本發明屬于植物遺傳育種和蘋果種質創新研究領域，具體為一種鑒定嘎拉蘋果后代植株的SSR分子標記VI及其應用。

背景技術：

蘋果（Malus domestica Borkh.）生態適應性強，果品營養價值高，是世界上栽培面積廣、消費量大、經濟效益較好的果樹樹種之一。我國是蘋果栽培面積最廣、總產量最高的國家之一。尤其在我國北方，蘋果是栽培面積最大的果樹樹種，其產量和面積居全國水果之首。這種產業已成為我國許多省市的支柱產業，它們在提高農民收入、促進地方經濟發展中起著越來越重要的作用。蘋果屬自花不孕植物，生產中的蘋果品種均為雜合二倍體品種，蘋果基因組高度雜合、遺傳背景十分復雜、加之其童期漫長，使得常規雜交育種周期長，效率低。

利用純合基因型種質育種則可以大大提高定向育種效率。花藥培養可以獲得單倍體植株，經過染色體加倍后可以迅速得到純合的二倍體種質。由于蘋果是高度雜合的二倍體品種，通常在單一位點由復等位基因控制，即同一位點含有兩種不同的等位基因，而單倍體品種只含一種基因。通過花藥培養所獲得植株，如果其為單倍體起源，應只具有其親本之一的一種等位基因。通過花藥培養可以得到純合的二倍體種質，還可以直接獲得性狀優良的隱性基因材料和誘變育種材料，這些材料對蘋果遺傳育種研究有重要意義。

分子標記技術已經在蘋果主要農藝性狀的早期選擇中應用，如紅肉、紅皮、黑星病、蘋果綿蚜和火疫病等，參與完成蘋果基因組測序工作并聯合開發了8 K（CHAGNé D等，Genome-wide SNP detection, validation, and development of an 8K SNP array for apple[J]. PLoS ONE, 2012, 7: e31745. doi:10.1371/journal.pone.0031745）和20 K（BIANCO L等，Development and validation of a 20K Single Nucleotide Polymorphism（SNP）whole genome genotyping array for apple ( Malus × domestica Borkh) [J]. PLoS One ,2014，9(10): e110377. dio：10.1371/journal.pone.0110377）的蘋果SNP芯片，第1次在世界蘋果育種項目中使用基因組選擇（GS）方法來代替表型篩選加快育種步伐。

簡單序列重復 (simple sequence repeat， SSR) 是一類 1-6bp 核苷酸基序構成重復序列，廣泛分布于真核生物基因組的編碼區、非編碼區，SSR 標記利用簡單序列重復的側翼保守序列設計引物，經過PCR擴增， 根據條帶的大小來反映DNA序列的多態性。與其它分子標記如 RFLP、AFLP ISSR 等相比，SSR 標記具有多態性高、共顯性遺傳、重復性好、特異性強等特點，近年來成為遺傳多樣性研究、遺傳作圖、重要功能基因定位、分子輔助育種等領域應用最多的一種標記。

SSR標記因其具有良好的穩定性和可傳遞性，在果實品質性狀標記篩選、品種鑒定和遺傳連鎖圖譜構建中被廣泛使用（Liu, 等. Identification of apple cultivars on the basis of simple sequence repeat markers. Genet Mol Res, 2014, 13 ( 3) : 7377-7387; Moriya, 等. Aligned genetic linkage maps of apple rootstock cultivar ‘JM7’ and Malus sieboldii ‘Sanashi 63’ constructed with novel EST - SSRs. Tree Genet Genomes, 2012, 8 (4) : 709-723.）。

到目前為止，對于嘎拉蘋果花藥培養植株的SSR分子標記還未見報道。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種鑒定嘎拉蘋果后代植株的SSR分子標記VI及其應用。

本發明是通過以下技術方案實現的：一種鑒定嘎拉蘋果后代植株的SSR分子標記VI，在檢測過程中同時使用，所述分子標記為具有如下所示核苷酸序列的2對SSR引物：

LG13 標記GD147：

上游：5^，- TCCCGCCATTTCTCTGC -3^，

下游：5^，- GTTTAAACCGCTGCTGCTGAAC -3^，

LG16 標記Hi22f06：

上游：5^，- CAATGGCGTCTGTGTCACTC -3^，

下游：5^，- GTTTACGACGGGTAAGGTGATGTC -3^，。

一種鑒定嘎拉蘋果后代植株的SSR分子標記VI的應用，包括以下步驟：

（1）以嘎啦蘋果基因組DNA為PCR擴增模板，分別以上述SSR分子標記為引物對，進行PCR擴增，反應體系為15μL，其中含10×PCR Buffer 1.5 μL、2.5 mM dNTPs mixture 1.2μL、10ng/μL Primers F 1.5μL、10ng/μL Primers R 1.5μL、5U Taq 聚合酶0.15μL、100ng/μL DNA模板0.75 μL，去離子水補足至15μL；（2）擴增程序為：94℃預變性2 min 30 s，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸40 s，35個循環，72℃10 min，4℃保存備用；（3）PCR產物檢測，用8%非變性聚丙烯酰胺電泳，將PCR的每個反應產物加入1/2的非變性Loading Buffer，混勻，150V恒定電壓150min，冰醋酸固定，AgNO₃ 染色拍照；（4）用于遺傳連鎖鑒定時，待測蘋果能擴增出上述2對SSR引物相對應的任意一條特異性條帶，說明待測蘋果種質中含有的遺傳物質位于相應的遺傳連鎖群，反之，則待測蘋果種質含有的遺傳物質不存在相應的遺傳連鎖群；（5）用于花藥培養植株鑒定時，待測蘋果能擴增出上述2對SSR引物中相對應的單獨的一條特異性條帶，說明待測蘋果植株為純合材料，如出現兩條條帶，則待測蘋果植株不是純合材料；（6）用于品種來源鑒定時，待測蘋果能擴增出上述2對SSR引物相對應的任意一條特異性條帶，說明待測蘋果植株來源于嘎拉蘋果，如無特異性條帶擴增出來，則待測蘋果植株不是嘎拉蘋果培育的后代品種。

與現有技術相比，本發明具有以下優點：

1、本發明在國內外首次報道了用SSR分子標記對鑒定材料所處蘋果連鎖群進行鑒定，同時也報道了蘋果的13號和16號染色體上連鎖的SSR分子標記；

2、本發明所述分子標記是共顯性標記，可以快速、準確對嘎拉蘋果遺傳連鎖群、花藥培養植株及嘎啦培育后代品種進行鑒定；

3、這些研究結果為下一步加快嘎拉蘋果與重要農藝性狀連鎖基因的利用及蘋果純合植株遺傳育種提供了分子水平的支持；

4、為快速鑒定嘎拉培育植株進行分子水平驗證提供了方法。

本發明通過對嘎拉蘋果花藥培養植株的13號和16號染色體上連鎖的2對SSR分子標記鑒定，不僅可以系統準確地了解嘎拉蘋果基因型類型及其遺傳多樣性，為豐富與發展蘋果等位基因體系奠定基礎，也為今后科學利用嘎拉蘋果提供理論依據，而且也為鑒定嘎拉蘋果花藥培養植株的基因型，及其純合性進行了佐證。本發明對于蘋果新品種選育及分子標記輔助育種都具有積極的推動作用。同時，本發明篩選出的2對SSR分子標記也為嘎拉蘋果后代品種從分子水平上進行來源驗證提供了支持。

附圖說明

圖1為LG13 標記GD147的毛細管電泳圖譜；圖2為LG16 標記Hi22f06的毛細管電泳圖譜。

具體實施方式

純合基因型對于高等植物遺傳機理研究和育種應用均具有十分重要作用（Murovec, 等. Haploids and doubled haploids in plant breeding. In: Abdurakhmonov I (ed) Plant Breeding: 2012: 87-106.）。蘋果是基因組高度雜合的果樹樹種，利用單倍體基因組可以大大降低基因組的組裝難度（Dunwell. Haploids in flowering plants: origins and ex-ploitation. Plant Biotechnol J，2010，8 ( 4) : 377-424.）。蘋果屬多年生草本植物，生殖周期長，加之自交不親和，導致通過多代自交獲得純合植株的方法難以實現。利用花藥培養誘導產生胚狀體獲得純合基因型株系，對基因型高度雜合的蘋果育種及遺傳分析有重要意義（Germanà. Gametic embryogenesis and haploid technology as valuable support to plant breeding. Plant Cell Rep, 2011，30(5): 839-857；Maria. Doubled haploid production in fruit crops. Plant Cell, Tissue and Organ Culture，2006, 86：131-146.）。通過花藥培養誘導產生胚狀體獲得再生植株，并對獲得的再生植株倍性以及來源進行準確鑒定，對創新種質遺傳分析具有重要意義。為更好地利用這些種質材料，本發明對嘎拉蘋果及其花藥培養獲得的植株進行連鎖群和基因型鑒定，為加快嘎拉蘋果與重要農藝性狀連鎖基因的利用及蘋果純合植株遺傳育種提供了分子水平的支持。

一、嘎拉蘋果花藥培養

4月上旬嘎拉蘋果現蕾后，采取混合采樣的方法，選取生長健壯的嘎拉蘋果成年樹，采集發育良好的花蕾，用密封袋封好置于冰箱4℃冷藏室進行低溫預處理。低溫處理后，將花蕾在超凈工作臺內用0.1%次氯酸鈉滅菌，然后用鑷子從花蕾內取出花藥接種于胚狀體誘導培養基，25℃下暗培養，3~5個月后待胚狀體長至8~10mm，轉移至再生培養基上進行植株再生，并進行繼代培養后經繼代培養、生根培養、馴化、室內移栽獲得再生植株。

二、SSR分子標記分析

1、基因組總DNA提取

選取嘎拉蘋果和嘎拉花藥培育再生植株6株，采用CTAB法（曹秋芬等，2003）分別提取花藥的總DNA。從HiDRAS網站和Okada等構建的蘋果高密度微衛星遺傳圖譜上，選取分布于蘋果13號和16號染色體的2對SSR引物，再生植株連鎖群HIDRAS 標記見表1；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1：

2、PCR擴增

PCR反應體系總體積為為15μL，由其中含10×PCR Buffer 1.5 μL、2.5 mM dNTPs mixture 1.2μL、10ng/μL Primers F 1.5μL、10ng/μL Primers R 1.5μL、5U Taq 聚合酶0.15μL、100ng/μL DNA模板0.75 μL，去離子水補足至15μL；擴增程序為：94℃預變性2 min 30 s，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸40 s，35個循環，72℃10 min，4℃保存備用。

3、PCR產物檢測

用8%非變性聚丙烯酰胺電泳，將PCR的每個反應產物加入1/2的非變性Loading Buffer，混勻，150V恒定電壓150min左右，冰醋酸固定，AgNO3染色拍照。

對8%非變性聚丙烯酰胺電泳獲得的條帶，進行篩選，對在嘎拉及其花藥培養植株中產生多態性的標記進行分析，統計。選取在嘎拉蘋果中兩個等位基因/位點都擴增出條帶，而在嘎拉蘋果花藥培養植株中只有一個等位基因/位點擴增出來條帶的引物。嘎啦蘋果在引物GD147（LG 13）中，擴增產物有140 bp和170 bp的特異性條帶；在引物Hi22f06（LG 16）中，擴增產物有235 bp和241 bp的特異性條帶；結果表明，篩選出分布于第13和第16條染色體上的2對SSR分子標記，在嘎拉蘋果及其花藥培育植株中擴增出等位基因位點。

三、再生株系的染色體倍性分析：取再生植株葉片在500 μL 裂解液中用刀片切碎，靜置2 min后過濾于EP管中，PI染色后用BD Accuri C5 流式細胞儀分析葉片中的DNA含量。以莖尖培養獲得的雜合二倍體“嘎啦”試管苗葉片為倍性鑒定的參考標準。

采用流式細胞儀對成活再生株系進行染色體倍性鑒定。以雜合二倍體“嘎啦”供體為對照，結果表明：除單倍體gala17外，Gala16、Gala18、Gala19、Gala20再生株系均為二倍體。

再生株系的基因型鑒定：

基因組DNA的提取：采用改良CTAB法提取葉片總DNA后，經核酸蛋白儀（Bio-Rad）檢測DNA濃度，再經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA濃度和質量。

對篩選得到引物的5’端TAM、FAM、HEX熒光標記，進行PCR擴增。PCR反應體系為25 μL，含dNTP mixture（10 mM）0.5 μL、10×PCR Buffer 2.5 μL、25 mM MgCl₂ 2.0 μL、rTaq酶（5 U/μL）0.2 μL、DNA模板（100 ng/μL）1 μL 、去離子水 17.8 μL。PCR反應程序為：第一步95℃ 預變性3min；第二步94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，10個循環；第三步95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，20個循環；第四步72℃充分延伸6 min，4℃ 保存。反應板每孔先加入9.9 μL 去離子甲酰胺和 0. 1μL ROX500或LIZ500 分子量內標，再吸取加入50 pg擴增產物加入樣品孔中。98℃變性 5 min，急速冷卻，置放于 ABI 3730XL DNA分析儀上。使用Gene Mapper 軟件分析擴增片段峰型并讀取相應數據。

SSR 鑒定嘎啦再生植株基因型結果見表2，結果顯示，連鎖群上的2個SSR標記顯示雜合體為兩個峰，而再生株系只有其中的一個峰。證明，嘎啦再生株系除單倍體gala17外，Gala16、Gala18、Gala19、Gala20均為純合基因型植株。

再生株系植物學觀察：對再生植株試管苗進行植物學特征調查。再生植株植物學觀察結果見表3，表3結果顯示嘎啦雜合供體株高為5.67 cm（n=1）和純合二倍體平均株高 2.96 cm ± 0.44 cm（n=28）。同時我們也觀察到純合二倍體長勢相對于嘎啦雜合供體較弱。不同二倍體純合植株的植物學特征也存在差異，Gala18葉片較小，葉數較多。

表3：

四、結果與分析

單倍體育種是獲得優勢親本供體材料的最有效方法之一。花藥的花藥壁是雜合體細胞，同時也可能誘導成雜合二倍體的再生植株，所以獲得的二倍體植株并非一定為純合體。通過鑒定再生植株的等位基因就可以把花藥培養再生植株的雜合二倍體和純合二倍體區分開。以前的技術包括同工酶標記、S等位基因及SSR分子標記都曾被應用于花藥再生植株的純合性鑒定。本發明也采用了SSR鑒定方法。首先選用的SSR標記（來自HIDRAS數據庫（http://www.hidras.unimi.it/））對所有的再生植株進行PCR擴增，篩出可區分再生植株為純合的SSR標記。為了進一步區分再生植株的基因型，我們又篩選出分布于蘋果13號和16號染色體上連鎖群的SSR標記。這個SSR標記能明確標記“嘎啦”蘋果不同的植株，為今后進行“嘎啦”蘋果的基因型鑒定提供了技術指標。

親本蘊含的等位基因在花藥培養來的植株中能檢測到，但是花藥培養來的植株中只有一個等位基因/位點擴增出來。這表明花藥培養來的植株其基因型是純合的，即來源于親本的單倍體。

五、結論

通過花藥培養還可獲得倍性豐富的純合體植株，這為今后開展蘋果倍性遺傳育種研究提供了豐富的試材。

本發明獲得的再生株系以及SSR鑒定體系對分析鑒定“嘎啦”優良性狀基因研究，田間嫁雜交育種，以及表型-基因型關聯分析具有重要意義。

下一步結合嘎拉蘋果全基因組測序結果，在基因組范圍內對親本及其花藥培養植株進行更為徹底的分析和比較，以便解析嘎拉蘋果重要性狀（特性）的分子機制。

序列表

〈110〉山西省農業科學院生物技術研究中心、山西省農業科學院果樹研究所、山西省農業科學院農業資源與經濟研究所

〈120〉一種鑒定嘎拉蘋果后代植株SSR分子標記VI及其應用

〈160〉4

〈210〉1

〈211〉17

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈220〉

〈223〉LG13 標記GD147的上游引物

〈400〉1

TCCCGCCATTTCTCTGC

〈210〉2

〈211〉22

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈220〉

〈223〉LG13 標記GD147的下游引物

〈400〉2

GTTTAAACCGCTGCTGCTGAAC

〈210〉3

〈211〉20

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈220〉

〈223〉LG16 標記Hi22f06的上游引物

〈400〉3

CAATGGCGTCTGTGTCACTC

〈210〉4

〈211〉24

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈220〉

〈223〉LG16 標記Hi22f06的下游引物

〈400〉4

GTTTACGACGGGTAAGGTGATGTC