本發明涉及醫藥技術領域，尤其涉及從雷公藤中分離鑒定的兩個松香烷型二萜糖苷化合物在制備抗炎藥物中的應用。

背景技術：

雷公藤(tripteryginumwilfordiihook.f)為衛矛科雷公藤屬植物，又名黃檀根和斷腸草，其藥用部位為根。據《全國中草藥匯編》記載，雷公藤味苦、性辛、涼，有大毒。具有祛風，解毒，殺蟲作用。外用治風濕性關節炎，皮膚發癢，殺蛆蟲、孑孓，滅釘螺，毒鼠。雷公藤主要分布于福建、湖南和江西等地區。臨床常用于治療類風濕性關節炎、慢性腎炎、紅斑狼瘡等難治性免疫功能亢進疾病。目前有雷公藤片、雷公藤多苷片、雷公藤內酯、雷公藤內酯軟膏、雷公藤總萜片等國產藥品廣泛應用于臨床，療效顯著。

雷公藤的抗炎有效成分主要有松香烷型二萜，目前報道的雷公藤中具有抗炎活性的松香烷型二萜基本為苷元化合物，如雷公藤甲素、雷公藤乙素、雷公藤內酯酮和雷公藤氯內酯醇等松香烷型二萜苷元。雷公藤中關于松香烷型二萜糖苷類化合物報道極少，而具有抗炎活性的松香烷型二萜糖苷還未見報道。為了進一步從雷公藤中發現新的抗炎活性成分，為新藥開發奠定基礎，發明人對雷公藤進行了化學成分的深入研究。結合抗炎藥效活性篩選，從雷公藤中分離鑒定了兩個具有抗炎活性的松香烷型二萜糖苷。本發明公開了這兩個松香烷型二萜糖苷的提取分離、結構鑒定以及在制備抗炎藥物中的應用。

技術實現要素：

本發明所涉及的從雷公藤中提取分離鑒定的兩個具有抗炎活性松香烷型二萜糖苷分別為wilfordosidea（結構如下式ⅰ）和雷酚新內酯苷（結構如下式ⅱ）。

式ⅰ：wilfordosidea結構式。

式ⅱ：雷酚新內酯苷結構式。

本發明的目的是提供化合物wilfordosidea和雷酚新內酯苷在制備抗炎藥物中的應用。本發明是通過下述技術方案來實現的。

一、提取分離

1．將雷公藤根切片，加入95%乙醇水溶液，加熱回流提取3次，合并提取液，減壓濃縮回收乙醇得到總浸膏。將總浸膏用乙酸乙酯溶解數次至不再溶解，合并乙酸乙酯溶液，減壓濃縮回收乙酸乙酯得乙酸乙酯部位。

2．將乙酸乙酯部位經中性氧化鋁色譜柱層析，用石油醚-乙酸乙酯（1:0，4:1，3:2，2:3，v/v）及乙酸乙酯-甲醇（1:0，3:1，1:1，0:1，v/v）依次梯度洗脫，依次得到8個洗脫流份，將乙酸乙酯-甲醇（1:1，v/v）洗脫流份減壓濃縮得中性氧化鋁色譜柱洗脫部位。

3．將中性氧化鋁色譜柱洗脫部位經mcigel色譜柱層析，用甲醇-水（0:1，1:9，3:7，1:1，7:3，9:1，1:0，v/v）依次梯度洗脫，依次得到7個洗脫流份，將甲醇-水（7:3，v/v）洗脫流份減壓濃縮得mcigel色譜柱洗脫部位。

4．將mcigel色譜柱洗脫部位經sephadexlh-20凝膠柱分離，甲醇洗脫，tlc檢測合并，減壓濃縮依次得到9個流份，將第6個流份減壓濃縮得sephadexlh-20凝膠柱洗脫部位。

5．將sephadexlh-20凝膠柱洗脫部位經制備hplc分離(ymc-actusods-ac18色譜柱，流動相：甲醇-水38:62，v/v，檢測波長210nm)，得化合物wilfordosidea。另取部分sephadexlh-20凝膠柱洗脫部位經制備hplc分離(ymc-actusods-ac18色譜柱，流動相：乙腈-水33:67，檢測波長210nm)，得化合物雷酚新內酯苷。

二、結構鑒定

wilfordosidea：棕黃色粉末（甲醇），熔點212-213℃。用鹽酸加熱水解后薄層色譜檢測有葡萄糖。根據esi-ms（[m-h]^-，m/z521）結合氫核磁共振譜（¹h-nmr）和碳核磁共振譜（¹³c-nmr）確定分子式為c27h38o10。紫外光譜圖（224nm，287nm）和nmr譜顯示結構中含有苯環。氫核磁共振譜（¹h-nmr）和碳核磁共振譜（¹³c-nmr）譜中顯示3個特征甲基(δh1.18，d，7.0hz，h-17；δh2.10，d，1.4hz，h-19；δh1.16，s，h-20)(δc18.7，c-17；δc19.0，c-19；δc18.4，c-20)和1個特征亞甲基(δh3.85，dd，12.1，2.0hz，h-16；3.69，dd，12.1，4.9hz，h-16)(δc68.8，c-16)，結合存在苯環結構說明該化合物為松香烷型二萜類化合物。¹³c-nmr譜中6個碳信號（δc95.7，c-1’；δc74.2，c-2’；δc79.0，c-3’；δc71.2，c-4’；δc78.4，c-5’；δc62.5，c-6’)結合¹h-nmr譜中糖端基氫信號耦合常數（δh5.56，d，8.0hz，h-1’）說明結構中含有β-葡萄糖。¹hnmr(600mhz,cd3od)δh:3.22(1h,m,h-1),2.67(1h,m,h-1),2.55(1h,m,h-2),2.34(1h,m,h-2),2.23(1h,m,h-5),2.40(1h,m,h-6),1.55(1h,m,h-6),3.38(1h,m,h-7),3.03(1h,dd,j=16.1,3.8hz,h-7),6.44(1h,s,h-12),3.24(1h,m,h-15),3.85(1h,dd,j=12.1,2.0hz,h-16),3.69(1h,dd,j=12.1,4.9hz,h-16),1.18(3h,d,j=7hz,h-17),2.10(3h,d,j=1.4hz,h-19),1.16(3h,s,h-20),5.56(1h,d,j=8hz,h-1’),3.49(1h,dd,j=10.7,8.0hz,h-2’),3.63(1h,dd,j=10.7,6.4hz,h-3’),3.44(1h,dd,j=8.7,6.4hz,h-4’),3.40(1h,m,h-5’),3.37(2h,m,h-6’),3.66(3h,s,och3)。¹³cnmr(150mhz,cd3od)δc:33.5(c-1),26(c-2),125.8(c-3),150(c-4),50.4(c-5),21.1(c-6),27.6(c-7),131.8(c-8),132.8(c-9),38.4(c-10),153.9(c-11),113(c-12),136(c-13),150.3(c-14),35.8(c-15),68.8(c-16),18.7(c-17),169.4(c-18),19(c-19),18.4(c-20),95.7(c-1’),74.2(c-2’),79(c-3’),71.2(c-4’),78.4(c-5’),62.5(c-6’),61.4(och3)。經查文獻比較，以上波譜數據與文獻(lihong-mei,wanda-wu,lirong-tao.newabietane-typediterpeneglycosidesfromtherootsoftripterygiumwilfordii[j].journalofasiannaturalproductsresearch,2015,17(7):761-766.)報道的wilfordosidea一致，因此確定該化合物為wilfordosidea(結構見式ⅰ)。

雷酚新內酯苷：白色固體(溶劑甲醇)。用鹽酸加熱水解后薄層色譜檢測有葡萄糖。根據esi-ms（[m-h]^-，m/z503）結合氫核磁共振譜（¹h-nmr）和碳核磁共振譜（¹³c-nmr）確定分子式為c27h36o9。紫外光譜圖（223nm，283nm）和nmr譜顯示結構中含有苯環。氫核磁共振譜（¹h-nmr）和碳核磁共振譜（¹³c-nmr）譜中顯示3個特征甲基(δh1.23，d，6.9hz，h-16；δh1.20，d，6.9hz，h-17；δh1.18，s，h-20)(δc24.4，c-16；δc24.2，c-17；δc18.0，c-20)和1個特征亞甲基(δh4.84，d，17.5hz，h-19；4.96，dd，17.5，1.4hz，h-19)(δc72.6，c-19)，結合存在苯環結構說明該化合物為松香烷型二萜類化合物。¹³c-nmr譜中6個碳信號（δc101.8，c-1’；δc75.3，c-2’；δc78.4，c-3’；δc71.7，c-4’；δc79.1，c-5’；δc62.8，c-6’)結合¹h-nmr譜中糖端基氫信號耦合常數（δh5.04，d，7.6hz，h-1’）說明結構中含有β-葡萄糖。¹h-nmr(600mhz,cd3od)δh:1.47(1h,m,h-1a),3.85(1h,m,h-1b),2.33(2h,m,h-2),2.81(1h,m,h-5),1.74(1h,qd,j=12.6,5.8hz,h-6a),1.92(1h,q,j=7.2hz,h-6b),2.85(1h,dd,j=12.1,7.0hz,h-7a),3.02(1h,dd,j=17.60,5.0hz,h-7b),6.93(1h,s,h-12),3.27(1h,hept,j=6.9hz,h-15),1.23(3h,d,j=6.9hz,h-16),1.20(3h,d,j=6.91hz,h-17),4.84(1h,d,j=17.5hz,h-19a),4.96(1h,dd,j=17.5,1.4hz,h-19b),1.18(3h,s,h-20),5.04(1h,d,j=7.6hz,h-1’),3.54(1h,t,j=7.7hz,h-2’),3.43(1h,m,h-3’),3.38(1h,dd,j=9.5,8.8hz,h-4’),3.49(1h,t,j=8.7hz,h-5’),3.69(1h,dd,j=12.1,6.0hz,h-6’a),3.89(1h,dd,j=12.1,2.2hz,h-6’b),3.67(3h,s,-och3);¹³c-nmr(150mhz,cd3od)δc:33.0(c-1),19.7(c-2),125.7(c-3),167.0(c-4),45.9(c-5),20.4(c-6),26.8(c-7),132.1(c-8),133.4(c-9),38.8(c-10),154.3(c-11),112.0(c-12),140.9(c-13),151.5(c-14),27.8(c-15),24.4(c-16),24.2(c-17),177.2(c-18),72.6(c-19),18.0(c-20),101.8(c-1’),75.3(c-2’),78.4(c-3’),71.7(c-4’),79.1(c-5’),62.8(c-6’),61.3(och3)。經查文獻比較，以上波譜數據與文獻(陳玉,楊光忠,趙松,李援朝.雷公藤二萜成分研究[j].林產化學與工業,2005,25(02):35-38.)報道的雷酚新內酯苷一致，因此確定該化合物為雷酚新內酯苷(結構見式ⅱ)。

三、抗炎藥效學評價

本發明對wilfordosidea和雷酚新內酯苷進行了抗炎藥效學評價。

1.wilfordosidea和雷酚新內酯苷對脂多糖（lps）誘導的大鼠膝關節滑膜原代成纖維細胞炎癥因子白介素1β（il-1β）過量表達的影響實驗。

1.1大鼠膝關節滑膜原代成纖維細胞的培養

雄性sd大鼠（180-220g）乙醚麻醉后處死，75%酒精浸泡15-20分鐘后，取出膝關節滑膜組織，剪碎，利用ii型膠原酶（4mg/ml）消化2h，加入含10%胎牛血清的rpmimedium1640培養，3天左右細胞慢慢爬出，待細胞長至融合狀態后，用0.25%胰酶（含0.1%的edta）消化2分鐘，細胞傳代繼續培養，原代細胞3-6代用于下面的實驗。

1.2測定wilfordosidea和雷酚新內酯苷對lps誘導的膝關節滑膜原代成纖維細胞il-1β表達的影響

wilfordosidea和雷酚新內酯苷用dmso溶解，溶解后母液濃度為10mm，臨用前用磷酸鹽緩沖液（pbs）稀釋到1mm，實驗終濃度為10μm。將細胞以2×10⁶個/ml的濃度接種于48孔板，37℃，5%co2條件下培養至80%的融合狀態，pbs洗滌兩次。換成無血清培養基，加入wilfordosidea或雷酚新內酯苷溶液，使最終濃度為10μm，0.5h后，加入刺激劑lps（10ng/ml）。實驗分為空白組，模型組，wilfordosidea給藥組、雷酚新內酯苷給藥組，陽性對照藥潑尼松龍給藥組（實驗終濃度為10μm）。模型組用刺激劑lps（10ng/ml）造模，給藥組加入對應化合物，每組6個復孔，37℃，5%co2條件下孵育24小時后，按大鼠il-1βelisa試劑盒說明要求進行測定od值，檢測波長450nm。

1.3實驗結果

結果（見表1）表明，模型組il-1β表達與空白組比較有極顯著性升高（p<0.001），說明造模成功。wilfordosidea、雷酚新內酯苷、潑尼松龍給藥組與模型組比較均有極顯著性差異（p<0.001），說明wilfordosidea和雷酚新內酯苷能顯著抑制lps誘導的膝關節滑膜原代成纖維細胞炎癥因子il-1β的過量表達，抑制效果與陽性藥潑尼松龍相當，說明wilfordosidea和雷酚新內酯苷具有明顯的抗炎活性。

表1.wilfordosidea和雷酚新內酯苷對lps誘導的滑膜原代成纖維細胞il-1β表達的影響(±s，n=6)

***與模型組比較p<0.001。

2.wilfordosidea和雷酚新內酯苷對二甲苯引起的小鼠耳腫脹模型影響實驗

wilfordosidea和雷酚新內酯苷用2%丙二醇水溶液溶解。取昆明種小鼠，雌雄各半，體重18-22g，隨機均分成模型組，wilfordosidea給藥組、雷酚新內酯苷給藥組，陽性對照藥吲哚美辛給藥組，每組10只。各給藥組按10mg/kg劑量灌胃給藥，模型組給等體積2%丙二醇水溶液。連續給藥3天，末次給藥后1小時，將20μl二甲苯涂于小鼠右耳廓兩面致炎,左耳不涂為對照。1小時后將小鼠處死，剪下雙耳,用直徑6mm的打孔器分別在同一部位打下圓耳片,稱重。以左右耳片重量差作為腫脹度,計算抑制率。實驗結果見表2，各給藥組的平均耳腫脹度與模型組相比均有顯著性(p<0.01)差異，wilfordosidea和雷酚新內酯苷抑制率分別為61.5%和57.7%，其抑制率高于陽性藥吲哚美辛。實驗結果表明wilfordosidea和雷酚新內酯苷具有顯著的抗炎活性，優于陽性藥吲哚美辛。

表2.wilfordosidea和雷酚新內酯苷對二甲苯引起的小鼠耳腫脹模型影響實驗結果(±s，n=10)

*與模型組比較p<0.01。

四、抗炎藥物制劑制備

wilfordosidea和雷酚新內酯苷或以其為基本活性的藥物組合物可以與藥學上合適的輔料或載體結合，采用公知方法制成注射劑、片劑、膠囊劑、滴丸劑、控釋制劑、緩釋制劑、納米制劑等制劑抗炎藥物。

具體實施方式

下面通過實施例作進一步描述，但本發明并不限于實施例所述范圍。

實施例1：

將雷公藤干燥根119千克切片，加入95%乙醇400升，于70℃加熱回流提取3次（1.5×1.5×1小時）。合并提取液，減壓濃縮回收溶劑得浸膏12kg。浸膏用乙酸乙酯溶解多次，合并乙酸乙酯溶液，減壓濃縮回收溶劑得乙酸乙酯部位1.87kg。

將乙酸乙酯部位浸膏1.87kg，經中性氧化鋁柱色譜層析（200-300目，22.5kg），石油醚-乙酸乙酯（1:0，4:1，3:2，2:3，v/v）及乙酸乙酯-甲醇（1:0，3:1，1:1，0:1，v/v）梯度洗脫，每個流份收集50l，依次得到8個洗脫流份(fr.1~fr.8)。

將fr.7流份（即：上述乙酸乙酯-甲醇1:1洗脫流份）（15.6g）經mcigel-chp20p色譜柱分離，甲醇-水（0:1，1:9，3:7，1:1，7:3，9:1，1:0，v/v）梯度洗脫，依次得7個洗脫流份（fr.7.1~fr.7.7）。

將fr.7.5（即：上述甲醇-水7:3洗脫流份）經sephadexlh-20凝膠柱分離，甲醇洗脫，tlc檢測合并依次得到9個流份（fr.7.5.1~fr.7.5.9）。

取fr.7.5.6（300mg）經制備hplc分離(ymc-actusods-ac18色譜柱，流動相：甲醇-水38:62，檢測波長210nm)，得wilfordosidea（保留時間49.31min）（12mg）。另取fr.7.5.6（300mg）經制備hplc分離(ymc-actusods-ac18色譜柱，流動相：乙腈-水33:67，檢測波長210nm)，得化合物雷酚新內酯苷（保留時間14.86min）（15.2mg）。

實施例2：

wilfordosidea和雷酚新內酯苷的片劑制備：取50mg相應化合物與淀粉25mg，糊精25mg混合，用適量30%乙醇濕潤，常規制粒，加入適量硬脂酸鎂混合，壓片，即得。

實施例3：

wilfordosidea和雷酚新內酯苷的膠囊劑制備：取50mg相應化合物與淀粉60mg，糊精10mg，糖粉10mg混合，用適量30%乙醇濕潤，常規制粒，裝入硬膠囊中，即得。