本發明涉及醫藥技術領域，尤其涉及從雷公藤中分離鑒定的新的抗炎松香烷型二萜糖苷tripterycosideb。

背景技術：

雷公藤(tripteryginumwilfordiihook.f)為衛矛科雷公藤屬植物，又名黃檀根和斷腸草，其藥用部位為根。據《全國中草藥匯編》記載，雷公藤味苦、性辛、涼，有大毒。具有祛風，解毒，殺蟲作用。外用治風濕性關節炎，皮膚發癢，殺蛆蟲、孑孓，滅釘螺，毒鼠。雷公藤主要分布于福建、湖南和江西等地區。臨床常用于治療類風濕性關節炎、慢性腎炎、紅斑狼瘡等難治性免疫功能亢進疾病。目前有雷公藤片、雷公藤多苷片、雷公藤內酯、雷公藤內酯軟膏、雷公藤總萜片等國產藥品廣泛應用于臨床，療效顯著。

雷公藤的抗炎有效成分主要有松香烷型二萜，目前報道的雷公藤中具有抗炎活性的松香烷型二萜基本為苷元化合物，如雷公藤甲素、雷公藤乙素、雷公藤內酯酮和雷公藤氯內酯醇等松香烷型二萜苷元。雷公藤中關于松香烷型二萜糖苷類化合物報道極少，而具有抗炎活性的松香烷型二萜糖苷還未見報道。為了進一步從雷公藤中發現新的抗炎活性成分，為新藥開發奠定基礎，發明人對雷公藤進行了化學成分的深入研究。結合抗炎藥效活性篩選，從雷公藤中分離鑒定了一種新的抗炎松香烷型二萜糖苷tripterycosideb。本發明首次公開了tripterycosideb的結構、分離和鑒定以及在制備抗炎藥物中的應用。

技術實現要素：

本發明所涉及的從雷公藤中提取分離鑒定的一種新的抗炎松香烷型二萜糖苷，命名為tripterycosideb，化學結構如下式ⅰ。

式ⅰ：tripterycosideb結構。

本發明公開了tripterycosideb的結構、分離和鑒定以及在制備抗炎藥物中的應用，可為臨床炎癥治療提供新的藥物。本發明是通過下述技術方案來實現的。

一、提取分離

1．將雷公藤根切片，加入95%乙醇水溶液，加熱回流提取3次，合并提取液，減壓濃縮回收乙醇得到總浸膏。將總浸膏用乙酸乙酯溶解數次至不再溶解，合并乙酸乙酯溶液，減壓濃縮回收乙酸乙酯得乙酸乙酯部位。

2．將乙酸乙酯部位經中性氧化鋁色譜柱層析，用石油醚-乙酸乙酯（1:0，4:1，3:2，2:3，v/v）及乙酸乙酯-甲醇（1:0，3:1，1:1，0:1，v/v）依次梯度洗脫，依次得到8個洗脫流份，將乙酸乙酯-甲醇（1:1，v/v）洗脫流份減壓濃縮得中性氧化鋁色譜柱洗脫部位。

3．將中性氧化鋁色譜柱洗脫部位經mcigel色譜柱層析，用甲醇-水（0:1，1:9，3:7，1:1，7:3，9:1，1:0，v/v）依次梯度洗脫，依次得到7個洗脫流份，將甲醇-水（7:3，v/v）洗脫流份減壓濃縮得mcigel色譜柱洗脫部位。

4．將mcigel色譜柱洗脫部位經sephadexlh-20凝膠柱分離，甲醇洗脫，tlc檢測合并，減壓濃縮依次得到9個流份，將第6個流份減壓濃縮得sephadexlh-20凝膠柱洗脫部位。

5．取部分sephadexlh-20凝膠柱洗脫部位經制備hplc分離(ymc-actusods-ac18色譜柱，流動相：甲醇-水39:61，v/v，檢測波長210nm)，得化合物tripterycosideb。

二、結構鑒定

tripterycosideb：淡黃色固體(溶劑甲醇)，根據hr-tof-ms（見附圖1）確定分子式為c26h34o9([m+h]⁺，實測值：m/z491.2269，理論計算值：m/z491.2276；[m-h]^-，實測值：m/z489.2126，理論計算值：m/z489.2130)。紫外光譜圖（225nm，285nm）和nmr譜顯示結構中含有苯環。氫核磁共振譜（¹h-nmr）（見附圖2）和碳核磁共振譜（¹³c-nmr）（見附圖3）中顯示3個特征甲基(δh1.18，d，6.8hz，h-16；δh1.21，d，6.8hz，h-17；δh1.18，s，h-20)(δc23.3，c-16；δc23.6，c-17；δc18.2，c-20)和1個特征亞甲基(δh4.82，d，17.6hz，δh4.94，dd，17.6，1.5hz，h-19)(δc72.6，c-19)（見表1），結合存在苯環結構說明tripterycosideb為類似雷酚內酯的松香烷型二萜類結構。¹³c-nmr譜中6個碳信號（δc102.3，c-1’；δc75.4，c-2’；δc79.1，c-3’；δc71.7，c-4’；δc78.3，c-5’；δc62.8，c-6’)結合¹h-nmr譜中糖端基氫信號耦合常數（δh5.00，d，7.6hz，h-1’）說明結構中含有β-葡萄糖。除葡萄糖信號外，根據¹h-nmr和¹³c-nmr結合hsqc譜（見附圖4），確定化合物含有3個甲基，5個亞甲基，3個次甲基，9個季碳，其中1個苯環、另外1個雙鍵和1個酯羰基。根據分子式c26h34o9求得不飽和度為10，扣除5個雙鍵數，求得分子中含有5個環。分子式c26h34o9中含有9個氧原子，除1個葡萄糖和1個酯羰基的氧原子外，剩余1個氧原子為羥基氧原子。通過比較發現tripterycosideb與文獻（陳玉,楊光忠,趙松,李援朝.雷公藤二萜成分研究[j].林產化學與工業,2005,25(02):35-38.）報道的雷酚新內酯苷的¹h-nmr和¹³c-nmr數據相似，只是tripterycosideb比雷酚新內酯苷缺少1個甲基信號。因此，tripterycosideb含有雷酚內酯、葡萄糖和羥基結構。葡萄糖和羥基的取代位置可由hmbc相關圖譜（見式ⅱ和附圖5），hmbc譜顯示葡萄糖端基質子h-1’(δh5.00，d，7.6hz)與c-11(δc151.7)相關，說明葡萄糖與c-11相連。苯環上h-12(δh6.88，s)與c-15(δc28.0)，h-12(δh6.88，s)與c-9(δc132.8)，h-12(δh6.88，s)與c-14(δc147.4)，h-15(δh3.26,hept，6.8hz)與c-12(δc111.7)存在hmbc相關，說明苯環上c-12未被取代，因此苯環上剩余c-14位應為被羥基取代。結合h-7(δh2.75，m，δh2.89，m)與c-14(δc147.7)等hmbc相關信號、¹h-nmr和¹³c-nmr化學位移數據，確定oh位于c-14位。綜上所述，tripterycosideb結構確定如式ⅰ，經查文獻確定tripterycosideb為新化合物。

式ⅱ：tripterycosideb的關鍵hmbc相關。

綜合¹h-nmr、¹³c-nmr、hsqc和hmbc譜，tripterycosideb的碳和氫核磁信號歸屬見表1。

表1.tripterycosideb的¹h-nmr和¹³c-nmr數據(600mhz，溶劑cd3od)

。

三、抗炎藥效學評價

本發明對tripterycosideb進行了抗炎藥效學評價。

1.tripterycosideb對脂多糖（lps）誘導的大鼠膝關節滑膜原代成纖維細胞炎癥因子白介素1β（il-1β）過量表達的影響實驗。

1.1大鼠膝關節滑膜原代成纖維細胞的培養

雄性sd大鼠（180-220g）乙醚麻醉后處死，75%酒精浸泡15-20分鐘后，取出膝關節滑膜組織，剪碎，利用ii型膠原酶（4mg/ml）消化2h，加入含10%胎牛血清的rpmimedium1640培養，3天左右細胞慢慢爬出，待細胞長至融合狀態后，用0.25%胰酶（含0.1%的edta）消化2分鐘，細胞傳代繼續培養，原代細胞3-6代用于下面的實驗。

1.2測定tripterycosideb對lps誘導的膝關節滑膜原代成纖維細胞il-1β表達的影響

tripterycosideb用dmso溶解，溶解后母液濃度為10mm，臨用前用磷酸鹽緩沖液（pbs）稀釋到1mm，實驗終濃度為10μm。將細胞以2×10⁶個/ml的濃度接種于48孔板，37℃，5%co2條件下培養至80%的融合狀態，pbs洗滌兩次。換成無血清培養基，加入tripterycosideb溶液，使最終濃度為10μm，0.5h后，加入刺激劑lps（10ng/ml）。實驗分為空白組，模型組，tripterycosideb給藥組，陽性對照藥潑尼松龍給藥組（實驗終濃度為10μm）。模型組用刺激劑lps（10ng/ml）造模，給藥組加入對應化合物，每組6個復孔，37℃，5%co2條件下孵育24小時后，按大鼠il-1βelisa試劑盒說明要求進行測定od值，檢測波長450nm。

1.3實驗結果

結果（見表2）表明，模型組il-1β表達與空白組比較有極顯著性升高（p<0.001），說明造模成功。tripterycosideb、潑尼松龍給藥組與模型組比較均有極顯著性差異（p<0.001），說明tripterycosideb能顯著抑制lps誘導的膝關節滑膜原代成纖維細胞炎癥因子il-1β的過量表達，抑制效果與陽性藥潑尼松龍相當，說明tripterycosideb具有明顯的抗炎活性。

表2.tripterycosideb對lps誘導的滑膜原代成纖維細胞il-1β表達的影響(±s，n=6)

***與模型組比較p<0.001。

2.tripterycosideb對二甲苯引起的小鼠耳腫脹模型影響實驗

tripterycosideb用2%丙二醇水溶液溶解。取昆明種小鼠，雌雄各半，體重18-22g，隨機均分成模型組，tripterycosideb給藥組，陽性對照藥吲哚美辛給藥組，每組10只。各給藥組按10mg/kg劑量灌胃給藥，模型組給等體積2%丙二醇水溶液。連續給藥3天，末次給藥后1小時，將20μl二甲苯涂于小鼠右耳廓兩面致炎,左耳不涂為對照。1小時后將小鼠處死，剪下雙耳,用直徑6mm的打孔器分別在同一部位打下圓耳片,稱重。以左右耳片重量差作為腫脹度,計算抑制率。實驗結果見表3，各給藥組的平均耳腫脹度與模型組相比均有顯著性(p<0.01)差異，tripterycosideb抑制率為64.1%，其抑制率高于陽性藥吲哚美辛。實驗結果表明tripterycosideb具有顯著的抗炎活性，優于陽性藥吲哚美辛。

表3.tripterycosideb對二甲苯引起的小鼠耳腫脹模型影響實驗結果(±s，n=10)

*與模型組比較p<0.01。

四、抗炎藥物制劑制備

tripterycosideb或以其為基本活性的藥物組合物可以與藥學上合適的輔料或載體結合，采用公知方法制成注射劑、片劑、膠囊劑、滴丸劑、控釋制劑、緩釋制劑、納米制劑等制劑抗炎藥物。

附圖說明

附圖1為tripterycosideb的hr-tof-ms（負離子模式）譜圖。

附圖2為tripterycosideb的¹h-nmr譜圖。

附圖3為tripterycosideb的¹³c-nmr譜圖。

附圖4為tripterycosideb的hsqc譜圖。

附圖5為tripterycosideb的hmbc譜圖。

具體實施方式

下面通過實施例作進一步描述，但本發明并不限于實施例所述范圍。

實施例1：

將雷公藤干燥根119千克切片，加入95%乙醇400升，于70℃加熱回流提取3次（1.5×1.5×1小時）。合并提取液，減壓濃縮回收溶劑得浸膏12kg。浸膏用乙酸乙酯溶解多次，合并乙酸乙酯溶液，減壓濃縮回收溶劑得乙酸乙酯部位1.87kg。

將乙酸乙酯部位浸膏1.87kg，經中性氧化鋁柱色譜層析（200-300目，22.5kg），石油醚-乙酸乙酯（1:0，4:1，3:2，2:3，v/v）及乙酸乙酯-甲醇（1:0，3:1，1:1，0:1，v/v）梯度洗脫，每個流份收集50l，依次得到8個洗脫流份(fr.1~fr.8)。

將fr.7流份（即：上述乙酸乙酯-甲醇1:1洗脫流份）（15.6g）經mcigel-chp20p色譜柱分離，甲醇-水（0:1，1:9，3:7，1:1，7:3，9:1，1:0，v/v）梯度洗脫，依次得7個洗脫流份（fr.7.1~fr.7.7）。

將fr.7.5（即：上述甲醇-水7:3洗脫流份）經sephadexlh-20凝膠柱分離，甲醇洗脫，tlc檢測合并依次得到9個流份（fr.7.5.1~fr.7.5.9）。

取fr.7.5.6（300mg）經制備hplc分離(ymc-actusods-ac18色譜柱，流動相：甲醇-水39:61，檢測波長210nm)，得tripterycosideb（保留時間23.98min）（20.2mg）。

實施例2：

tripterycosideb的片劑制備：取50mg化合物與淀粉25mg，糊精25mg混合，用適量30%乙醇濕潤，常規制粒，加入適量硬脂酸鎂混合，壓片，即得。

實施例3：

tripterycosideb的膠囊劑制備：取50mg化合物與淀粉60mg，糊精10mg，糖粉10mg混合，用適量30%乙醇濕潤，常規制粒，裝入硬膠囊中，即得。