專利名稱：一株含有Lg-ATF1基因的釀酒酵母工程菌的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物工程技術領域，涉及工業微生物的育種，尤其是一株含有Lg-ATFl 基因的釀酒酵母工程菌。
背景技術：
如何提高酒中酯香物質的含量，一直是我國普通白酒、黃酒企業和相關科研單位研究的重要課題。目前提高普通白酒酯含量的主要方法有如下三種一是固液結合法，用液態法生產酒基，用固態法的酒糟、酒尾或成品酒來提高質量；二是調香法，用天然香料調制或用純化學藥品按某一名酒的香味成分組成來進行調香；三是全液法，在發酵醪中加入產香微生物，己酸菌發酵液或將己酸發酵液經化學、生物法酯化后，再加到發酵醪中。這些提高酒中酯香物質含量的方法大多是從工藝水平上進行的，雖然酯含量有一定提高，但酒質與高檔名酒相差仍很大，特別是化學藥品的加入存在安全隱患。因此，要從根本上解決釀酒酵母的產酯能力還是需要利用分子生物學育種技術構建高產酯的釀酒酵母工業菌株。研究表明，乙酸酯類，如乙酸乙酯(溶劑類香氣)和乙酸異戊酯(香蕉風味)，是酒中主要的風味活性酯。這些酯類的形成是在酵母代謝時在酵母內合成的，形成的酯一部分通過細胞擴散到發酵液中，一部分被酵母吸附，留在細胞體內。提高這些乙酸酯的含量不僅可以增進酒的酯香，同時能有效地擴張、松馳神經，可減少喝酒引起的副作用。參與乙酸酯合成的酶主要是醇乙酰基轉移酶(AATase)，它可以催化醇和乙酰輔酶 A形成乙酸酯。該酶是一種巰基酶，有三種不同的類型AATase I、Lg-AATase I和AATase II，分別由ATFl、Lg-ATFl和ATF2編碼。釀酒酵母只含有一個ATFl基因，而啤酒酵母除了含有ATFl基因外，還含有一個同源基因Lg-ATFl基因。而國內還沒有醇乙酰基轉移酶及其編碼基因對白酒和黃酒風味和品質影響的相關研究。

發明內容
本發明的目的是解決釀酒酵母自身產酯能力較低的問題，提供一株含有Lg-ATFl 基因的釀酒酵母工程菌。本發明提供的含有Lg-ATFl基因的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)工程菌，具體為EY-15，已于2011年12月22日保藏于中國微生物保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，地址中國北京市朝陽區大屯路甲3號，保藏號為CGMCC No 5636。所述的釀酒酵母工程菌，在其它發酵性能不受影響的情況下，模擬半固態發酵后， 轉化子菌株與親本菌株(Saccharomyces cerevisiae CGMCC No 2. 1525)相比，乙酸乙酯含量提高I. 6倍，乙酸異戊酯的含量提高到26. 6mg/L。本發明所述含有Lg-ATFl基因的釀酒酵母工程菌的構建方法是I)將PGKl啟動子和終止子與PUC19質粒連接得到pUC-PGKl ；2)將來源于釀酒酵母的同源片段IAH連接到第I)步得到的pUC-PGKl上，得到 pUC-PGKl-IAH ；
3)將啤酒酵母中編碼醇乙酰基轉移酶Lg-ATFl基因插入到第2)步得到的 pUC-PGKl-IAH 中 PGKl 啟動子和終止子之間，得到 pUC-PGKl-IAH-Lg-ATFl ；4)將kan基因連接到第3)步得到的pUC-PGKl-IAH-Lg-ATFl上，得到質粒 pUC-PGKl-IAH-Lg-ATFl-kan (以下簡稱 pUC-PILgK)；5)將第4)步構建的過表達質粒pUC-PILgK用Bpull02I酶切，用醋酸鋰轉化法分別將其插入釀酒酵母a型和α型單倍體，得到同源重組后的釀酒酵母基因工程單倍體菌株;6)將純化后的釀酒酵母a型和α型重組單倍體進行融合，通過抗性平板和生孢實驗篩選得到含有Lg-ATFl基因的釀酒酵母工程菌(雙倍體)。本發明同時提供了一種專門用于鑒定含有Lg-ATFl基因的釀酒酵母工程菌的基因序列，該基因序列是以Lg-U和Lg-D為引物，以所述含有Lg-ATFl基因的釀酒酵母工程菌菌株基因組為模板，擴增片段測序為一特異性序列，如序列表I所示。模擬半固態發酵將酵母菌接入5mL麥芽汁培養液中，30°C過夜培養12h ;將菌液全部轉至20mL新鮮麥芽汁培養液中，30°C培養24h。取IOOg粳米置于25 30°C的水中， 浸潰72h ;取出后洗凈，常壓蒸煮30min。將米攤涼，投入500mL三角瓶中，加入IOg熟麥曲和105mL水。最后，接入25mL酵母麥芽汁培養液，28°C發酵5天。對發酵液進行分析，包括失重、酒度、殘糖和GC測定香氣成分含量。GC分析發酵液經蒸餾萃取后采用氣相色譜法測定。內標物為乙酸正戊酯。氣相色譜儀為 Agilent 7890C ;色譜柱 HPINNOWAX Polyethylene Glyco 260 °C 30mX320ymX0. 5μπι，配FID檢測器。載氣為高純氮，流速2. OmL/min。起始柱溫為52°C， 以2°C /min的升溫速度升至70°C，再以4°C /min的升溫速度升至90°C，最后以10°C /min 的升溫速度升至200°C。檢測器溫度為250°C，進樣口溫度為230°C，進樣量為l.OyL。分流方式為分流，分流比為25 I。本發明的優點和積極效果本發明選用強啟動子PGKl將啤酒酵母中特有的編碼醇乙酰基轉移酶的Lg-ATFl 基因在釀酒酵母中過表達，得到含有Lg-ATFl基因的釀酒酵母工程菌Saccharomyces cerevisiae EY-15，保藏號為 CGMCC No 5636。本發明所獲得的含有Lg-ATFI基因的釀酒酵母工程菌Saccjaromyces cerevisiae EY-15 (保藏號CGMCC No 5636)與初始的釀酒酵母菌(受:體菌Saccharomyces cerevisiae CGMCCNo 2. 1525)相比模擬半固態發酵后，乙酸乙酯含量提高I. 6倍，乙酸異戊酯的含量提高到26. 6mg/L，為釀酒工業生產提供了優良菌株。


圖LpUC-PILgK質粒的驗證電泳圖。圖2.陽性重組釀酒酵母單倍體的驗證，其中(a)為a型陽性重組單倍體驗證結果；(b)為α型陽性重組單倍體驗證結果。圖3.含有Lg-ATFl基因的釀酒酵母工程菌的構建路線圖。本發明所述的一株含有Lg-ATFl基因的釀酒酵母工程菌(Saccharomyces cerevisiae)具體為EY-15，已于2011年12月22日保藏于中國微生物保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，地址為中國北京市朝陽區大屯路甲3號，保藏號為CGMCC No 5636。
具體實施例方式本發明所使用的釀酒酵母雙倍體菌體是可以采用任何來源的釀酒酵母雙倍體菌株。下述實施例中的方法，如無特別說明，均為常規方法。實施例I :含有Lg-ATFl基因的釀酒酵母工程菌的構建(I)基因工程菌株的構建I)將PGKl啟動子和終止子與PUC19質粒連接得到pUC-PGKl ；2)將來源于釀酒酵母的同源片段IAH連接到第I)步得到的pUC-PGKl上，得到 pUC-PGKl-IAH ；3)將啤酒酵母中編碼醇乙酰基轉移酶Lg-ATFl基因插入到第2)步得到的 pUC-PGKl-IAH 中 PGKl 啟動子和終止子之間，得到 pUC-PGKl-IAH-Lg-ATFl ；4)將kan基因連接到第3)步得到的pUC-PGKl-IAH-Lg-ATFl上，得到質粒 pUC-PGKl-IAH-Lg-ATFl-kan (以下簡稱 pUC-PILgK)；圖I為pUC-PILgK質粒的驗證電泳圖其中泳道I為5000 bp DNA Ladder Marker ； 泳道2為受體菌基因組PCR擴增同源片斷IAH ;泳道3為pUC-PILgK質粒PCR擴增同源片斷IAH ;泳道4為啤酒酵母基因組PCR擴增Lg-ATFl ;泳道5為pUC-PILgK質粒PCR擴增 Lg-ATFl ;泳道6為pUG6質粒PCR擴增Kan ;泳道7為pUC-PILgK質粒PCR擴增Kan ;泳道 8為pUC-PILgK質粒，PGKl上游引物+下游引物PCR擴增結果；泳道9為IKb DNALadder Marker ;泳道10為載體pUC19單酶切線性結果；泳道11為pUC-PILgK質粒單酶切線性結果O5) Bpu 11021 (Blp I)酶切質粒pUC-PILgK ;用醋酸鋰轉化法分別將其插入釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CGMCC No 2. 1525) a型和α型單倍體,得到同源重組后的釀酒酵母基因工程單倍體菌株。圖2中(a)為a型陽性重組單倍體PCR驗證結果；(b)為 α型陽性重組單倍體PCR驗證結果。其中泳道I為5000bp DNALadder Marker，泳道2為受體菌a/ α型單倍體上游PCR陰性對照；泳道3為a/ α型重組單倍體上游PCR產物；泳道 4為受體菌a/ α型單倍體下游PCR陰性對照；泳道5為a/ α型重組單倍體下游PCR產物。6)將純化后的釀酒酵母a型和α型重組單倍體進行融合，通過抗性平板和生孢實驗篩選得到含有Lg-ATFl基因的釀酒酵母工程菌ΕΥ-15 (雙倍體)。圖3為含有Lg-ATFl 基因的釀酒酵母工程菌的構建過程。(2)基因工程菌株的特異性序列以上獲得的基因工程菌株ΕΥ-15染色體中含有一段特異性序列，可通過PCR擴增測序后進行菌株鑒定。特異性片段擴增的引物序列為Lg-U :5’ -GGAGGAGACCGAACACAAGTATC-3，Lg-D :5，-TGGTTTGGAGGAGAAGATAACGACG-3’該特異性片段的基因序列見序列表I。
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實施例2 :含Lg-ATFl基因的釀酒酵母工程菌與出發菌株發酵性能的研究將工程菌和受體菌分別接入5mL麥芽汁培養液中，30°C過夜培養12h ;將菌液全部轉至20mL新鮮麥芽汁培養液中，30°C培養24h。取IOOg粳米置于25 30°C的水中，浸潰72h ;取出后洗凈，常壓蒸煮30min。將米攤涼，投入500mL三角瓶中，加入IOg熟麥曲和 105mL水。最后，接入25mL酵母麥芽汁培養液，28°C發酵5天。發酵期間每隔12h振蕩并稱重，記錄失重；發酵結束后，停止培養并稱重；測定發酵液的殘糖濃度、酒精體積分數以及主要香氣成分含量，以發酵能力、殘糖濃度和產物生成量表征其綜合性能，結果見表I。表I釀酒酵母受體菌和工程菌的發酵性能
項目CO2失重 (g)殘糖含量 (g/100mL)酒精度 (v/v20°C)乙酸乙酯含量 (mg/L)乙酸異戊酯含量 (mg/L)受體菌28.50.8114.248.47—工程菌28.00.8414.177.2326.58注所示數據為三個平行試驗結果的平均值。實施例3 :含有Lg-ATFl基因的工程單倍體與出發菌株單倍體發酵性能的研究將工程單倍體(a/ α型)和受體菌單倍體(a/ α型)分別接入5mL麥芽汁培養液中，30°C過夜培養12h ;將菌液全部轉至20mL新鮮麥芽汁培養液中，30°C培養24h。取IOOg 粳米置于25 30°C的水中，浸潰72h ;取出后洗凈，常壓蒸煮30min。將米攤涼，投入500mL 三角瓶中，加入IOg熟麥曲和105mL水。最后，接入25mL酵母麥芽汁培養液，28°C發酵5天。 發酵期間每隔12h振蕩并稱重，記錄失重；發酵結束后，停止培養并稱重；測定發酵液的殘糖濃度、酒精體積分數以及主要香氣成分含量，以發酵能力、殘糖濃度和產物生成量表征其綜合性能，結果見表2。 表2釀酒酵母受體菌單倍體和工程單倍體的發酵性能
項目CO2失重 (g)殘糖含量 (g/100mL)酒精度 (v/v20°C)乙酸乙酯含量 (mg/L)乙酸異戊酯含量 (mg/L)受體菌a型單倍體27.40.8513.842.05—工程菌a型單倍體27.80.8714.097.5432.49受體菌α型單倍體28.20.8214.248.60—工程菌(X型單倍體28.10.8614.271.3424.87 注所示數據為三個平行試驗結果的平均值。
權利要求
1.一株含有Lg-ATFl基因的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)工程菌，具體為 EY-15，保藏號為 CGMCC No 5636。
2.根據權利要求I所述的釀酒酵母工程菌，其特征在于，在其它發酵性能不受影響的情況下，模擬半固態發酵后，轉化子菌株與親本菌株(Saccharomyces cerevisiae CGMCC No2. 1525)相比，乙酸乙酯含量提高I. 6倍，乙酸異戊酯的含量提高到26. 6mg/L0
全文摘要
一株含有Lg-ATF1基因的釀酒酵母工程菌。本發明提供的釀酒酵母工程菌，是選用強啟動子PGK1將啤酒酵母中特有的編碼醇乙酰基轉移酶的Lg-ATF1基因在釀酒酵母中過表達，得到含有Lg-ATF1基因的釀酒酵母工程菌SaccharomycescerevisiaeEY-15，保藏號為CGMCC No.5636。該菌在其它發酵性能不受影響的情況下，轉化子菌株與親本菌株(SaccharomycescerevisiaeCGMCC No.1525)相比模擬半固態發酵后，乙酸乙酯含量提高1.6倍，乙酸異戊酯的含量提高到26.6mg/L；篩選得到的工程菌對發酵設備及條件沒有特殊要求，一般酒廠的設備和條件均可使用，因而有廣泛的應用前景，能為酒廠的工業化生產帶來顯著經濟效益。
文檔編號C12N15/04GK102604847SQ201210080040
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月23日 優先權日2012年3月23日
發明者張建煒, 張翠英, 戴隆海, 肖冬光, 郭學武 申請人:天津科技大學