施例11中制備的Fmoc-Thr(tBu)-Ile-OSu(728.4g,1.2mol)的丙酮溶液3000ml,攪拌反應,TLC監測反應終點。反應完全后,減壓旋蒸除去丙酮,剩余水溶液抽濾后冰水浴下加入10%的檸檬酸水溶液調溶液pH值至2~3,8000ml乙酸乙酯分三次萃取,合并有機相,以3000ml飽和食鹽水分三次洗滌,無水硫酸鈉干燥,旋蒸除去乙酸乙酯,加入3500ml甲醇,加熱至40℃溶液澄清透明,置于-20℃析晶,得Fmoc-Thr(tBu)-Ile-Leu-OH 607.1g,收率81.2%。

實施例13:Fmoc-Asn(Trt)-OSu的制備

準確稱取Fmoc-Asn(Trt)-OH 1193.4g(2mol)和HOSu 230g(2mol)溶于4000ml四氫呋喃中,冰水浴攪拌。準確稱取DCC 412.8g(2mol),溶于2400ml四氫呋喃中,緩慢滴加到上述溶液中,冰浴攪拌1h后25度繼續反應2h。反應完成后抽濾,濾液旋蒸濃縮至2000~2500ml。濃縮完成后抽濾,濾液加入8000ml石油醚,析出大量白色固體,溶液-20度冰箱靜置1h。靜置后抽濾,濾餅以2000ml乙酸乙酯溶解,加入6000ml石油醚,溶液澄清。置于-20度冰箱中,2h后析出大量白色固體,抽濾,濾餅干燥,稱重,得Fmoc-Asn(Trt)-OSu 1279.3g,收率92.2%。

實施例14:Fmoc-Asn(Trt)-Leu-OH的制備

準確稱取H-Leu-OH354.2g(2.7mol)和碳酸鈉343.4g(3.24mol)溶于4000mL水中,冰浴下(2~8℃)緩慢加入實施例13中制備的Fmoc-Asn(Trt)-OSu(1248.7g,1.8mol)的四氫呋喃溶液3000ml,攪拌反應,TLC監測反應終點。反應完全后,減壓旋蒸除去四氫呋喃,剩余水溶液抽濾后冰水浴下加入10%的檸檬酸水溶液調溶液pH值至2~3,8000ml乙酸乙酯分三次萃取,合并有機相,以3000ml飽和食鹽水分三次洗滌,無水硫酸鈉干燥,旋蒸除去乙酸乙酯,剩余油狀物加入2000ml甲醇復溶,溶液澄清透明,置于-20℃冰箱中析晶,得Fmoc-Asn(Trt)-Leu-OH 1100.2g,收率86.1%。

實施例15:Fmoc-Asn(Trt)-Leu-OSu的制備

準確稱取實施例14中制備的Fmoc-Asn(Trt)-Leu-OH 1063.9g(1.5mol)和HOSu 172.5g(1.5mol)溶于4000ml四氫呋喃中,冰水浴攪拌。準確稱取DCC 309.6g(1.5mol),溶于2400ml四氫呋喃中,緩慢滴加到上述溶液中,冰浴攪拌1h后25度繼續反應2h。反應完成后抽濾,濾液旋蒸濃縮至3000~3500ml。濃縮完成后抽濾,濾液加入8000ml石油醚,析出大量白色固體,溶液-20度冰箱靜置1h。靜置后抽濾,濾餅以2000ml乙酸乙酯溶解,加入6000ml石油醚,溶液澄清。置于-20度冰箱中,2h后析出大量白色固體,抽濾,濾餅干燥,稱重,得Fmoc-Asn(Trt)-Leu-OSu 1079.6g,收率89.2%。

實施例16:Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-OH的制備

準確稱取H-Ala-OH 160.2g(1.8mol)和碳酸鈉228.9g(2.16mol)溶于2000mL水中,冰浴下(2~8℃)緩慢加入實施例15中制備的Fmoc-Asn(Trt)-Leu-OSu(968.28g,1.2mol)的四氫呋喃溶液3000ml,攪拌反應,TLC監測反應終點。反應完全后,減壓旋蒸除去四氫呋喃,剩余水溶液抽濾后冰水浴下加入10%的檸檬酸水溶液調溶液pH值至2~3,8000ml乙酸乙酯分三次萃取,合并有機相,以3000ml飽和食鹽水分三次洗滌,無水硫酸鈉干燥,旋蒸除去乙酸乙酯,加入3500ml甲醇,加熱至40℃溶液澄清透明,置于-20℃析晶,得Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-OH 760.1g,收率81.1%。

實施例17:Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-OSu的制備

準確稱取實施例16中制備的Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-OH 702.9g(0.9mol)和HOSu 103.5g(0.9mol)溶于4000ml四氫呋喃中,冰水浴攪拌。準確稱取DCC 185.7g(1.5mol),溶于2400ml四氫呋喃中,緩慢滴加到上述溶液中,冰浴攪拌1h后25度繼續反應2h。反應完成后抽濾,濾液旋蒸濃縮至3000~3500ml。濃縮完成后抽濾,濾液加入8000ml石油醚,析出大量白色固體,溶液-20度冰箱靜置1h。靜置后抽濾,濾餅以2000ml乙酸乙酯溶解,加入6000ml石油醚,溶液澄清。置于-20度冰箱中,2h后析出大量白色固體,抽濾,濾餅干燥,稱重,得Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-OSu 704.9g,收率89.2%。

實施例18:Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-OH的制備

準確稱取H-Ala-OH 93.5g(1.05mol)和碳酸鈉133.5g(1.26mol)溶于2000mL水中,冰浴下(2~8℃)緩慢加入實施例17中制備的Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-OSu(614.6g,0.7mol)的四氫呋喃溶液3000ml,攪拌反應,TLC監測反應終點。反應完全后,減壓旋蒸除去四氫呋喃,剩余水溶液抽濾后冰水浴下加入10%的檸檬酸水溶液調溶液pH值至2~3,8000ml乙酸乙酯分三次萃取,合并有機相,以3000ml飽和食鹽水分三次洗滌,無水硫酸鈉干燥,旋蒸除去乙酸乙酯,加入3500ml甲醇,加熱至40℃溶液澄清透明,置于-20℃析晶,得Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-OH 510.5g,收率85.6%。

實施例19:Fmoc-Asp(OtBu)-OSu的制備

準確稱取Fmoc-Asp(OtBu)-OH 822.3g(2mol)和HOSu 230g(2mol)溶于4000ml四氫呋喃中,冰水浴攪拌。準確稱取DCC 412.8g(2mol),溶于2400ml四氫呋喃中,緩慢滴加到上述溶液中,冰浴攪拌1h后25度繼續反應2h。反應完成后抽濾,濾液旋蒸濃縮至2000~2500ml。濃縮完成后抽濾,濾液加入8000ml石油醚,析出大量白色固體,溶液-20度冰箱靜置1h。靜置后抽濾,濾餅以2000ml乙酸乙酯溶解,加入6000ml石油醚,溶液澄清。置于-20度冰箱中,2h后析出大量白色固體,抽濾,濾餅干燥,稱重,得Fmoc-Asp(OtBu)-OSu 926.6g,收率91.2%。

實施例20:Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-OH的制備

準確稱取H-Phe-OH 483.3g(2.7mol)和碳酸鈉343.4g(3.24mol)溶于4000mL水中,冰浴下(2~8℃)緩慢加入實施例19中制備的Fmoc-Asp(OtBu)-OSu(914.4g,1.8mol)的四氫呋喃溶液3000ml,攪拌反應,TLC監測反應終點。反應完全后,減壓旋蒸除去四氫呋喃,剩余水溶液抽濾后冰水浴下加入10%的檸檬酸水溶液調溶液pH值至2~3,8000ml乙酸乙酯分三次萃取,合并有機相,以3000ml飽和食鹽水分三次洗滌,無水硫酸鈉干燥,旋蒸除去乙酸乙酯,剩余油狀物加入2000ml甲醇復溶,溶液澄清透明,置于-20℃冰箱中析晶,得Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-OH 877.2g,收率85.2%。

實施例21:Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-OSu的制備

準確稱取實施例20中制備的Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-OH 858.3g(1.5mol)和HOSu 172.5g(1.5mol)溶于4000ml四氫呋喃中,冰水浴攪拌。準確稱取DCC 309.6g(1.5mol),溶于2400ml四氫呋喃中,緩慢滴加到上述溶液中,冰浴攪拌1h后25度繼續反應2h。反應完成后抽濾,濾液旋蒸濃縮至3000~3500ml。濃縮完成后抽濾,濾液加入8000ml石油醚,析出大量白色固體,溶液-20度冰箱靜置1h。靜置后抽濾,濾餅以2000ml乙酸乙酯溶解,加入6000ml石油醚,溶液澄清。置于-20度冰箱中,2h后析出大量白色固體,抽濾,濾餅干燥,稱重,得Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-OSu 915.2g,收率91.2%。

實施例22:Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-Ile-OH的制備

準確稱取H-Ile-OH 235.8g(1.8mol)和碳酸鈉228.9g(2.16mol)溶于2000mL水中,冰浴下(2~8℃)緩慢加入實施例21中制備的Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-OSu(802.8g,1.2mol)的四氫呋喃溶液3000ml,攪拌反應,TLC監測反應終點。反應完全后,減壓旋蒸除去四氫呋喃,剩余水溶液抽濾后冰水浴下加入10%的檸檬酸水溶液調溶液pH值至2~3,8000ml乙酸乙酯分三次萃取,合并有機相,以3000ml飽和食鹽水分三次洗滌,無水硫酸鈉干燥,旋蒸除去乙酸乙酯,加入3500ml甲醇,加熱至40℃溶液澄清透明,置于-20℃析晶,得Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-Ile-OH 676.6g,收率82.3%。

實施例23:Fmoc-Trp(Boc)-OSu的制備

準確稱取Fmoc-Trp(Boc)-OH 1053.2g(2mol)和HOSu 230g(2mol)溶于4000ml四氫呋喃中,冰水浴攪拌。準確稱取DCC 412.8g(2mol),溶于2400ml四氫呋喃中,緩慢滴加到上述溶液中,冰浴攪拌1h后25度繼續反應2h。反應完成后抽濾,濾液旋蒸濃縮至2000~2500ml。濃縮完成后抽濾,濾液加入8000ml石油醚,析出大量白色固體,溶液-20度冰箱靜置1h。靜置后抽濾,濾餅以2000ml乙酸乙酯溶解,加入6000ml石油醚,溶液澄清。置于-20度冰箱中,2h后析出大量白色固體,抽濾,濾餅干燥,稱重,得Fmoc-Trp(Boc)-OSu 1135.3g,收率91.6%。

實施例24:Fmoc-Trp(Boc)-Leu-OH的制備

準確稱取H-Leu-OH 354.2g(2.7mol)和碳酸鈉343.4g(3.24mol)溶于4000mL水中,冰浴下(2~8℃)緩慢加入實施例23中制備的Fmoc-Trp(Boc)-OSu(1115.5g,1.8mol)的四氫呋喃溶液3000ml,攪拌反應,TLC監測反應終點。反應完全后,減壓旋蒸除去四氫呋喃,剩余水溶液抽濾后冰水浴下加入10%的檸檬酸水溶液調溶液pH值至2~3,8000ml乙酸乙酯分三次萃取,合并有機相,以3000ml飽和食鹽水分三次洗滌,無水硫酸鈉干燥,旋蒸濃縮除去乙酸乙酯,加入2500ml甲醇復溶,溶液澄清,置于-20℃析晶,得Fmoc-Trp(Boc)-Leu-OH 905.1g,收率78.6%。

實施例25:Fmoc-Trp(Boc)-Leu-OSu的制備

準確稱取實施例24中制備的Fmoc-Trp(Boc)-Leu-OH 896.4g(1.5mol)和HOSu 172.5g(1.5mol)溶于4000ml四氫呋喃中,冰水浴攪拌。準確稱取DCC 309.6g(1.5mol),溶于2400ml四氫呋喃中,緩慢滴加到上述溶液中,冰浴攪拌1h后25度繼續反應2h。反應完成后抽濾,濾液旋蒸濃縮至2000~2500ml。濃縮完成后抽濾,濾液加入8000ml石油醚,析出大量白色固體,溶液-20度冰箱靜置1h。靜置后抽濾,濾餅以2000ml乙酸乙酯溶解,加入6000ml石油醚,溶液澄清。置于-20度冰箱中,2h后析出大量白色固體,抽濾,濾餅干燥,稱重,得Fmoc-Trp(Boc)-Leu-OSu 1096.3g,收率90.2%。

實施例26:Fmoc-Trp(Boc)-Leu-Ile-OH的制備

準確稱取H-Ile-OH 235.8g(1.8mol)和碳酸鈉228.9g(2.16mol)溶于2000mL水中,冰浴下(2~8℃)緩慢加入實施例25中制備的Fmoc-Trp(Boc)-Leu-OSu(932.5g,1.2mol)的四氫呋喃溶液3000ml,攪拌反應,TLC監測反應終點。反應完全后,減壓旋蒸除去四氫呋喃,剩余水溶液抽濾后冰水浴下加入10%的檸檬酸水溶液調溶液pH值至2~3,8000ml乙酸乙酯分三次萃取,合并有機相,以3000ml飽和食鹽水分三次洗滌,無水硫酸鈉干燥,旋蒸除去乙酸乙酯,加入3500ml甲醇,加熱至40℃溶液澄清透明,置于-20℃析晶,得Fmoc-Trp(Boc)-Leu-Ile-OH 725.5g,收率81.6%。

實施例27:Fmoc-Lys(Boc)-OSu的制備

準確稱取Fmoc-Lys(Boc)-OH 937.2g(2mol)和HOSu 230g(2mol)溶于4000ml四氫呋喃中,冰水浴攪拌。準確稱取DCC 412.8g(2mol),溶于2400ml四氫呋喃中,緩慢滴加到上述溶液中,冰浴攪拌1h后25度繼續反應2h。反應完成后抽濾,濾液旋蒸濃縮至2000~2500ml。濃縮完成后抽濾,濾液加入8000ml石油醚,析出大量白色固體,溶液-20度冰箱靜置1h。靜置后抽濾,濾餅以2000ml乙酸乙酯溶解,加入6000ml石油醚,溶液澄清。置于-20度冰箱中,2h后析出大量白色固體,抽濾,濾餅干燥,稱重,得Fmoc-Lys(Boc)-OSu 1036.8g,收率92.3%。

實施例28:Fmoc-Lys(Boc)-Ile-OH的制備

準確稱取H-Ile-OH 355.6g(2.7mol)和碳酸鈉343.4g(3.24mol)溶于4000mL水中,冰浴下(2~8℃)緩慢加入實施例28中制備的Fmoc-Lys(Boc)-OSu(1010.3g,1.8mol)的四氫呋喃溶液3000ml,攪拌反應,TLC監測反應終點。反應完全后,減壓旋蒸除去四氫呋喃,剩余水溶液抽濾后冰水浴下加入10%的檸檬酸水溶液調溶液pH值至2~3,8000ml乙酸乙酯分三次萃取,合并有機相,以3000ml飽和食鹽水分三次洗滌,無水硫酸鈉干燥,旋蒸抽去乙酸乙酯,新加入2000ml四氫呋喃復溶,加入4000ml石油醚析晶,得Fmoc-Lys(Boc)-Ile-OH 871.2g,收率83.2%。

實施例29:Fmoc-Asp(OtBu)-Wang Resin的合成

稱取30.0g(Sub=0.47mmol/g)Wang Resin置于固相反應器,以DMF洗滌樹脂兩次,200ml/次,重新加入DCM 200ml溶脹樹脂30min。樹脂溶脹的同時,稱取Fmoc-Asp(OtBu)-OH 17.38g(42.3mmol,3eq),HOBt 6.28g(46.5mmol,3.3eq),以150ml體積比為1:1的DMF和DCM的混合溶液溶解,冰浴10min,加入DIC 7.25ml(46.5mmol,3eq)活化5min。樹脂溶脹及氨基酸活化完成后,投料反應,氮氣攪拌,10min后加入DMAP 0.51g(4.23mmol,0.3eq),繼續反應5h。5h后,抽掉反應液,DMF洗滌樹脂4次,200ml/每次;DCM洗滌樹脂2次,200ml/次。加入封端試劑180mL(50ml乙酸酐和42.5ml吡啶溶解于87.5mL DMF中)將剩余未反應羥基乙酰化2h。反應完成后抽濾反應液,分別以DMF,DCM,甲醇洗滌樹脂3次,200ml/次,真空干燥后得Fmoc-Asp(OtBu)-Wang Resin 36.7g,改造后替代度為0.31mmol/g。

實施例30:Fmoc-Asp(OtBu)-CTC Resin的合成

稱取CTC樹脂30.0g(sub=0.40mmol/g)置于合成柱中,用200mL DMF洗滌兩次,加入200mL DCM溶脹30min;抽去DCM后,加入溶有9.86g(24mmol)Fmoc-Asp(OtBu)-OH的DCM/DMF(3/1,體積比)溶液100ml,N2攪拌5min后加入DIPEA 4.0ml(24mmol),繼續鼓N2攪拌反應60min。反應完成后抽掉反應液,加入DCM/CH3OH/DIPEA(體積比17:2:1)混合溶液封端3次,每次200ml,反應10min;然后用DMF、DCM、甲醇分別洗滌3次,真空干燥得Fmoc-Asp(OtBu)-CTC Resin 37.1g,測改造后替代度為0.30mmol/g。

實施例31:替度魯肽肽樹脂的制備

準確稱取實施例29中制備的替代度為0.31mmol/g的Fmoc-Asp(OtBu)-Wang Resin 32.25g(合成規模10mmol)置于固相反應器中,DMF洗滌樹脂2次,150ml/次,加入150ml DCM溶脹30min;樹脂溶脹完畢后以20%的哌啶/DMF脫Fmoc 2次,150ml/次,分別反應5min和10min;脫保護完成后以DMF洗滌4次,DCM洗滌2次,150ml/次。取小樣以Kaiser試劑檢測,樹脂呈深藍色。

稱取Fmoc-Thr(tBu)-OH 11.91g(30mmol,3eq),HOBt 4.05g(30mmol,3eq),以120ml體積比為1:1的DMF,DCM溶液溶解,冰水浴10min,加入DIC 4.68ml(30mmol,3eq)活化5min。活化完成后投料反應,氮氣攪拌2h,反應終點以Kaiser試劑檢測結果為準,檢測反應完成后,抽濾除去反應液,以DMF洗滌4次,DCM洗滌2次,200ml/次。以20%的哌啶/DMF脫Fmoc 2次,150ml/次,分別反應5min和10min;脫保護完成后以DMF洗滌4次,DCM洗滌2次,150ml/次。取小樣以Kaiser試劑檢測,樹脂呈深藍色,32位Thr偶聯完成。

按照32位Thr的偶聯方法,依照替度魯肽肽序,依次連接氨基酸及短肽片段:

Fmoc-Lys(Boc)-Ile-OH,Fmoc-Thr(tBu)-OH,Fmoc-Gln(Trt)-OH,Fmoc-Trp(Boc)-Leu-Ile-OH,Fmoc-Asn(Trt)-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-Ile-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-OH,Fmoc-Thr(tBu)-Ile-Leu-OH,Fmoc-Asn(Trt)-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-Met-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Ser(tBu)-Phe-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-OH,Fmoc-His(Trt)-Gly-OH。肽樹脂合成結束后,依次以DMF洗滌4次,DCM洗滌2次,甲醇洗滌3次,200ml/次,樹脂25度真空干燥8h,稱重得96.33g。

實施例32:替度魯肽肽樹脂的制備

準確稱取實施例30中制備的替代度為0.31mmol/g的Fmoc-Asp(OtBu)-CTC Resin 33.33g(合成規模10mmol)置于合成柱中,DMF洗滌樹脂2次,150ml/次,加入150ml DCM溶脹30min;樹脂溶脹完畢后以20%的哌啶/DMF脫Fmoc 2次,150ml/次,分別反應5min和10min;脫保護完成后以DMF洗滌4次,DCM洗滌2次,150ml/次。取小樣以Kaiser試劑檢測,樹脂呈深藍色。

稱取Fmoc-Thr(tBu)-OH 11.91g(30mmol,3eq),HOBt 4.05g(30mmol,3eq),以120ml體積比為1:1的DMF,DCM溶液溶解,冰水浴10min,加入DIC 4.68ml(30mmol,3eq)活化5min。活化完成后投料反應,氮氣攪拌2h,反應終點以Kaiser試劑檢測結果為準,檢測反應完成后,抽濾除去反應液,以DMF洗滌4次,DCM洗滌2次,200ml/次。以20%的哌啶/DMF脫Fmoc 2次,150ml/次,分別反應5min和10min;脫保護完成后以DMF洗滌4次,DCM洗滌2次,150ml/次。取小樣以Kaiser試劑檢測,樹脂呈深藍色,32位Thr偶聯完成。

按照32位Thr的偶聯方法,依照替度魯肽肽序,依次連接氨基酸及短肽片段:

Fmoc-Lys(Boc)-Ile-OH,Fmoc-Thr(tBu)-OH,Fmoc-Gln(Trt)-OH,Fmoc-Trp(Boc)-Leu-Ile-OH,Fmoc-Asn(Trt)-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-Ile-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-OH,Fmoc-Thr(tBu)-Ile-Leu-OH,Fmoc-Asn(Trt)-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-Met-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Ser(tBu)-Phe-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-OH,Fmoc-His(Trt)-Gly-OH。肽樹脂合成結束后,依次以DMF洗滌4次,DCM洗滌2次,甲醇洗滌3次,200ml/次,樹脂25度真空干燥8h,稱重得92.12g。

實施例33:替度魯肽粗肽的制備

將實施例31所制備的替度魯肽肽樹脂90g置于2000ml圓底燒瓶中,冰浴預冷。配置裂解試劑900ml,其體積比為TFA:PhSC:Phenol:EDT:H2O=82.5:5:5:2.5:5,置于-20冰箱中預冷30min。按照1g樹脂10ml的比例將裂解試劑加入到肽樹脂中,冰水浴攪拌2h,25度攪拌2h,停止反應后抽濾,樹脂以TFA洗滌兩次,100ml/次,合并濾液,緩慢傾倒至9L預冷的乙醚中,攪拌,置于-20冰箱中靜置1h。將乙醚沉降液離心,并以乙醚洗滌六次,離心所得固體干燥,得39.88g,收率106.3%。取粗肽樣品分析,純度為73.1%。

實施例34:替度魯肽粗肽的制備

將實施例32所制備的替度魯肽肽樹脂90g置于1000ml圓底燒瓶中,冰浴預冷。配置裂解試劑900ml,其體積比為TFA:PhSC:Phenol:EDT:H2O=82.5:5:5:2.5:5,置于-20冰箱中預冷30min。按照1g樹脂10ml的比例將裂解試劑加入到肽樹脂中,冰水浴攪拌2h,25度攪拌2h,停止反應后抽濾,樹脂以TFA洗滌兩次,100ml/次,合并濾液,緩慢傾倒至9L預冷的乙醚中,攪拌,置于-20冰箱中靜置1h。將乙醚沉降液離心,并以乙醚洗滌六次,離心所得固體干燥,得34.33g,收率91.5%。取粗肽樣品分析,純度為71.3%。

實施例35:替度魯肽粗肽的純化

稱取實施例33所得粗肽10.0g,以500ml 5%的乙腈/水溶解,超聲助溶,0.45um濾膜過濾。內徑為100mm的C18制備柱,流動相A為0.1%TFA/水,流動相B為0.1%TFA/乙腈,上樣量為10g/針,流速300ml/min,檢測波長210nm。梯度洗脫,峰前和峰后循環進樣,得到中控分析純度為98.5%以上的精肽溶液;以醋酸/乙腈/水體系轉鹽后凍干得替度魯肽精肽4.23g,純度99.5%以上,總收率45.08%。

實施例36:替度魯肽粗肽的純化

稱取實施例34所得粗肽10.0g,以500ml 5%的乙腈/水溶解,超聲助溶,0.45um濾膜過濾。內徑為100mm的C18制備柱,流動相A為0.1%TFA/水,流動相B為0.1%TFA/乙腈,上樣量為10g/針,流速300ml/min,檢測波長210nm。梯度洗脫,峰前和峰后循環進樣,得到中控分析純度為98.5%以上的精肽溶液;以醋酸/乙腈/水體系轉鹽后凍干得替度魯肽精肽4.19g,純度99.5%以上,總收率38.36%。

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