本發(fā)明涉及基因工程和發(fā)酵工程等領(lǐng)域，更具體地，涉及一種生產(chǎn)低聚木糖和抗菌肽的益生飼用釀酒酵母。
背景技術(shù)：
：麥稈、谷殼、糠麩等農(nóng)副產(chǎn)品含有抗?fàn)I養(yǎng)因子——木聚糖，它是由β-1，4-糖苷鍵連接而成的木糖聚合物，是構(gòu)成細(xì)胞壁的主要成分之一。木聚糖酶則是能夠降解木聚糖的最主要酶之一，如果將木聚糖酶加以合理利用，則可提高木質(zhì)纖維素的利用率。而木聚糖則是飼料中主要抗?fàn)I養(yǎng)因子之一。通過(guò)在日糧中添加木聚糖酶就是其中比較簡(jiǎn)便而有效的方法。木聚糖酶可將木聚糖水解為木二糖和木二糖以上的低聚木糖，以及少量木糖和阿拉伯糖，因而消除木聚糖的抗?fàn)I養(yǎng)作用。木聚糖經(jīng)木聚糖降解酶降解產(chǎn)物——低聚木糖(xylo-oligosaccharides，XOs)又稱(chēng)木寡糖，是由2～7個(gè)木糖以β-1，4-糖苷鍵結(jié)合而成的直鏈低聚糖的總稱(chēng)，其有效成分一般為木二糖、木三糖、木四糖、木五糖等，其中以木二糖(xylobiose，X2)和木三糖(xylotriose，X3)為主。目前，用于飼料添加劑的功能性低聚糖主要有低聚乳糖、低聚半乳糖、低聚異麥芽糖、大豆低聚糖、低聚果糖、低聚甘露糖以及低聚木糖等，其中效果最好的是低聚木糖。低聚木糖相比其他低聚糖，具有以下優(yōu)點(diǎn)：①高選擇性促進(jìn)雙歧桿菌增殖；②不易被體內(nèi)的消化酶消化；③攝入量少、配伍性好，可與其他成分配伍而不被影響；④對(duì)酸和熱等穩(wěn)定。同時(shí)，低聚木糖還具有如下益生作用：①調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)；②抑制病原菌的繁殖、減少有害物質(zhì)的產(chǎn)生；③提高機(jī)體的免疫力；④促使機(jī)體合成其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。本發(fā)明通過(guò)釀酒酵母系統(tǒng)將木聚糖降解酶類(lèi)進(jìn)行表達(dá)，可補(bǔ)充木聚糖酶等，并輔助降解木聚糖獲得功能性低聚木糖，發(fā)揮益生作用；同時(shí)將具有強(qiáng)堿性、熱穩(wěn)定性以及廣譜抗菌特點(diǎn)及抑殺致病菌、擇性免疫激活和調(diào)節(jié)功能的抗菌肽基因進(jìn)行共表達(dá)，實(shí)現(xiàn)多種功能協(xié)同促進(jìn)。因而，發(fā)明中重組釀酒酵母將應(yīng)用到飼料添加、動(dòng)物養(yǎng)殖以及餐廚廢棄物降解中，可以有效發(fā)揮其協(xié)同作用，發(fā)揮益生作用。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是，為了克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種能分泌等木聚糖降解酶及抗菌肽，能夠應(yīng)用酵母培養(yǎng)物、木聚糖降解等領(lǐng)域等中的益生飼用的基因重組酵母。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是，為了克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種能夠應(yīng)用酵母培養(yǎng)物、木聚糖降解等領(lǐng)域等中能分泌β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶(endo-1,4-β-xylanase)基因、β-木糖苷酶(β-xylosidase)基因等木聚糖降解酶及抗菌肽基因同時(shí)連入釀酒酵母表達(dá)載體pTEGC-BsmBI，轉(zhuǎn)入釀酒酵母，并成功分泌表達(dá)，獲得降解木聚糖生產(chǎn)低聚木糖和分泌抗菌肽的多功能重組釀酒酵母。本發(fā)明的目的在于提供一種能生產(chǎn)低聚木糖和抗菌肽的釀酒酵母多基因共表達(dá)載體及其構(gòu)建方法。本發(fā)明的另一目的在于提供一種能生產(chǎn)低聚木糖和抗菌肽的重組釀酒酵母及其構(gòu)建方法。本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：一種能生產(chǎn)低聚木糖和抗菌肽的釀酒酵母多基因共表達(dá)載體，該載體中含有β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶基因、β-1,4-木糖苷酶基因、抗菌肽基因；所述β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶基因的堿基序列如SEQIDNO：1所示；所述β-1,4-木糖苷酶基因的堿基序列如SEQIDNO：2所示。進(jìn)一步的，所述抗菌肽基因選自東方鈴蟾抗菌肽BLP-2突變體BLP-2-T、異色瓢蟲(chóng)抗菌肽Haxy-Col1突變體Haxy-Col1-T、鯰魚(yú)抗菌肽突變體、脆皮蛙抗菌肽突變體Lf-cath-T；所述東方鈴蟾抗菌肽BLP-2突變體BLP-2-T的堿基序列如SEQIDNO：3所示；所述異色瓢蟲(chóng)抗菌肽Haxy-Col1突變體Haxy-Col1-T的堿基序列如SEQIDNO：4所示；所述鯰魚(yú)抗菌肽突變體的堿基序列如SEQIDNO：5所示；所述脆皮蛙抗菌肽突變體Lf-cath-T的堿基序列如SEQIDNO：6所示。進(jìn)一步的，所述抗菌肽基因上游存在α-信號(hào)肽基因序列，α-信號(hào)肽基因的堿基序列如SEQIDNO：7所示。進(jìn)一步的，所述β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶基因的啟動(dòng)子為pgk1-1，其堿基序列如SEQIDNO：8所示，終止子為pgkt1-1，其堿基序列如SEQIDNO：9所示；所述β-1,4-木糖苷酶基因的啟動(dòng)子為pgk1-2，其堿基序列如SEQIDNO：10所示，終止子為pgkt1-2，其堿基序列如SEQIDNO：11所示；所述抗菌肽基因的啟動(dòng)子為pgk1-3，其堿基序列如SEQIDNO：12所示，終止子為pgkt1-3，其堿基序列如SEQIDNO：13所示。進(jìn)一步的，上述載體的篩選基因中含有G418抗性基因。進(jìn)一步的，上述載體的骨架為pGAPZaA質(zhì)粒。進(jìn)一步的，上述載體中含有釀酒酵母菌的25srDNA基因片段，其堿基序列如SEQIDNO：15所示。一種能生產(chǎn)低聚木糖和抗菌肽的釀酒酵母，該重組釀酒酵母基因組中插入有上述任一所述的多基因共表達(dá)載體。上述任一所述一種能生產(chǎn)低聚木糖和抗菌肽的釀酒酵母多基因共表達(dá)載體的構(gòu)建方法，包括以下步驟：S1整合表達(dá)載體pTEGC-BsmBI構(gòu)建：S1.1將G418抗性基因連入pGAPZaA質(zhì)粒載體的多克隆位點(diǎn)MscI和EcoRV之間，獲得載體pGAPZaA-G418；S1.2將堿基序列如SEQIDNO：15所示的rDNA基因序列的連入載體pGAPZaA-G418多克隆位點(diǎn)BamHI和EcoRI之間，獲得載體pGAPZaA-G418-rDNA；S1.3將載體pGAPZaA-G418-rDNA經(jīng)BglII和EcoRI雙酶切后，回收大片段產(chǎn)物，得到線性化載體pTEGC，將堿基序列如SEQIDNO：16所示的BsmBI-2片段與線性化載體pTEGC連接，得整合表達(dá)載體pTEGC-BsmBI；S2啟動(dòng)子、終止子的擴(kuò)增S2.1啟動(dòng)子的擴(kuò)增：以釀酒酵母基因組DNA為模板，分別用引物對(duì)PGK1F1-BsmBI和PGK1R1-BsmBI、PGK1F2-BsmBI和PGK1R2-BsmBI、PGK1F3-BsmBI和PGK1R3-BsmBI分別擴(kuò)增出pgk1-1、pgk1-2、pgk1-3啟動(dòng)子片段；S2.2終止子的擴(kuò)增：以釀酒酵母基因組DNA為模板，分別用引物對(duì)PGKT1F1-BsmBI和PGKT1R1-BsmBI、PGKT1F2-BsmBI和PGKT1R2-BsmBI、PGKT1F3-BsmBI和PGKT1R3-BsmBI分別擴(kuò)增出pgkt1-1、pgkt1-2、pgkt1-3終止子片段；S3α-信號(hào)肽基因、α-淀粉酶基因、糖化酶基因、抗菌肽基因的獲得S3.1含BsmBI酶切位點(diǎn)的β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶基因的獲得：以含β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶基因序列的T載體為模板，通過(guò)引物xynF-BsmBI以及xynR-BsmBI進(jìn)行擴(kuò)增，得xynA1基因片段，即含有β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶基因的片段；S3.2含BsmBI酶切位點(diǎn)的β-1,4-木糖苷酶基因的獲得：以含β-1,4-木糖苷酶基因序列的T載體為模板，通過(guò)引物xylF-BsmBI以及xylR-BsmBI進(jìn)行擴(kuò)增，得xyl-1基因片段，即含有β-1,4-木糖苷酶基因的片段；S3.3α-信號(hào)肽-抗菌肽基因的獲得：分別以含α-信號(hào)肽基因序列的T載體、含抗菌肽的T載體為模板，通過(guò)重疊延伸PCR將α-信號(hào)肽序列定向連入無(wú)信號(hào)肽的抗菌肽基因的5’端，擴(kuò)增出mfa-amp基因片段，即含有α-信號(hào)肽基因序列和抗菌肽基因序列的片段；所述重疊延伸PCR過(guò)程中，通過(guò)引物將擴(kuò)增產(chǎn)物mfa-amp的兩端引入切割方向相反的BsmBI的切割序列；S4釀酒酵母多基因共表達(dá)載體的構(gòu)建將上述獲得的β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶基因表達(dá)盒元件pgk1-1、xynA1、pgkt1-1；β-1,4-木糖苷酶基因表達(dá)盒元件pgk1-2、xyl-1、pgkt1-2；抗菌肽基因表達(dá)盒元件pgk1-3、mfa-amp、pgkt1-3利用IIs型限制性內(nèi)切酶BsmBI進(jìn)行酶切，純化回收；同時(shí)，利用IIs型限制性內(nèi)切酶BsmBI切割上述整合表達(dá)載體pTEGC-BsmBI，將其線性化；將所用這些片段通過(guò)一步法定向連入線性化的整合表達(dá)載體pTEGC-BsmBI中，即得釀酒酵母多基因共表達(dá)載體；上述所述引物的堿基序列如下：PGK1F1-BsmBI：CGTCTCAgatcGAAGTACCTTCAAAGPGK1R1-BsmBI：CGTCTCGgctaTATATTTGTTGTAAAPGK1F2-BsmBI：CGTCTCAgtcaGAAGTACCTTCAAAGPGK1R2-BsmBI：CGTCTCGgcatTATATTTGTTGTAAAPGK1F3-BsmBI：CGTCTCAtgcaGAAGTACCTTCAAAGPGK1R3-BsmBI：CGTCTCGtcgaTATATTTGTTGTAAAPGKT1F1-BsmBI：CGTCTCAtgtacGATCTCCCATCGTCTCTACTPGKT1R1-BsmBI：CGTCTCGgtcaAAGCTTTTTCGAAACGCAGPGKT1F2-BsmBI：CGTCTCAtacgGATCTCCCATCGTCTCTACTPGKT1R2-BsmBI：CGTCTCGtgcaAAGCTTTTTCGAAACGCAGPGKT1F3-BsmBI：CGTCTCAatcgGATCTCCCATCGTCTCTACTPGKT1R3-BsmBI：CGTCTCGagtcAAGCTTTTTCGAAACGCAGxynF-BsmBI：CGTCTCAgctaATGAAGGTTACTGCTGCTxynR-BsmBI：CGTCTCAgtacTTAAGAAGAGATAGTAACAxylF-BsmBI：CGTCTCAgcatATGCCAGGTGCTGCTTCTATCGTTGCTxylR-BsmBI：CGTCTCAtacgTTATTGTGGAGCGATCAATTGTTCT。一種能生產(chǎn)低聚木糖和抗菌肽的重組釀酒酵母的構(gòu)建方法，將上述構(gòu)建的釀酒酵母多基因共表達(dá)載體轉(zhuǎn)化釀酒酵母宿主，篩選出陽(yáng)性單克隆菌落，并測(cè)序驗(yàn)證正確，即得能生產(chǎn)低聚木糖和抗菌肽的重組釀酒酵母。本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明基因重組釀酒酵母是可以同時(shí)分泌出木聚糖降解相關(guān)酶類(lèi)，如β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶、β-1,4-木糖苷酶，以及抗菌肽的多功能重組酵母。其中β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶、β-1,4-木糖苷酶能夠輔助降解木聚糖生成的低聚木糖(木糖)是重要的益生元，能夠促進(jìn)機(jī)體內(nèi)腸道中益生菌的增殖；同時(shí)還可以補(bǔ)充機(jī)體中木聚糖酶的不足。而選取的抗菌肽也可以抑制雜菌或致病菌。因而其應(yīng)用產(chǎn)品如酵母培養(yǎng)物等，能夠更有效促進(jìn)機(jī)體的免疫力提高，促進(jìn)機(jī)體的生長(zhǎng)，也可以應(yīng)用到餐廚廢棄物降解中，促進(jìn)廢棄物中半纖維素成分的降解和雜菌的生長(zhǎng)。可以應(yīng)用到飼料添加、動(dòng)物養(yǎng)殖以及餐廚廢棄物降解利用等多個(gè)領(lǐng)域。附圖說(shuō)明圖1為剛果紅染色法驗(yàn)證實(shí)施例2構(gòu)建的重組釀酒酵母的木聚糖酶活性。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但并不局限于此。實(shí)施例1整合表達(dá)載體pTEGC-BsmBI構(gòu)建一、整合表達(dá)載體pTEGC-BsmBI構(gòu)建1)G418抗性基因的獲得PCR擴(kuò)增目的基因，以載體pPIC9k為模板，利用G418F-MscI和G418R-EcoRV引物(表1)擴(kuò)增G418抗性基因。PCR反應(yīng)條件：98℃10s，55℃15s，72℃50s，30個(gè)循環(huán)，72℃10min。經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。目的基因回收、純化、轉(zhuǎn)化大腸桿菌、驗(yàn)證、送樣測(cè)序。回收純化目的片段，保存于-20℃?zhèn)溆谩⒌玫降腉418抗性基因與T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α菌株，37℃培養(yǎng)，提取其質(zhì)粒DNA，利用G418F-MscI和G418R-EcoRV引物進(jìn)行菌落PCR篩選陽(yáng)性菌株，將陽(yáng)性克隆送至英濰捷基測(cè)序驗(yàn)證基因的正確性。測(cè)序結(jié)果表明：G418抗性基因及其酶切位點(diǎn)正確連入T載，未發(fā)生突變，G418抗性基因的堿基序列如SEQIDNO：14所示。表1擴(kuò)增G418抗性基因引物注：下劃線處字母為限制性內(nèi)切酶的識(shí)別/切割序列。2)載體pGAPZaA-G418的構(gòu)建在37℃下，利用限制性內(nèi)切酶MscI和EcoRV切割pGAPZaA質(zhì)粒，并在1.5％的瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證；利用限制性內(nèi)切酶切割MscI和EcoRV切割pMD-G418載體，獲得G418抗性基因，在1.5％的瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證；回收純化上述酶切產(chǎn)物中的pGAPZaA載體、G418抗性基因，利用T4連接酶將G418抗性基因連入載體pGAPZaA，獲得載體pGAPZaA-G418。3)rDNA基因擴(kuò)增以釀酒酵母基因組DNA為模板，采用引物rDNAF和rDNAR引物(見(jiàn)表2)PCR擴(kuò)增rDNA基因；PCR擴(kuò)增條件為：98℃10s，55℃15s，72℃60s，30個(gè)循環(huán)，72℃10min；在1％瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，并在上下游分別引入EcoRI和BamHI酶切位點(diǎn)。將得到的rDNA基因與T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α菌株，37℃培養(yǎng)，提取其質(zhì)粒DNA，利用rDNAF和rDNAR引物進(jìn)行菌落PCR篩選陽(yáng)性菌株。測(cè)序結(jié)果表明：rDNA基因及其酶切位點(diǎn)正確連入T載，未發(fā)生突變，rDNA基因的堿基序列如SEQIDNO：15所示。表2擴(kuò)增rDNA基因引物注：下劃線處字母為限制性內(nèi)切酶的識(shí)別/切割序列。4)載體pGAPZaA-G418-rDNA構(gòu)建利用限制性內(nèi)切酶BamHI和EcoRI分切下上述T載體上的rDNA片段、切割質(zhì)粒pGAPZaA-G418，回收純化pGAPZaA-G418載體骨架，利用T4連接酶將rDNA連入線性化后的載體pGAPZaA-G418，獲得重組載體pGAPZaA-G418-rDNA。5)整合表達(dá)載體pTEGC-BsmBI構(gòu)建限制性內(nèi)切酶切割BglII和EcoRI切割質(zhì)粒pGAPZaA-G418-rDNA，切除該載體上BglII到EcoRI酶切位點(diǎn)間的GAP啟動(dòng)子、a-信號(hào)肽等序列，回收大片段產(chǎn)物，得到線性化載體pTEGC。以pMD19-Tsimple載體為模板，通過(guò)引物PMDF-BsmBI和PMDR-BsmBI(見(jiàn)表3)擴(kuò)增出含有2個(gè)BsmBI酶切位點(diǎn)識(shí)別序列，約233bp的片段BsmBI-2，連入T載體，送至英濰捷基測(cè)序，測(cè)序正確，未發(fā)生突變，BsmBI-2的堿基序列如SEQIDNO：16所示。利用限制性內(nèi)切酶切割BglII和EcoRI切下重組后的T載體，回收約233bp的DNA片段BsmBI-2，然后利用T4連接酶將其正確連入線性化載體pTEGC，獲得整合表達(dá)載體pTEGC-BsmBI。表3擴(kuò)增含BsmBI骨架DNA引物注：下劃線處的大寫(xiě)字母為BglII或EcoRI酶切位點(diǎn)；小寫(xiě)字母為IIs型限制性內(nèi)切酶BsmBI酶的識(shí)別序列。二、啟動(dòng)子、終止子的擴(kuò)增1)啟動(dòng)子的擴(kuò)增：以釀酒酵母基因組DNA為模板，利用PGK1F1-BsmBI和PGK1R1-BsmBI引物(見(jiàn)表4)擴(kuò)增出pgk1-1啟動(dòng)子片段(其堿基序列如SEQIDNO：8所示)，用作表達(dá)β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶基因的啟動(dòng)子。同理，以釀酒酵母基因DNA為模板，利用PGK1F2-BsmBI和PGK1R2-BsmBI引物(見(jiàn)表4)擴(kuò)增出pgk1-2啟動(dòng)子片段(其堿基序列如SEQIDNO：10所示)，用作表達(dá)β-1,4-木糖苷酶基因的啟動(dòng)子。同理，以釀酒酵母基因DNA為模板，利用PGK1F3-BsmBI和PGK1R3-BsmBI引物(見(jiàn)表4)擴(kuò)增出pgk1-3啟動(dòng)子片段(其堿基序列如SEQIDNO：12所示)，用作表達(dá)抗菌肽基因的啟動(dòng)子。上述擴(kuò)增所得啟動(dòng)子基因片段均分別連入到pMD19-TSimple載體中，測(cè)序驗(yàn)證，保留正確的陽(yáng)性克隆。2)終止子的擴(kuò)增：以釀酒酵母基因組DNA為模板，利用引物PGKT1F1-BsmBI和PGKT1R1-BsmBI(見(jiàn)表4)擴(kuò)增pgkt1-1終止子(其堿基序列如SEQIDNO：9所示)，用于表達(dá)β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶基因的終止子。以釀酒酵母基因組DNA為模板，利用引物PGKT1F2-BsmBI和PGKT1R2-BsmBI(見(jiàn)表4)擴(kuò)增pgkt1-2終止子(其堿基序列如SEQIDNO：11所示)，用于表達(dá)β-1,4-木糖苷酶基因的終止子。以釀酒酵母基因組DNA為模板，利用引物PGKT1F3-BsmBI和PGKT1R3-BsmBI(見(jiàn)表4)擴(kuò)增pgkt1-3終止子(其堿基序列如SEQIDNO：13所示)，用于表達(dá)抗菌肽基因的終止子。上述擴(kuò)增得到終止子基因片段均連入到pMD19-TSimple載體中，測(cè)序驗(yàn)證，保留正確的陽(yáng)性克隆。表4擴(kuò)增釀酒酵母啟動(dòng)子、終止子的引物注：下劃線處大寫(xiě)字母為IIs型限制性內(nèi)切酶BsmBI的識(shí)別序列，下劃線小寫(xiě)粗體字母為IIs型限制性內(nèi)切酶BsmBI的切割序列。三、α-信號(hào)肽基因、β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶基因(xynA1)、β-1,4-木糖苷酶基因(xyl-1)以及抗菌肽基因(amp)的獲得1)α-信號(hào)肽基因的獲得：以釀酒酵母基因組DNA為模板，利用MfaF和MfaR引物(見(jiàn)表5)擴(kuò)增得到Mfa-BsmBI(即含有α-信號(hào)肽基因序列的片段是嗎？)片段，擴(kuò)增程序如下：98℃10s，55℃15s，72℃30s，30個(gè)循環(huán)，72℃10min；連入T載體，送樣測(cè)序，挑選正確的陽(yáng)性克隆，從而將α-信號(hào)肽基因(其堿基序列如SEQIDNO：7所示)保存至T載體中。表5擴(kuò)增α-信號(hào)肽基因、β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶基因、β-1,4-木糖苷酶基因和抗菌肽基因的引物注：下劃線處大寫(xiě)字母為IIs型限制性內(nèi)切酶BsmBI的識(shí)別序列，下劃線處小寫(xiě)粗體字母為IIs型限制性內(nèi)切酶BsmBI的切割序列。2)β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶基因的獲得：通過(guò)人工合成優(yōu)化后的β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶基因xynA1的堿基序列如SEQIDNO：1所示。3)β-1,4-木糖苷酶基因xyl-1的獲得：通過(guò)人工合成優(yōu)化后的β-1,4-木糖苷酶基因xyl-1的堿基序列如SEQIDNO：2所示；4)抗菌肽基因的獲得：本研究選用的抗菌肽有以下4種：人工合成優(yōu)化后的東方鈴蟾Bombinaorientalis的抗菌肽BLP-2突變體BLP-2-T(堿基序列如SEQIDNO：3所示)，BLP-2-T的氨基酸序列為GIGSKILSAGKGALKGLAKGLAEHFAN(SEQIDNO:45)；人工合成優(yōu)化后的異色瓢蟲(chóng)Harmoniaaxyridis的抗菌肽Haxy-Col1突變體Haxy-Col1-T(堿基序列如SEQIDNO：4所示)，Haxy-Col1-T的氨基酸序列為SLQGGAPNFPQPGQEKQEGWKFDPSLTRGEDGNTRGSINIHHTGPNHEVGANWDKVIRGPNKAKPTYSIHGSWRW(SEQIDNO:46)；人工合成優(yōu)化后的鯰魚(yú)抗菌肽突變體，其氨基酸序列為KGRGKQGGKVRKSS(SEQIDNO:47)，堿基序列如SEQIDNO：5所示；人工合成優(yōu)化后的脆皮蛙的抗菌肽突變體Lf-cath-T(堿基序列如SEQIDNO：6所示)，Lf-cath-T的氨基酸序列為GKCNVLGQRKQLLRSIGSGSHIGSVVLPRG(SEQIDNO:48)。本實(shí)施例選用東方鈴蟾的抗菌肽BLP-2突變體BLP-2-T作為抗菌肽，用于后續(xù)釀酒酵母多基因共表達(dá)載體的構(gòu)建。將上述所得β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶基因(xynA1)、β-1,4-木糖苷酶基因(xyl-1)、抗菌肽基因序列分別保存于pMD19-TSimple質(zhì)粒中，備用。5)含BsmBI酶切位點(diǎn)的β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶基因片段：以含β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶基因片段(xynA1)的T載體為模板，用特異引物xynF-BsmBI以及xynR-BsmBI(見(jiàn)表5)進(jìn)行擴(kuò)增，獲得含有BsmBI的切割位點(diǎn)的β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶基因片段xynA1。6)含BsmBI酶切位點(diǎn)的β-1,4-木糖苷酶基因片段：以含β-1,4-木糖苷酶基因片段的T載體為模板，用特異引物xylF-BsmBI以及xylR-BsmBI(見(jiàn)表5)進(jìn)行擴(kuò)增，獲得含有BsmBI的切割位點(diǎn)的β-1,4-木糖苷酶基因片段xyl-1。7)α-信號(hào)肽-抗菌肽基因的獲得：分別以含α-信號(hào)肽基因序列的T載體、含東方鈴蟾抗菌肽BLP-2突變體BLP-2-T基因的T載體為模板，用引物MfaF3-BsmBI、Mfa-ampR、Mfa-ampF以及Mfa-ampR-BsmBI(見(jiàn)表5)通過(guò)重疊延伸PCR(SOE-PCR)將α-信號(hào)肽序列定向連入無(wú)信號(hào)肽的抗菌肽基因的5’端，擴(kuò)增出mfa-blp基因片段(含有α-信號(hào)肽基因序列和抗菌肽BLP-2突變體BLP-2-T基因)。上述擴(kuò)增得到基因片段均連入到pMD19-Simple載體中，測(cè)序驗(yàn)證，保留正確的陽(yáng)性克隆。四、能生產(chǎn)低聚木糖和抗菌肽的多基因共表達(dá)載體的構(gòu)建將上述“二”和“三”中獲得的β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶基因表達(dá)盒元件pgk1-1(啟動(dòng)子)、xynA1(含有β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶基因xynA1)、pgkt1-1(終止子)；β-1,4-木糖苷酶基因表達(dá)盒元件pgk1-2(啟動(dòng)子)、xyl-1(含有β-1,4-木糖苷酶基因xyl-1)、pgkt1-2(終止子)；抗菌肽基因表達(dá)盒元件pgk1-3(啟動(dòng)子)、mfa-blp(含有α-信號(hào)肽基因序列和抗菌肽BLP-2突變體BLP-2-T基因)、pgkt1-3(終止子)利用IIs型限制性內(nèi)切酶BsmBI分別從T載體切下，純化回收；同時(shí)，利用IIs型限制性內(nèi)切酶BsmBI切割上述“一”中構(gòu)建的整合表達(dá)載體pTEGC-BsmBI，將其線性化。利用T4連接酶將上述片段一次連接反應(yīng)定向連入整合表達(dá)載體pTEGC-BsmBI，獲得釀酒酵母多基因共表達(dá)載體pTEGC-xynA1-xyl-1-blp，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，挑選轉(zhuǎn)化子，測(cè)序驗(yàn)證，獲得正確連接的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，即得能生產(chǎn)低聚木糖和抗菌肽的多基因共表達(dá)載體pTEGC-xynA1-xyl-1-blp。實(shí)施例2能生產(chǎn)低聚木糖和抗菌肽的重組釀酒酵母一、重組釀酒酵母的篩選與驗(yàn)證在釀酒酵母進(jìn)行電轉(zhuǎn)化之前，對(duì)釀酒酵母進(jìn)行抗性篩選標(biāo)記G418的敏感性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在G418濃度為200μg/ml的YPD平板上酵母被抑制不能生長(zhǎng)，選取200μg/ml以上的抗性濃度進(jìn)行篩選，如300μg/ml。將實(shí)施例1構(gòu)建的釀酒酵母多基因共表達(dá)載體pTEGC-xynA1-xyl-1-blp用限制性內(nèi)切酶HpaI線性化，采用醋酸鋰介導(dǎo)的電穿孔轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入釀酒酵母中，在G418濃度為300μg/ml的YPD平板上培養(yǎng)48h以上，挑取長(zhǎng)出的單菌落為轉(zhuǎn)化子。經(jīng)PCR驗(yàn)證后的轉(zhuǎn)化子逐步在含300μg/ml、500μg/ml、600μg/ml的G418的YPD液體培養(yǎng)基中篩選，獲得陽(yáng)性單克隆菌落，測(cè)序驗(yàn)證，獲得正確連接的陽(yáng)性重組酵母轉(zhuǎn)化子，即得能生產(chǎn)低聚木糖和抗菌肽的重組釀酒酵母，簡(jiǎn)稱(chēng)為Glam-x1。二、重組釀酒酵母Glam-x1的木聚糖酶活性檢測(cè)1)剛果紅染色法鑒定重組釀酒酵母的木聚糖酶活性實(shí)驗(yàn)方法：將本實(shí)施例構(gòu)建的重組釀酒酵母Glam-x1轉(zhuǎn)接含1％木聚糖的YP(配方如下：5g/l酵母提取物、10g/l胰蛋白胨)瓊脂平板中，培養(yǎng)72h以上。然后，加入10mL0.1％剛果紅染色液，常溫染色40min，再用1MNaCl溶液脫色30min，觀察水解圈。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：觀察結(jié)果如圖1所示，從中可以看出，本實(shí)施例構(gòu)建的重組釀酒酵母的不同單克隆周?chē)忻黠@的水解圈出現(xiàn)，說(shuō)明本實(shí)施例構(gòu)建的重組釀酒酵母具有很好的木聚糖酶活性。2)DNS法測(cè)定重組釀酒酵母的木聚糖酶活性及pNP法測(cè)定重組釀酒酵母β-木糖苷酶活性實(shí)驗(yàn)方法：參考國(guó)標(biāo)GB/T23874-2009飼料添加劑木聚糖酶活力測(cè)定對(duì)本實(shí)施例構(gòu)建的重組釀酒酵母Glam-x1的木聚糖酶酶活進(jìn)行測(cè)定；重組酵母Glam-x1的β-木糖苷酶酶活測(cè)定參考LackeAH的方法：吸取200μL用50mmol/LpH7.0磷酸緩沖溶液配制的5mmol/L底物(pNP-X)，在55℃預(yù)熱3min,加入50μL適當(dāng)稀釋的酶液,反應(yīng)10min，再加入750μL2mol/L碳酸鈉溶液終止反應(yīng),冷卻后測(cè)定A410,以pNP為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算酶活力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：實(shí)施例2構(gòu)建的重組釀酒酵母的木聚糖酶的活性檢測(cè)結(jié)果如表6所示，從中可以看出，實(shí)施例2重組釀酒酵母Glam-x1的總木聚糖酶酶活約在0.5U/ml以上，顯著高于對(duì)照組宿主釀酒酵母。表6實(shí)施例2構(gòu)建的重組釀酒酵母的木聚糖酶酶活測(cè)定組別木聚糖酶酶活(U/ml)宿主釀酒酵母0.01實(shí)施例2重組釀酒酵母Glam-x10.53實(shí)施例2構(gòu)建的重組釀酒酵母的β-木糖苷酶的活性檢測(cè)結(jié)果如表7所示，從中可以看出，實(shí)施例2重組釀酒酵母Glam-x1的β-木糖苷酶酶活約在3.58U/ml以上，顯著高于對(duì)照組宿主釀酒酵母。表7實(shí)施例2構(gòu)建的重組釀酒酵母的β-木糖苷酶的活性測(cè)定組別β-木糖苷酶酶活(U/ml)宿主釀酒酵母0.01實(shí)施例2重組釀酒酵母Glam-x13.58三、重組釀酒酵母的抑菌效果檢測(cè)實(shí)驗(yàn)方法：①將大腸桿菌CICC10899、銅綠假單胞菌CICC10419作為受試菌，受試菌經(jīng)液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至在OD600nm＝0.4，適當(dāng)稀釋、混勻、均勻涂布至MH培養(yǎng)基中平板上(培養(yǎng)基配方為：5g/l牛肉膏浸粉、17.5g/l酪素水解物、1.5g/l淀粉、瓊脂粉20g/l)。②將適量體積的本實(shí)施例所得重組釀酒酵母菌的發(fā)酵液，加入牛津杯中，以滅菌水為陰性對(duì)照，以氨芐青霉素(1.5μg)為陽(yáng)性對(duì)照，在37℃培養(yǎng)16-18h。③觀察，統(tǒng)計(jì)抑菌圈情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表8所示，從中可以看出，本實(shí)施例構(gòu)建的重組釀酒酵母菌的發(fā)酵液對(duì)大腸桿菌CICC10899、銅綠假單胞菌CICC10419均有明顯的抑菌圈，說(shuō)明所得重組釀酒酵母菌Glam-x1成功分泌出抗菌肽。表8重組菌抑菌效果注：“-”無(wú)抑菌效果，“+”抑菌圈直徑在7到14mm，“++”抑菌圈直徑在14mm以上。實(shí)施例3能生產(chǎn)低聚木糖和抗菌肽的多基因共表達(dá)載體的構(gòu)建本實(shí)施例構(gòu)建釀酒酵母多基因共表達(dá)載體的方法同實(shí)施例1，除了連入載體的抗菌肽基因替換為異色瓢蟲(chóng)Harmoniaaxyridis的抗菌肽Haxy-Col1突變體Haxy-Col1-T基因(堿基序列如SEQIDNO：4所示)外，其他均與實(shí)施例1相同，本實(shí)施例構(gòu)建的釀酒酵母多基因共表達(dá)載體命名為pTEGC-xynA1-xyl-col。實(shí)施例4能生產(chǎn)低聚木糖和抗菌肽的多基因共表達(dá)載體的構(gòu)建本實(shí)施例構(gòu)建釀酒酵母多基因共表達(dá)載體的方法同實(shí)施例1，除了連入載體的抗菌肽基因替換為鯰魚(yú)抗菌肽突變體基因(堿基序列如SEQIDNO：5所示)外，其他均與實(shí)施例1相同，本實(shí)施例構(gòu)建的釀酒酵母多基因共表達(dá)載體命名為pTEGC-xynA1-xyl-1-par。實(shí)施例5能生產(chǎn)低聚木糖和抗菌肽的多基因共表達(dá)載體的構(gòu)建本實(shí)施例構(gòu)建釀酒酵母多基因共表達(dá)載體的方法同實(shí)施例1，除了連入載體的抗菌肽基因替換為脆皮蛙的抗菌肽突變體Lf-cath-T(堿基序列如SEQIDNO：6所示)外，其他均與實(shí)施例1相同，本實(shí)施例構(gòu)建的釀酒酵母多基因共表達(dá)載體命名為pTEGC-xynA1-xyl-cath。實(shí)施例6能生產(chǎn)低聚木糖和抗菌肽的重組釀酒酵母的構(gòu)建將實(shí)施例3構(gòu)建的釀酒酵母多基因共表達(dá)載體pTEGC-xynA1-xylcol用限制性內(nèi)切酶線性化，采用醋酸鋰介導(dǎo)的電穿孔轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入釀酒酵母中，在G418濃度為300μg/ml的YPD平板上培養(yǎng)48h以上，挑取長(zhǎng)出的單菌落為轉(zhuǎn)化子。經(jīng)PCR驗(yàn)證后的轉(zhuǎn)化子逐步在含300μg/ml、500μg/ml、600μg/ml的G418的YPD液體培養(yǎng)基中篩選，獲得陽(yáng)性單克隆菌落，測(cè)序驗(yàn)證，獲得正確連接的陽(yáng)性重組酵母轉(zhuǎn)化子，即可獲得能生產(chǎn)低聚木糖和抗菌肽的重組釀酒酵母的構(gòu)建，將本實(shí)施例所得的重組釀酒酵母簡(jiǎn)稱(chēng)為Glam-x2。實(shí)施例7能生產(chǎn)低聚木糖和抗菌肽的重組釀酒酵母的構(gòu)建將實(shí)施例4構(gòu)建的釀酒酵母多基因共表達(dá)載體pTEGC-xynA1-xyl-par用限制性內(nèi)切酶線性化，采用醋酸鋰介導(dǎo)的電穿孔轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入釀酒酵母中，在G418濃度為300μg/ml的YPD平板上培養(yǎng)48h以上，挑取長(zhǎng)出的單菌落為轉(zhuǎn)化子。經(jīng)PCR驗(yàn)證后的轉(zhuǎn)化子逐步在含300μg/ml、500μg/ml、600μg/ml的G418的YPD液體培養(yǎng)基中篩選，獲得陽(yáng)性單克隆菌落，測(cè)序驗(yàn)證，獲得正確連接的陽(yáng)性重組酵母轉(zhuǎn)化子，即可獲得能生產(chǎn)低聚木糖和抗菌肽的重組釀酒酵母的構(gòu)建，將本實(shí)施例所得的重組釀酒酵母簡(jiǎn)稱(chēng)為Glam-x3。實(shí)施例8能生產(chǎn)低聚木糖和抗菌肽的重組釀酒酵母的構(gòu)建將實(shí)施例5構(gòu)建的釀酒酵母多基因共表達(dá)載體pTEGC-xynA1-xyl-cath用限制性內(nèi)切酶線性化，采用醋酸鋰介導(dǎo)的電穿孔轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入釀酒酵母中，在G418濃度為300μg/ml的YPD平板上培養(yǎng)48h以上，挑取長(zhǎng)出的單菌落為轉(zhuǎn)化子。經(jīng)PCR驗(yàn)證后的轉(zhuǎn)化子逐步在含300μg/ml、500μg/ml、600μg/ml的G418的YPD液體培養(yǎng)基中篩選，獲得陽(yáng)性單克隆菌落，測(cè)序驗(yàn)證，獲得正確連接的陽(yáng)性重組酵母轉(zhuǎn)化子，即可能生產(chǎn)低聚木糖和抗菌肽的重組釀酒酵母的構(gòu)建，將本實(shí)施例所得的重組釀酒酵母簡(jiǎn)稱(chēng)為Glam-x4。實(shí)施例9抗菌肽突變體與原抗菌肽的抗菌性能對(duì)比通過(guò)生物公司合成東方鈴蟾Bombinaorientalis的抗菌肽BLP-2及其突變體BLP-2-T(堿基序列如SEQIDNO：3所示)、異色瓢蟲(chóng)Harmoniaaxyridis的抗菌肽Haxy-Col1及其突變體Haxy-Col1-T(堿基序列如SEQIDNO：4所示)、鯰魚(yú)抗菌肽及其突變體(堿基序列如SEQIDNO：5所示)、脆皮蛙的抗菌肽Lf-cath及其突變體Lf-cath-T(堿基序列如SEQIDNO：6所示)。以沙門(mén)氏菌CMCC50071、大腸桿菌CICC10899和金黃色葡萄球菌ATCC22023作為指示菌，檢測(cè)各種抗菌肽突變前后對(duì)上述指示菌的最小抑菌濃度(MIC)。檢測(cè)結(jié)果如表9所示，經(jīng)過(guò)改造后的抗菌肽突變體均優(yōu)于未突變的抗菌肽。其中東方鈴蟾的抗菌肽BLP-2及其突變體BLP-2-T、異色瓢蟲(chóng)抗菌肽及其突變體Haxy-Col1-T的抗菌性能較好(MIC低)。表9抗菌肽抗菌性能對(duì)比表下面對(duì)上述不同實(shí)施例制備的重組釀酒酵母作進(jìn)一步的性能檢測(cè)。一、不同重組釀酒酵母酶解木聚糖活性的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)方法：挑選經(jīng)剛果紅染色鑒定的各實(shí)施例中的最大水解圈的單克隆，分別取等量的活化后的實(shí)施例2、6、7、8構(gòu)建的重組釀酒酵母菌(Glam-x1、Glam-x2、Glam-x3、Glam-x4)和未經(jīng)改造的原始宿主釀酒酵母菌，分別接入含0.15％的木聚糖的YPD液體培養(yǎng)中，按照10％(v/v)接種量進(jìn)行接種，培養(yǎng)條件為30℃，200rpm，培養(yǎng)時(shí)間為96h以上。在0h、48h和96h取樣，樣品在10000rpm，離心15min，取上清，用HPLC(流動(dòng)相0.05MH2SO4，進(jìn)樣量20μl)檢測(cè)分析培養(yǎng)基的木糖和低聚木糖的含量(以木二糖和木三糖為例)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：檢測(cè)結(jié)果如表10所示，從中可以看出，在48h和96h吸取上清液進(jìn)行HPLC分析發(fā)現(xiàn)，Glam-x1經(jīng)發(fā)酵酶解生成木二糖和木三糖的濃度明顯高于Glam-x2、Glam-x3以及Glam-x4生成的，其中Glam-x1、Glam-x3、Glam-x4、Glam-x2的木二糖和木三糖生成量依次降低。木糖的生成量，Glam-x1在48h也高于其他實(shí)施例的重組菌，在96h均被釀酒酵母吸收、消耗部分。表10不同重組釀酒酵母酶解木聚糖的活性檢測(cè)二、不同重組釀酒酵母對(duì)含木聚糖原料進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵的效果檢測(cè)實(shí)驗(yàn)方法：分別取等量的活化后的實(shí)施例2、6、7、8構(gòu)建的重組釀酒酵母菌(Glam-x1、Glam-x2、Glam-x3、Glam-x4)和未經(jīng)改造的原始宿主釀酒酵母菌對(duì)含木聚糖原料進(jìn)行發(fā)酵，其具體方法如下：1)斜面復(fù)蘇：將不同重組釀酒酵母接種YPD瓊脂斜面上，30℃培養(yǎng)2d，復(fù)蘇活化。2)種子液活化：從斜面上挑取單菌落，接種至全營(yíng)養(yǎng)的50ml的YPD液體培養(yǎng)基中，30℃、220rpm振蕩培養(yǎng)。3)三級(jí)放大液體發(fā)酵。分別按照500mL到5L，再到30L的三級(jí)放大，接種量分別為10％(v/v)、10％(v/v)、16.7％(v/v)，接種確保各組釀酒酵母的用量相同，從而快速獲得大量的菌體。液體發(fā)酵培養(yǎng)基如下：糖蜜為碳源，三級(jí)放大濃度分別為15g/l→50g/l→100g/l；玉米漿為氮源，三級(jí)放大濃度分別為0.4％(v/v)→0.6％(v/v)→0.8％(v/v)；無(wú)機(jī)鹽包括0.1％(w/v)硫酸鎂、0.05％(w/v)氯化鈣、0.1％(w/v)磷酸二氫鉀、0.1％(w/v)磷酸氫二鈉；初始pH調(diào)整在6.0。4)高密度有氧固態(tài)發(fā)酵。按照如下配方進(jìn)行：按照甘蔗渣：麩皮：玉米粉：豆粕：木聚糖比例為41.9：25：18：15：0.1加入配比，其中料水比為1：1.44。其中水包括液體發(fā)酵液及部分補(bǔ)充的蒸餾水(比例為0.44:1)，種子液接種量為44％(v/m，L/kg)。每隔8h進(jìn)行翻料，翻料后2h內(nèi)增加通風(fēng)，翻料后灑水或緩沖液補(bǔ)充濕度、調(diào)節(jié)pH接近6.0。通過(guò)淺層高密度固態(tài)發(fā)酵時(shí)間為3d。5)深層厭氧發(fā)酵破壁。將高密度固態(tài)發(fā)酵料堆疊，增加料層厚度，補(bǔ)加Hcl稀釋液降低發(fā)酵料的pH至5.5，溫度至28℃，深層發(fā)酵厭氧48h；然后，補(bǔ)加Hcl稀釋液降低發(fā)酵料的pH至4.0，同時(shí)發(fā)酵溫度升至55℃進(jìn)行破壁20h。酵母破壁率可達(dá)95％，無(wú)活酵母。6)參考GB/T6432-1994“飼料中粗蛋白測(cè)定”的凱氏定氮法測(cè)定粗蛋白含量；參考國(guó)標(biāo)GB/T6434-2006“飼料中粗纖維的含量測(cè)定”；參考國(guó)標(biāo)GB/T22492-2008“大豆肽粉”提取并測(cè)定酸溶蛋白含量；參考GB/T13093-2006“飼料中細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定”檢測(cè)細(xì)菌數(shù)，利用HPLC分析低聚木糖，對(duì)重組菌的酵母培養(yǎng)物進(jìn)行粗蛋白、酸溶蛋白、粗纖維、木二糖、木三糖、細(xì)菌數(shù)(雜菌數(shù))等指標(biāo)，并與市售產(chǎn)品對(duì)比。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：檢測(cè)結(jié)果如表11所示，對(duì)比發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的酵母培養(yǎng)物的各指標(biāo)皆優(yōu)于市售產(chǎn)品，且提供了足量低聚木糖(以木二糖和木三糖為例)，同時(shí)本發(fā)明的酵母培養(yǎng)物的除酵母菌外的雜菌數(shù)明顯小于市售產(chǎn)品和對(duì)照組。其中，實(shí)施例2的重組釀酒酵母(Glam-x1)指標(biāo)優(yōu)于市售產(chǎn)品和其他實(shí)施例的重組釀酒酵母的酵母培養(yǎng)物。表11不同重組釀酒酵母對(duì)含木聚糖原料進(jìn)行發(fā)酵的產(chǎn)物成分檢測(cè)上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。SEQUENCELISTING<110>廣州格拉姆生物科技有限公司<120>一種生產(chǎn)低聚木糖和抗菌肽的益生飼用釀酒酵母<130><160>48<170>PatentInversion3.5<210>1<211>636<212>DNA<213>人工序列<400>1atgaaggttactgctgctttcgcttctttgttgttgactgctttcgctgctccagctcca60gaaccagttttggtttctagatctgctggtatcaactacgttcaaaactacaacggtaac120ccaggtgacttcacttacgacgaatctgctggtactttctctatgtactgggaagacggt180gtttcttctgacttcgttatcggtttgggttggactactggttcttctaagtctatcact240tactctgctcaatactctgcttcttcttcttcttcttacttggctgtttacggttgggtt300aattctccacaagctgaatactacatcgttgaagactacggtaactacaacccatgttct360tctgctacttctttgggtactgtttactctgacggttctacttaccaagtttgtactgac420actagaactaacgctccatctatcactggtacttctactttcactcaatacttctctgtt480agagaatctactagaacttctggtactgttactgttgctaaccacttcaacttctgggct540caacacggtttcggtaactctaacttcaactaccaagttatggctgttgaagcttggaac600ggtgctggttctgcttctgttactatctcttcttaa636<210>2<211>2397<212>DNA<213>人工序列<400>2atgccaggtgctgcttctatcgttgctgttttggctgctttgttgccaactgctttgggt60caagctaaccaatcttacgttgactacaactctgaagctaacccagacttgttctctgaa120tgtttggaaactggtggtacttctttcccagactgtgaatctggtccattgtctaagact180ttggtttgtgacacttctgctaagccacacgacagagctgctgctttggtttctttgttg240actttcgaagaattggttaataacactgctaacactggtcacggtgctccaagaatcggt300ttgccagcttaccaagtttggaacgaagctttgcacggtgttgctcacgctgacttctct360gacgctggtgacttctcttggtctactt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