本發明涉及基因工程領域,尤其是涉及一種Candida amazonensis FLP/FRT基因敲除系統。
背景技術:
Candida amazonensis是近年來從亞馬遜森林中新分離出的一株能夠高效利用木糖的酵母,該酵母能夠代謝多種糖類,同時具有發酵纖維二糖、海藻糖等的能力(Cadete RM,Melo MA,Lopes MR,Pereira GM,Zilli JE,Vital MJ,Gomes FC,Lachance MA,Rosa CA.Candida amazonensis sp.nov.,an ascomycetous yeast isolated from rotting wood in the Amazonian forest.International journal of
systematic and evolutionary microbiology,2012,62(Pt 6):1438-1440.)。Cadete等(Cadete RM,Melo MA,Dussan KJ,Rodrigues RC,Silva SS,Zilli JE,Vital MJ,
Gomes FC,Lachance MA,Rosa CA.Diversity and physiological characterization of D-xylose-fermenting yeasts isolated from the Brazilian Amazonian Forest.PLoS
ONE,2012,7(8):e43135.)在研究中發現Candida amazonensis具有快速代謝木糖的能力,并在木糖醇生產方面表現出一定優勢。實驗室前期研究注意到該酵母能夠分別在高木糖濃度(350g/l)、高溫42℃、pH 2.5等脅迫條件下仍能有效發酵木糖并積累較高的生物量,表現出良好的耐高糖、耐高溫以及耐酸性能。有望成為新型木糖發酵模式菌株(范賀超,張梁,李贏,等.五株木糖利用酵母的生理代謝特性.微生物學報,2015,55(8):1026-1035.)
然而,良好的模式菌株,除自身具有的優良特性外,還需要基因表達與敲除等基本的分子生物學手段的有效支持,用以充分挖掘相關菌株優良信息。目前,Candida amazonensis基因水平上的研究尚處于起步階段,至今還未有全基因組測序的工作展開。此外,由于該酵母屬于利用木糖類酵母,使用特殊的基因編碼系統,即密碼子CTG編碼的是絲氨酸而非常見的亮氨酸(Wohlbach DJ,Kuo A,Sato TK,Potts KM,Salamov AA,Labutti KM,Sun H,Clum A,Pangilinan JL,Lindquist EA,Lucas S,Lapidus A,Jin M,Gunawan C,Balan V,Dale BE,Jeffries TW,Zinkel R,Barry KW,Grigoriev IV,Gasch AP.Comparative genomics of xylose-fermenting fungi for enhanced biofuel production.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2011,108(32):13212-13217.),這使得常規表達系統所對應的一些載體元件包括篩選標記、報告基因等難以有效用于該CTG類酵母中。
本實驗室前期利用定點突變后(CDS區9個CTG突變為亮氨酸密碼子TTG)的潮霉素抗性基因hphm和綠色熒光蛋白基因gfpm(1個CTG突變為TTG)以及來自Spathaspora passalidarum酵母的啟動子、終止子等元件成功構建了一個適用于Candida amazonensis的整合型表達載體PRACTH-gfpm,然而,有限的篩選標記很難滿足人們對于代謝工程育種的要求。因此,對于新型木糖利用酵母Candida amazonensis,目前急需一個篩選標記可重復使用的基因敲除系統來在菌種改造方面對其進行更深入的研究。
位點特異性重組系統,如FLP/FRT或Cre-loxp等,就是一種能夠實現篩選標記基因回收的有效工具。近年來,在CTG類酵母中發展起來的FLP/FRT位點特異性重組系統,因重組效率和靶向性高、可快速準確地實現抗性消除而受到眾多研究者的青睞。
FLP/FRT系統由FLP重組酶和FRT識別位點兩部分組成。FLP是1個48kDa的多肽單體蛋白,其可以介導34bp的FRT重復序列位點特異性重組,切除同向重復的2個FRT位點間的DNA片段和1個FRT位點,保留另一個FRT位點。早在1999年Staib等(Staib P,KretSchmar M,Nichterlein T,et al.Host‐induced,stage‐specific virulence gene activation in Candida albicans during infection[J].Molecular microbiology,1999,32(3):533-546.)就選擇在Candida albicans中將密碼子修飾過后(3個CTG突變為TTG)的FLP重組酶基因置于SAP2(與分泌天門冬氨酰蛋白酶有關)的啟動子下進行調控,并在FLP表達盒和霉酚酸抗性標記基因(IMH3R)兩端添加同向重復的FRT位點,由此構建的敲除系統在SAP2啟動子對FLP酶的調控下,實現兩個FRT位點之間片段的切除。
同年,MorSchhauser等(J,Michel S,Staib P.Sequential gene disruption in Candida albicans by FLP‐mediated site‐specific recombination[J].Molecular microbiology,1999,32(3):547-556)在抗性標記被URA3營養缺陷型標記替代的基礎上,使用同樣的技術在C.albicans中進行了連續分別兩輪敲除CDR4基因和MDR1基因,獲得突變純合株,成功實現了FLP/FRT系統在Candida albicans中抗性重復使用和多基因連續敲除方面的應用。
此外,Sanchez-Martinez等(Sanchez-Martinez C,Perez-Martin J.Site-specific targeting of exogenous DNA into the genome of Candida albicans using the FLP recombinase[J].Molecular Genetics and Genomics,2002,268(3):418-424)和Reuss等(ReuβO,VikKolter R,et al.The SAT1flipper,an optimized tool for gene disruption in Candida albicans[J].Gene,2004,341:119-127.)選擇用一個Candida albicans自身來源的麥芽糖誘導型啟動子MAL2(替換前面的SAP2)構建的FLP/FRT系統也成功實現了Candida albicans中同向FRT位點之間序列的刪除,其中FLP重組酶的表達受麥芽糖的誘導,因此通過培養基中麥芽糖的有無就可以實現對FLP表達的調控,從而可實現對FRT位點間片段切除在時空順序上的控制。
在這基礎上,當Ding&Butler等人(Ding C,Butler G.Development of a gene knockout system in Candida parapsilosis reveals a conserved role for BCR1in biofilm formation[J].Eukaryotic cell,2007,6(8):1310-1319.)將該敲除系統應用于Candida parapsilosis中時,發現只有將CaMAL2啟動子替換成宿主自身來源的CpMAL2時,才能有效行使其功能。而讓人意外的是,Gacser等人(Gácser A,Trofa D,W,et al.Targeted gene deletion in Candida parapsilosis demonstrates the role of secreted lipase in virulence[J].The Journal of clinical investigation,2007,117(10):3049-3058)和Nguyen等人(Nguyen L N,Trofa D,Nosanchuk J D.Fatty acid synthase impacts the pathobiology of Candida parapsilosis in vitro and during mammalian infection[J].PloS one,2009,4(12):e8421)在后來被相繼報道稱不需改變MAL2啟動子序列,便可在Candida parapsilosis中成功實現由FLP重組酶介導的敲除。
基于以上FLP/FRT系統在CTG類酵母中的研究應用,對于能夠在Candida amazonensis中適用的FLP/FRT敲除系統的獲得,其關鍵在于擁有一個能嚴格調控FLP酶表達的啟動子,目前,已有不少調控型啟動子被克隆及功能鑒定,其中研究頻率比較高的誘導型啟動子包括釀酒酵母來源的受葡萄糖抑制、半乳糖誘導的GAL1和GAL10啟動子(Guarente L,Yocum R R,Gifford P.A GAL10-CYC1hybrid yeast promoter identifies the GAL4regulatory region as an upstream site[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,1982,79(23):7410-7414.);釀酒酵母來源的受葡萄糖抑制、麥芽糖誘導的MAL62(Finley R L,Zhang H,Zhong J,et al.Regulated expression of proteins in yeast using the MAL61–62promoter and a mating scheme to increase dynamic range[J].Gene,2002,285(1):49-57.)和白色假絲酵母來源的MAL2(ReuβO,VikKolter R,et al.The SAT1flipper,an optimized tool for gene disruption in Candida albicans[J].Gene,2004,341:119-127.);以及受木糖誘導的XYL啟動子(Kopke K,Hoff B,Kück U.Application of the Saccharomyces cerevisiae FLP/FRT recombination system in filamentous fungi for marker recycling and construction of knockout strains devoid of heterologous genes[J].Applied and environmental microbiology,2010,76(14):4664-4674.)等等,這些啟動子的誘導或抑制效果都比較明顯,但大多數啟動子在非誘導條件下甚至是抑制的條件下仍然有一定量的基礎表達,難以達到嚴格誘導的標準,具有一定的局限性。此外,不同來源的啟動子或者不同的表達宿主因為其遺傳背景不同,可能導致啟動子的行使功能有差異。
技術實現要素:
針對現有技術存在的上述問題,本申請提供了適用于Candida amazonensis的嚴格誘導型啟動子SpGAL1p(受半乳糖誘導)或SpMAL1p(受麥芽糖誘導),誘導調控FLP基因,構建抗性標記可重復利用的FLP/FRT基因敲除系統,能夠用于高效地連續敲除Candida.amazonensis內目的基因,為菌株的代謝工程改造提供了強有力的技術手段。
本發明的技術方案如下:
一種Candida amazonensis的FLP/FRT基因敲除方法,包括構建基因敲除盒以及消除潮霉素抗性基因;所述潮霉素抗性基因的消除是指通過添加誘導劑誘導FLP酶表達,以切除FRT位點之間的FLP表達盒和潮霉素抗性基因表達盒。
所述方法具體包括以下步驟:
(1)構建基因敲除盒,敲除盒從5’-3’依次包括以下核心元件:靶基因上游同源臂、FRT位點、嚴格誘導型啟動子SpGAL1p或SpMAL1p、caFLP重組酶基因、SpCyC1t終止子、潮霉素抗性基因hphm表達盒、FRT位點、靶基因下游同源臂;
(2)用基因敲除盒轉化Candida amazonensis,得到靶基因敲除的陽性克隆;
(3)將陽性克隆接種于誘導培養基,誘導FLP重組酶基因表達,切除同向FRT位點之間的DNA片段。
其中,所述靶基因為PDC基因,編碼丙酮酸脫羧酶,該基因編碼序列如SEQ ID NO:1所示;
所述的FRT位點的序列如SEQ ID NO:2所示;
所述的嚴格誘導型啟動子SpGAL1p為Spathaspora passalidarum來源的β-半乳糖苷酶基因GAL1啟動子,受半乳糖誘導,該啟動子的DNA序列如SEQ ID NO:3所示;
所述的嚴格誘導型啟動子SpMAL1p為Spathaspora passalidarum來源的α-麥芽糖苷酶基因MAL1啟動子,受麥芽糖誘導,該啟動子的DNA序列如SEQ ID NO:4所示;
所述的caFLP為適用于Candida amazonensis的重組酶基因,該基因的編碼序列如SEQ ID NO:5所示;
所述的SpCyC1t終止子為Spathaspora passalidarum來源的細胞色素C基因CYC1終止子,該終止子的DNA序列如SEQ ID NO:6所示;
所述的潮霉素抗性基因hphm表達盒,其DNA序列如SEQ ID NO:7所示。
特別的,所述caFLP可以指將釀酒酵母來源的FLP重組酶基因內含有的3個CTG密碼子突變為TTG,使得在Candida amazonensis內編碼的是亮氨酸,而非絲氨酸。
優選的,步驟(1)中所述構建基因敲除盒由以下具體步驟得到:
(1)以Candida amazonensis基因組為模板,用序列為SEQ ID NO:8的引物PDC-1和序列為SEQ ID NO:9的引物PDC-2擴增PDC基因5’端360bp的上游序列PDC-L,在片段上游引入酶切位點Stu I,片段下游引入酶切位點Kpn I;利用序列為SEQ ID NO:10的引物PDC-3和序列為SEQ ID NO:11的引物PDC-4擴增PDC 3’端400bp的下游序列PDC-R,片段上游引入酶切位點Kpn I,片段下游引入酶切位點Stu I;用重疊延伸PCR法將PDC-L和PDC-R序列拼接獲得PDC基因同源重組片段PDCL-R;
(2)將PDCL-R連接至PMD19-T simple載體,轉化感受態E.coli JM109,獲得陽性克隆,命名為Ts-PDCLR;提取質粒Ts-PDCLR,用Kpn I酶切,去磷酸化后備用;
(3)以Spathaspora passalidarum基因組DNA為模板,用序列為SEQ ID NO:12的引物SpGAL1p-F和序列為SEQ ID NO:13的引物SpGAL1p-R PCR擴增啟動子SpGAL1p,片段上游引入酶切位點Kpn I,下游引入Sal I;以序列為SEQ ID NO:14的引物SpMAL1p-F和序列為SEQ ID NO:15的引物SpMAL1p-R PCR擴增啟動子SpMAL1p,片段上游引入酶切位點BamH I,下游引入Sal I;
(4)將純化的片段SpGAL1p和重組質粒PRACTH-gfpm分別用Bgl II和Sal I雙酶切,將酶切產物分別純化后過夜連接,轉化E.coli JM109感受態細胞,涂布于100μg/mL氨芐青霉素的LB平板上,挑選單菌落,獲得重組質粒命名為SpGAL1p-gfpm;將純化的片段SpMAL1p用BamH I和Sal I雙酶切,質粒PRACTH-gfpm用Bgl II和Sal I雙酶切,二者的酶切產物分別純化后過夜連接,其中BamH I和Bgl II是同尾酶,轉化E.coli JM109感受態細胞,涂布于100μg/mL氨芐青霉素的LB平板上,挑選單菌落,獲得重組質粒命名為SpMAL1p-gfpm;
(5)對重組質粒SpGAL1p/SpMAL1p-gfpm和Ts-caFLP分別用Sal I和Not I雙酶切,將酶切產物分別純化后過夜連接,轉化E.coli JM109感受態細胞,涂布于100μg/mL氨芐青霉素的LB平板上,挑選單菌落,獲得重組質粒SpGAL1p/SpMAL1p-caFLP;
(6)以質粒SpGAL1p-caFLP為模板,用序列為SEQ ID NO:16的引物FRT-1和序列為SEQ ID NO:17的引物FRT-2擴增帶有FRT位點的片段FRT-SpGAL1p-caFLP-SpCyC1t-hphm-FRT,片段上、下游引入酶切位點Kpn I;以質粒SpMAL1p-caFLP為模板,用序列為SEQ ID NO:18的FRT-3和序列為SEQ ID NO:17的FRT-2擴增帶有FRT的片段FRT-SpMAL1p-caFLP-SpCyC1t-hphm-FRT,片段上、下游引入酶切位點Kpn I;
(7)上述帶有FRT的片段經Kpn I酶切并純化后,分別與步驟(2)中備用的Ts-PDCLR經T4DNA連接酶連接,轉化感受態E.coli JM109,獲得陽性克隆Ts-PDCL-FRT-SpGAL1p/SpMAL1p-caFLP-hphm-FRT-PDCR,簡稱為Ts-PRFg HRP或Ts-PRFmHRP,該同源重組載體通過Stu I酶切后割膠回收同源重組片段PDCL-FRT-SpGAL1p/SpMAL1p-caFLP-hphm-FRT-PDCR即PRFgHRP/PRFmHR P備用。
優選的,步驟(2)的具體操作方法為:將基因敲除盒經醋酸鋰介導法轉入Candida amazonensis中,涂布含900μg/mL潮霉素即Hygromycin B的平板篩選得到轉化子;在通過更高濃度的潮霉素抗性平板進行轉化子篩選后,進一步獲取陽性轉化子。
優選的,所述誘導培養基分為兩種:
當選擇用SpGAL1p啟動子來誘導FLP的表達時,所對應的誘導培養基為半乳糖誘導培養基YEPG;
當選擇用SpMAL1p來誘導FLP的表達時,所對應的誘導培養基則為麥芽糖誘導培養基YEPM。
優選的,所述誘導培養基的組成為:
半乳糖誘導培養基YEPG:蛋白胨20,酵母提取物10,半乳糖20,單位為g/L;用于固體培養基時添加1.6%的瓊脂粉;
麥芽糖誘導培養基YEPM:蛋白胨20,酵母提取物10,麥芽糖20,單位為g/L;用于固體培養基時添加1.6%的瓊脂粉。
優選的,所述的宿主酵母Candida amazonensiss保藏于荷蘭真菌菌種保藏中心,保藏編號為CBS 12363。
本發明有益的技術效果在于:
本發明提供的適用于Candida amazonensis的FLP/FRT基因敲除系統,利用嚴格誘導型啟動子SpGAL1p或SpMAL1p控制重組酶caFLP的表達,在FLP表達盒和hphm抗性基因表達盒兩端添加同向重復的FRT位點,以PDC為靶基因構建敲除盒整合到Candida amazonensis基因組中,后續通過添加誘導劑誘導FLP表達,切除FRT位點間FLP和hphm表達盒。
本發明提供的敲除系統可以用于連續敲除多個基因。應用本發明,我們成功敲除了Candida amazonensis的PDC基因,并實現了潮霉素抗性的消除,抗性消除后的轉化子遺傳穩定,形態正常。
本發明只需要一次同源重組和后續的培養基誘導便可獲得重組酶基因和抗性基因一同被切除的靶基因敲除株,而不需要另外轉入一個攜帶重組酶的游離質粒,如Cre-Loxp系統中攜帶Cre酶的PSH47質粒。并且只需要一個可用的抗性標記便可完成多個基因的連續敲除。
本發明基因敲除株與其出發菌株相比,除了目的基因的部分或完全缺失及多了一個34bp的FRT位點外,無其他基因上的差異。該敲除系統可以直接以野生型菌株為改造對象,不需要利用URA3或HIS1、ARG4等營養缺陷型菌株,一方面省去了營養缺陷型菌株的篩選過程,也避免了回復突變等問題;另一方面由于URA3等基因的缺失會改變菌株的表型,這可能會導致其對突變株有其他未知的影響。
基因敲除以后的菌株性狀穩定,發酵、生長不受影響。
附圖說明
圖1為實施例1的定點突變后FLP基因CDS序列(表示定點突變位點);
圖2為實施例2的重組載體Ts-PRFg/mHRP的質粒圖譜;
圖3為PDC基因敲除流程圖;
圖4為Candida amazonensis PDC基因敲除株的PCR驗證圖;
圖5為原始菌株Candida amazonensis及PDC敲除株在含900μg/mL潮霉素(Hyg)的YEPD平板上的生長狀況圖。
具體實施方式
下面結合附圖和實施例,對本發明進行具體描述。
實施例1重組酶基因FLP的定點突變
以Saccharomyces cerevisiae為模板,用引物FLP-F(SEQ ID NO:19)和FLP-R(SEQ ID NO:20)PCR擴增獲得FLP基因序列(序列上游引入酶切位點Sal I,序列下游引入酶切位點Not I),連接PMD 19-T simple載體,轉化感受態E.coli JM109,獲得重組子Ts-FLP。以質粒Ts-FLP為模板,采用Stratagene定點突變試劑盒(購自安捷倫科技有限公司),分別使用引物FLP-1(SEQ ID NO:21)和FLP-2(SEQ ID NO:22);FLP-3(SEQ ID NO:23)和FLP-4(SEQ ID NO:24);FLP-5(SEQ ID NO:25)和FLP-6(SEQ ID NO:26)經過3輪PCR定點突變,,獲得環狀PCR產物。擴增條件為:95℃預變性2min,95℃變性30s,55℃退火2min,68℃延伸4min,30個循環,68℃充分延伸5min。將上述PCR產物純化后用內切酶Dpn I于37℃消化30min,于65℃反應15min以失活內切酶Dpn I。將酶切產物純化后,轉化E.coli JM109感受態細胞(購自北京全式金公司),涂布于LB(100μg/mL氨芐青霉素)平板上,挑選單菌落,提取質粒后送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序,挑選突變位點正確的質粒。經過上述突變操作后,突變質粒命名為Ts-caFLP,其中突變后FLP的CDS序列如圖1所示。
實施例2PDC基因敲除盒的構建
(1)以Candida amazonensis基因組為模板,用引物PDC-1(SEQ ID NO:8)和PDC-2(SEQ ID NO:9)擴增PDC基因5’端360bp的上游序列PDC-L,在片段上游引入酶切位點Stu I,在片段下游引入酶切位點Kpn I;利用引物PDC-3(SEQ ID NO:10)和PDC-4(SEQ ID NO:11)擴增PDC 3’端400bp的下游序列PDC-R,片段上游引入酶切位點Kpn I,片段下游引入酶切位點Stu I;用重疊延伸PCR法將PDC-L和PDC-R序列拼接獲得PDC基因同源重組片段PDCL-R。
(2)將PDCL-R連接PMD19-T simple載體,轉化感受態E.coli JM109,獲得陽性克隆,命名為Ts-PDCL-R。提取質粒Ts-PDCLR,用Kpn I酶切,去磷酸化后備用。
(3)以Spathaspora passalidarum基因組DNA為模板,用引物SpGAL1p-F(SEQ ID NO:12)和SpGAL1p-R(SEQ ID NO:13)PCR擴增啟動子SpGAL1p,片段上游引入酶切位點Kpn I,下游引入Sal I;以引物SpMAL1p-F(SEQ ID NO:14)和SpMAL1p-R(SEQ ID NO:15)PCR擴增啟動子SpMAL1p,片段上游引入酶切位點BamH I,下游引入Sal I。
(4)將純化的片段SpGAL1p和重組質粒PRACTH-gfpm分別用Bgl II和Sal I雙酶切,將酶切產物分別純化后過夜連接,轉化E.coli JM109感受態細胞,涂布于LB(100μg/mL氨芐青霉素)平板上,挑選單菌落,獲得重組質粒命名為SpGAL1p-gfpm;將純化的片段SpMAL1p用BamH I和Sal I雙酶切,質粒PRACTH-gfpm用Bgl II和Sal I雙酶切,二者的酶切產物分別純化后過夜連接(BamH I和Bgl II是同尾酶),轉化E.coli JM109感受態細胞,涂布于LB(100μg/mL氨芐青霉素)平板上,挑選單菌落,獲得重組質粒命名為SpMAL1p-gfpm。
(5)對重組質粒SpGAL1p/SpMAL1p-gfpm和Ts-caFLP分別用Sal I和Not I雙酶切,將酶切產物分別純化后過夜連接,轉化E.coli JM109感受態細胞,涂布于LB(100μg/mL氨芐青霉素)平板上,挑選單菌落,獲得重組質粒SpGAL1p/SpMAL1p-caFLP。
(6)以質粒SpGAL1p-caFLP為模板,用引物FRT-1(SEQ ID NO:16)和FRT-2(SEQ ID NO:17)擴增帶有FRT位點的片段FRT-SpGAL1p-caFLP-SpCyC1t-hphm-FRT,片段上、下游引入酶切位點Kpn I;以質粒SpMAL1p-caFLP為模板,用FRT-3(SEQ ID NO:18)和FRT-4(SEQ ID NO:17)擴增帶有FRT的片段FRT-SpMAL1p-caFLP-SpCyC1t-hphm-FRT,片段上、下游引入酶切位點Kpn I。
(7)上述帶有FRT的片段經Kpn I酶切并純化后,分別與步驟(2)中備用的Ts-PDCLR經T4DNA連接酶連接,轉化感受態E.coli JM109,獲得陽性克隆Ts-PDCL-FRT-SpGAL1p/SpMAL1p-caFLP-hphm-FRT-PDCR(簡稱為Ts-PRFg/mHRP),其質粒圖譜如圖2所示。該同源重組載體通過Stu I酶切后割膠回收同源重組片段PDCL-FRT-SpGAL1p/SpMAL1p-caFLP-hphm-FRT-PDCR(PRFgHRP/PRFmHRP)備用。
實施例3PEG/LiAc法轉化Candida amazonensis CBS 12363
(1)于YPD平板中挑取Candida amazonensis CBS 12363單菌落,接種于20mL YPD培養基中,于100mL搖瓶中30℃過夜培養;
(2)將過夜培養的新鮮菌液接種于50mLYPD培養基中,于250mL搖瓶中30℃,200rpm培養,至菌液OD600到1.2左右;
(3)5000rpm室溫離心5min,收集菌體細胞;
(4)將細胞重新懸浮于500μL 0.1mol/L的LiAc中,離心,棄上清,獲得感受態細胞;
(5)在感受態細胞中按順序加入下列轉化混合液:240μL 50%PEG3350,36μL 1.0mol/L LiAc,25μL鮭魚精DNA,50μL待轉化線性DNA,其中鮭魚精DNA沸水浴10min后立即冰浴;
(6)劇烈振蕩每個反應管直至細胞完全混勻;
(7)置于30℃溫育1h;
(8)置于42℃金屬浴熱擊22min;
(9)待降至室溫后,5000rpm離心5min,棄上清;
(10)加入1mL YPD培養基,于30℃后培養2h;
(11)5000rpm離心5min,棄掉800μL上清,混勻菌體并涂布潮霉素(900μg/mL)抗性平板,30℃培養2-3d,獲得轉化子。
實施例4Candida amazonensis PDC基因敲除株的鑒定
利用引物PDC-1(SEQ ID NO:8)和PDC-4(SEQ ID NO:11)鑒定PDC基因的敲除:敲除盒成功整合上PDC位點的敲除株,其PCR產物為敲除盒片段,大小為5.4kb,而原始菌株的PCR結果為1.7kb的PDC基因條帶;
利用引物FLP-F(SEQ ID NO:19)和FLP-R(SEQ ID NO:20)鑒定PDC基因的敲除:敲除株的PCR產物為1.3kb左右的DNA條帶,而原始菌株則顯示無條帶。
PDC敲除株的PCR驗證如圖4所示。圖中泳道M為DL 15 000DNA marker,泳道1-3為以引物PDC-1和PDC-4進行的PCR擴增;泳道4-5為以引物FLP-F和FLP-R進行的PCR擴增。(其中泳道1為野生菌株Candida amazonensis CBS12363;泳道2和4為抗性未消除的PDC敲除株;泳道3和5則為抗性已成功消除的PDC敲除株)。
實施例5Candida amazonensis抗性基因的消除與驗證
陽性克隆在固體誘導培養基上分離純化2-3次后(其中PRFgHRP敲除株對應的誘導培養基為YEPG;PRFmHRP敲除株對應的誘導培養基為YEPM);挑取單菌落同時點板于含潮霉素和不含潮霉素的YEPD平板,篩選普通YEPD平板上生長而含潮霉素抗性板上不生長的單菌落,如圖5所示。圖中W為野生菌株Candida amazonensis CBS 12363;01為抗性未消除的PDC敲除株;02則為抗性已成功消除的PDC敲除株。
提取其染色體,用引物PDC-1(SEQ ID NO:8)和PDC-4(SEQ ID NO:11)進行PCR擴增,抗性消除株,其PCR產物大小為0.8kb左右;用引物FLP-F(SEQ ID NO:19)和FLP-R(SEQ ID NO:20)進行PCR擴增,無產物擴增出。
抗性基因消除的PCR驗證如圖4所示。圖中泳道M為DL 15 000DNA marker,泳道1-3為以引物PDC-1和PDC-4進行的PCR擴增;泳道4-5為以引物FLP-F和FLP-R進行的PCR擴增。(其中泳道1為野生菌株Candida amazonensis CBS12363;泳道2和4為抗性未消除的PDC敲除株;泳道3和5則為抗性已成功消除的PDC敲除株)。
對PCR驗證正確的抗性消除株,將其0.8kb大小的PCR產物送上海生工生物工程進行測序,對測序結果(SEQ ID NO:27)分析,表明其為PDCL-FRT-PDCR片段序列,進一步表明FRT位點之間的片段已成功被切除。
上述結果表明成功敲除了Candida amazonensis的PDC基因,并實現了潮霉素抗性的消除,抗性消除后的轉化子遺傳穩定,形態正常,可作為出發菌株進行后續基因改造。
本發明提供了適用于Candida amazonensis的嚴格誘導型啟動子SpGAL1p(受半乳糖誘導)或SpMAL1p(受麥芽糖誘導),誘導調控FLP基因,構建了抗性標記可重復利用的FLP/FRT基因敲除系統,并通過敲除PDC基因成功驗證了該系統在Candida amazonensis中的應用,為菌株的代謝工程改造提供了強有力的技術手段。
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<210> 1
<211> 1733
<212> DNA
<213> candida amazonensis
<400> 1
atgtcggaaa tttctttagg tagatatctt tttgaaagat tacatcaatt agaagttaac 60
acaattttcg gtgttccagg tgattttaat ttatcacttt tggataagat ctatgaagtt 120
gaagatgctc atggaaaaaa ctctcttaaa tgggctggta atgctaatga attaaatgct 180
gcttatgctg cagatggtta ttccagagtt aaaggtttag gttgtatagt tacaactttt 240
ggtgttggtg aattatcagc tcttaatggt attgctggtt cttatgctga acatgttggt 300
gttttacatg ttgttggtgt tccatcaatt agttctcaag ctaaacaatt attattacat 360
catactttag gtaatggtga ttttactgtt ttccatagaa tgtcaaataa tatcagtcaa 420
actactgctt ttatttctga tattaattct gctcctgctg aaattgatag atgtattaga 480
actgcttata tcagacaaag accagtttat ttaggtttac cagctaattt agttgattta 540
cttgttccag cctcattatt aaatactcca attgatttat ctttacaacc aaatgatcca 600
gatgctcaag aagaagttat tgaaactgtt ttggaattaa ttcataaagc tgaaaatcca 660
gttattttgg ttgatgcttg tgcttcaaga catggatgta aagaagaagt tcgtaaatta 720
gtagaaacaa ctcaattccc agttttcact actccaatgg gtaaaggtgt tgttgatgaa 780
ggcggagttg atggtgaatt attagaaaat gatccaaatt tgatttcaaa agttgcagct 840
agattagttt ctggtaagag tgtttcttca agattcggtg gtgtttatgt tggtacttta 900
tctaaaccag aagttaaaga atttgttgaa aatgctgatt taattttatc ggttggtgct 960
atattgtccg atttcaatac tggttctttc tcttattcat acaaaaccaa aaaatattgt 1020
tgaattccat tctgatcata ctaagattag acaagctact ttcccaggtg ttcaaatgaa 1080
agaagcttta caaaatttga attcaagagt tgcaccagct gctgctcatt ataaagttaa 1140
accagttcca aagattaaat tagctaatac tccagctact ggaaatgtta aattaactca 1200
agaatggtta tggactaaag tttcttcatg gtttagagaa ggtgatatca ttattactga 1260
aactggtaca tcagcttttg gtattgttca atctagattc ccaaataaca ctattggtat 1320
ttctcaagtt ttatggggtt ccattggttt ctctgttggt gccactttag gtgcagtaat 1380
ggcagctcaa gaaattgatc caaataagag agttatttta tttgttggtg atggttcttt 1440
acaattaaca gttcaagaaa tttctacaat gattagatgg aatactactc catatctttt 1500
cgttttaaat aatgatggtt atactattga aagattgatt catggtgaaa ctgccacata 1560
taatgatatt caaccatggg aaaacttagc tttattacca acttttaaag ctactcatta 1620
tgatgccatt agagttgcaa ctgttggtga agctgaagat ttatttaaga ataaagaatt 1680
tggtaagaac tccaagatta gattaattga agttatgttg ccaagaatgg atg 1733
<210> 2
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gaagttccta ttctctagaa agtataggaa cttc 34
<210> 3
<211> 1198
<212> DNA
<213> Spathaspora passalidarum
<400> 3
aggggttgga agaagaaaaa atcggcacga tctgtggtga aaatatatcg tggtgagacc 60
gatgaaaaag tggagagtct ttcaaacaaa aggtctaacc ggtggattga caatgtgtgg 120
aaaaaaaata tttgatgatc tggggggtgg aaggtagttc caaaattatg cgctggaaaa 180
aaaaacagtg ccagggaaaa tgcaacgttg tacttttcag gaaaaatcta tgggagattg 240
gcgagaatta tcctgattat ttttacttga tctatctcta aacaatccaa gggtatagtt 300
cgcgggataa tttacacccc ctgttgatcg ccctatgact gataaacaaa attcagacta 360
cttttttttt tttatttaac acaataataa cagtgaatgc attaacggca aaataaaatt 420
tgtttgccac aaattgcctt gacacatacc aaaagtacga gtggataaaa gaaattggat 480
caaggtaatg atagcagaca atgaatttgt ttcagccacc actgaattgc cgcaatactt 540
caattaaact tttgtctatc tttgatgttg ggttgtatat gtaatagtgg ttattactga 600
gcggagttat ttattatttg gtctcctgaa ccatgagccg ttacttgagt tcgtgatcat 660
gtgttgttct tgttagcttt tctttttaag taagatcaac tgaaatccaa agtagcatga 720
cgtacaaact gcagatacca taccaaccac tccacagcaa aaacacccaa aagcagtaac 780
caatgtttac atgggccaat tccctataca gatccatgca catactgttt acataaacag 840
gtgattttgc cgtatgcatg ttttccgtgg agaggagatt atccggatat aatctgatcc 900
ccccgatctt cggcgcatgg gcctgcaaaa attatttcag acacagattt ttttcccgcg 960
tatctatcag acattttttt gacatcccca cctggggctc gttaactatg gggaattcca 1020
atgtaacgtt gcaatttcag cctcgatggg gtcaaggaat ttattttttc aattggtgca 1080
cttcaacctg ggtcattttc tgggaaaact atataaacaa gacacacccc cccctcccac 1140
tcaaaacaaa ccaagattac cttcaagcca agatcgcaaa gtttatcaaa ttcttact 1198
<210> 4
<211> 1125
<212> DNA
<213> Spathaspora passalidarum
<400> 4
aattttgtgg gtatttttac agcaggatga tttgaggcga gcattgtagc gttcctttgc 60
gatagacttt gcagcttccc cattcaggtt cataacggat ggggtaattg acaaaggaat 120
attgttaacg gccatatttc ctgtccatat aattattttc cttttcgtat ctatatcgag 180
tgtatgtgtg ataagtccga gaaaattatt ctcaacaagc gctttacagt gccagattca 240
gatctctgga aaaacgttca aagtttaaaa ttactaaatc ggaaaatttc aatttcaagg 300
tggggtttta aacaagaaaa aattgtaaaa agaaaaaaaa aactttaaat ctattagtga 360
acgccgcatc tccgcgggca ttgaccccag aaactggaat aaattcctcg atccacttct 420
tctctaacat gaatgactat cctgatatac tctattgtag ttgaaagggg gctaaaagtg 480
atacgacatt gttcccaggg ttagatttgt ggagaaaaaa caatccaaat accgagtggt 540
tggttacaac tcagcgagaa agattgcggc attcccccca tctaaaattt ttttttcttt 600
ttaagcattt tcacagatct ggaaatgtgt tgtctacatg gagaaattcg atatccagct 660
ttaagaaata agacataacg gttcataaac cgttttacca catttcctta cattaatttt 720
tgtttaccat agaatatacc gctgttgtgg tgcgaaagcg aaccaacaat cttgccacta 780
acattaacct cgggaagcaa taataacatt aatgagcaaa gaaaatgaac taaaaaaaaa 840
cacactagaa tatttaaaaa taatattatt tttgcaaaat tttttatgtc aaaaaaaaaa 900
aaagaaaatt aaaattaata ttttcgacaa acctccacat tacacttcgt gtttgcatgg 960
ggccattgtt ccgggggaat actttctctt tgtctttatg atttatcttc acaattcttt 1020
ctcagcttct cctgaagaat ataaaatcaa gtagaaatct tctgtcttga atgatatttt 1080
gcatttctta ttctctacta ttcatatatt aacaaacagt tgaat 1125
<210> 5
<211> 1272
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
atgccacaat ttggtatatt atgtaaaaca ccacctaagg tgcttgttcg tcagtttgtg 60
gaaaggtttg aaagaccttc aggtgagaaa atagcattat gtgctgctga actaacctat 120
ttatgttgga tgattacaca taacggaaca gcaatcaaga gagccacatt catgagctat 180
aatactatca taagcaattc gttgagtttc gatattgtca ataaatcact ccagtttaaa 240
tacaagacgc aaaaagcaac aattttggaa gcctcattaa agaaattgat tcctgcttgg 300
gaatttacaa ttattcctta ctatggacaa aaacatcaat ctgatatcac tgatattgta 360
agtagtttgc aattacagtt cgaatcatcg gaagaagcag ataagggaaa tagccacagt 420
aaaaaaatgc ttaaagcact tctaagtgag ggtgaaagca tctgggagat cactgagaaa 480
atactaaatt cgtttgagta tacttcgaga tttacaaaaa caaaaacttt ataccaattc 540
ctcttcctag ctactttcat caattgtgga agattcagcg atattaagaa cgttgatccg 600
aaatcattta aattagtcca aaataagtat ttgggagtaa taatccagtg tttagtgaca 660
gagacaaaga caagcgttag taggcacata tacttcttta gcgcaagggg taggatcgat 720
ccacttgtat atttggatga atttttgagg aattctgaac cagtcctaaa acgagtaaat 780
aggaccggca attcttcaag caataaacag gaataccaat tattaaaaga taacttagtc 840
agatcgtaca ataaagcttt gaagaaaaat gcgccttatt caatctttgc tataaaaaat 900
ggcccaaaat ctcacattgg aagacatttg atgacctcat ttctttcaat gaagggccta 960
acggagttga ctaatgttgt gggaaattgg agcgataagc gtgcttctgc cgtggccagg 1020
acaacgtata ctcatcagat aacagcaata cctgatcact acttcgcact agtttctcgg 1080
tactatgcat atgatccaat atcaaaggaa atgatagcat tgaaggatga gactaatcca 1140
attgaggagt ggcagcatat agaacagcta aagggtagtg ctgaaggaag catacgatac 1200
cccgcatgga atgggataat atcacaggag gtactagact acctttcatc ctacataaat 1260
agacgcatat aa 1272
<210> 6
<211> 251
<212> DNA
<213> Spathaspora passalidarum
<400> 6
gctaacttca attagaatgt tcccaaggtt agacgagaag gggggtgtta taaccctttt 60
tttttaaaag gttttattga atggatagtt caactgtata tataattttc aataaatgag 120
aaaaaaaggt cacttttgaa tacattgtaa tttgtaatat cattcggggc acgttggtga 180
tgatcttggt cattcatgca taagtccggc tttatggatt ttccagaaac ccgatttcgc 240
ttatagtgat g 251
<210> 7
<211> 1839
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
accacttaca taatagaaag acaattgctg caaaatcaac agctgaccca tttattagcc 60
caatccgttt acttgacacg tgtgaatcaa aaaaaaaaaa aaagaaaaaa ttgatagttc 120
ttactaaatt atttttcacc aaatagaacg aatattcgat gtaattgaaa actaactctg 180
tttggttgat gcagtttctt tcagtaggtc catggtccta acagcaattg attattacct 240
ttctgtgtgt gtttgtctag aatattctag tcatttcttt tcttcttata cgtttgtgta 300
attgtttctt ggatttcttt tttttttttg ccagcacact agagatgaga tccaaagaaa 360
actgcaatta ttggggggta aataatgaag taaattacac tggacaaacc tattataaat 420
aagatccatt gatattagct cctaattgac tattgagaaa attacactca caattgacaa 480
cacatttccc acacatattc cagatttagc aaattaagct tgaaacaaaa cgatccatga 540
agggtgaata aaaaaatttt ttattgttca ttattttttt tgccttgcaa aaattttttt 600
tttcagtggt gatctgtttc ctataaatta ctgagcccat cccccttttt ttcacaaaga 660
aaatttttct acttttctct ttctttcttc ctttttgtta taaactcaat caatcaatca 720
aaactgcaga tgggtaaaaa gcctgaactc accgcgacgt ctgtcgagaa gtttttgatc 780
gaaaagttcg acagcgtctc cgacttgatg cagctctcgg agggcgaaga atctcgtgct 840
ttcagcttcg atgtaggagg gcgtggatat gtcttgcggg taaatagctg cgccgatggt 900
ttctacaaag atcgttatgt ttatcggcac tttgcatcgg ccgcgctccc gattccggaa 960
gtgcttgaca ttggggaatt cagcgagagc ttgacctatt gcatctcccg ccgtgcacag 1020
ggtgtcacgt tgcaagactt gcctgaaacc gaattgcccg ctgttttgca gccggtcgcg 1080
gaggccatgg atgcgatcgc tgcggccgat cttagccaga cgagcgggtt cggcccattc 1140
ggaccgcaag gaatcggtca atacactaca tggcgtgatt tcatatgcgc gattgctgat 1200
ccccatgtgt atcactggca aactgtgatg gacgacaccg tcagtgcgtc cgtcgcgcag 1260
gctctcgatg agttgatgct ttgggccgag gactgccccg aagtccggca cctcgtgcac 1320
gcggatttcg gctccaacaa tgtcttgacg gacaatggcc gcataacagc ggtcattgac 1380
tggagcgagg cgatgttcgg ggattcccaa tacgaggtcg ccaacatctt cttctggagg 1440
ccgtggttgg cttgtatgga gcagcagacg cgctacttcg agcggaggca tccggagctt 1500
gcaggatcgc cgcggctccg ggcgtatatg ctccgcattg gtcttgacca actctatcag 1560
agcttggttg acggcaattt cgatgatgca gcttgggcgc agggtcgatg cgacgcaatc 1620
gtccgatccg gagccgggac tgtcgggcgt acacaaatcg cccgcagaag cgcggccgtc 1680
tggaccgatg gctgtgtaga agtactcgcc gatagtggaa accgacgccc cagcactcgt 1740
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cctcccccca catccgctct aaccgaaaag gaaggagtt 1839
<210> 8
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gcaaaaggcc tgtcggaaat ttctttaggt agat 34
<210> 9
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gcaccaacag agaaaccaat cggggtaccc cggtatgatg taataataat tg 52
<210> 10
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
caattattat tacatcatac cggggtaccc cgattggttt ctctgttggt gc 52
<210> 11
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
aaaaggcctc atccattctt ggcaacataa cttc 34
<210> 12
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
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<210> 13
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
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<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
atcgcggatc ctgtgggtat ttttacagca ggatg 35
<210> 15
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
cggggtaccg aagttcctat tctctagaaa gtataggaac ttcaggggtt ggaagaagaa 60
aaaatcgg 68
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
ataggggtac cgaagttcct atactttcta gagaatagga acttcaactc cttccttttc 60
ggttag 66
<210> 18
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
cggggtaccg aagttcctat tctctagaaa gtataggaac ttctgtgggt atttttacag 60
caggatg 67
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<213> 人工序列
<400> 19
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
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<211> 21
<212> DNA
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<211> 21
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<400> 23
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gagtaataat ccagtgtt 18
<210> 26
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<400> 26
ccaaatactt attttggac 19
<210> 27
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
gtcggaaatt tctttaggta gatatctttt tgaaagatta catcaattag aagttaacac 60
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agatgctcat ggaaaaaact ctcttaaatg ggctggtaat gctaatgaat taaatgctgc 180
ttatgctgca gatggttatt ccagagttaa aggtttaggt tgtatagtta caacttttgg 240
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tttacatgtt gttggtgttc catcaattag ttctcaagct aaacaattat tattacatca 360
taccggggta ccgaagttcc tattctctag aaagtatagg aacttcggta ccccgattgg 420
tttctctgtt ggtgccactt taggtgcagt aatggcagct caagaaattg atccaaataa 480
gagagttatt ttatttgttg gtgatggttc tttacaatta acagttcaag aaatttctac 540
aatgattaga tggaatacta ctccatatct tttcgtttta aataatgatg gttatactat 600
tgaaagattg attcatggtg aaactgccac atataatgat attcaaccat gggaaaactt 660
agctttatta ccaactttta aagctactca ttatgatgcc attagagttg caactgttgg 720
tgaagctgaa gatttattta agaataaaga atttggtaag aactccaaga ttagattaat 780
tgaagttatg ttgccaagaa tggatg 806