本發明涉及一種發酵生產單葡萄糖醛酸甘草次酸的方法和應用，屬于生物工程技術領域。

背景技術：

甘草為豆科甘草屬植物，是傳統的中草藥，其藥用部位為干燥的根及根莖。三萜類化合物甘草酸是甘草中的主要藥效成分，是目前甘草方向的研究重點，國內外學者對其的深入研究表明，甘草酸(Glycyrrhizin,GL)具有一定的抗炎、保肝、抗病毒、抗過敏、降脂、抗動脈粥樣硬化、抗腫瘤、解毒等方面的作用。

單葡萄糖醛酸基甘草次酸(Glycyrrhetinic acid monoglucuronide,GAMG)，由一分子葡萄糖醛酸和一分子的甘草次酸通過糖苷鍵連接而成。其化學式為C₃₆H₅₄O₁₀，分子量為648.8g mol^-1，根據其H的平面的不同，包括18β-GAMG和18α-GAMG兩種同分異構體。GAMG只含有一個葡萄糖醛酸基，其極性介于甘草酸和甘草次酸之間，能順利進入細胞，并且親脂性不太強，在機體內的溶解度和跨膜轉運能力比甘草酸和甘草次酸強。因而有更好的生物利用度，也能比甘草酸和甘草次酸更好的發揮藥效。單葡萄糖醛酸甘草次酸(GAMG)作為甘草酸的衍生物，兩者具有相似的生物活性，其在抗肝炎、抗過敏、抗癌癥、抗病毒方面的療效顯著高于GL。因此，開發GAMG作為抗肝炎類、抗過敏、抗癌癥方面的高效新藥具有廣闊的開發應用前景。GAMG的LD₅₀＝5000mg/kg，GL的LD₅₀＝805mg/kg，因此其比甘草酸更安全，GAMG作為一種新型的天然甜味劑，甜度約是甘草酸的5倍，在食品添加劑方面的應用前景廣闊。在化妝品方面，GAMG的性質較為穩定，不僅耐高溫、耐酸和耐壓，而且有較好的乳化性和起泡性。

在現有的技術中，制備GAMG包括化學法和微生物法。甘草酸為苷元甘草次酸分別通過β-1,2糖苷鍵和β-1,3糖苷鍵和兩個分子葡萄糖醛酸連接而成的，這兩個糖苷鍵的鍵能是相似的，化學水解法對這兩個糖苷鍵的選擇性很低，采用高能耗和高污染的化學法制備該產物GAMG時，也會生成大量的副產物甘草次酸。因此，化學法制備生產GAMG的研究較為困難和少見。微生物制備單葡萄糖醛酸甘草次酸，其實質是微生物通過產生的β-葡萄糖醛酸苷酶將甘草酸為底物，選擇性斷裂兩個糖基之間的β-1,2糖苷鍵，從而制得單葡萄糖醛酸甘草次酸。微生物發酵法存在目的產物產量低，副產物多的缺陷，使發酵不能滿足國內的工業化生產需求。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種單葡萄糖醛酸甘草次酸的方法，是將籃狀真菌(Talaromyces sp)按體積以5～10％的接種量接種至以甘草酸作為碳源和誘導劑、硝酸鈉為氮源的發酵培養基中，控制初始pH 4.5～6.5，于25～37℃發酵120-144h。

在本發明的一種實施方式中，所述硝酸鈉濃度為2-4g/L。

在本發明的一種實施方式中，所述硝酸鈉濃度為3g/L。

在本發明的一種實施方式中，控制發酵過程中甘草酸濃度為1-8g/L進行誘導。

在本發明的一種實施方式中，所述甘草酸濃度為5g/L。

在本發明的一種實施方式中，所述接種是接種種子液，所述種子液是將籃狀真菌接種至種子培養基中，于25～40℃培養36-48h。

在本發明的一種實施方式中，所述種子培養基每L含有：蛋白胨5g，葡萄糖10g，磷酸二氫鉀1g，硫酸鎂0.4g。

在本發明的一種實施方式中，所述發酵培養基每L含有：甘草酸1-8g，硝酸鈉2-4g，磷酸二氫鉀1-3g，硫酸鎂0.5-2g，硫酸亞鐵0.01-0.05g。

在本發明的一種實施方式中，所述發酵培養基每L含有：甘草酸5g，硝酸鈉3g，磷酸二氫鉀2g，硫酸鎂1g，硫酸亞鐵0.01g。

有益效果：本發明提供了以甘草酸為碳源，誘導籃狀真菌(Talaromyces sp)生產單葡萄糖醛酸基甘草次酸的方法，可以在對環境友好的前提下，大量制備具有廣泛研究價值的產物GAMG，同時，該微生物發酵方法為制備這一三萜類化合物的規模化生產奠定了新的基礎。本發明的方法工藝簡單，成本低，GAMG產量達到4.05g/L,產率為88.00％，經大孔樹脂純化后，其純度達到80％以上，產物純度高，不發生結構異化，并具有生產周期短、易于操作、能耗低等優點，適合于后期的工業化生產的特點。

附圖說明

圖1為按照本發明的方法進行發酵后發酵液的液相色譜圖；

圖2為按照對照例的方法進行發酵后的發酵液液相色譜圖。

具體實施方式

GAMG測定方法：測定方法參見《單葡萄糖醛酸甘草次酸分離純化的研究》，作者戴燕，公開于2006年。

實施例1

種子培養基每L含有：蛋白胨5g，葡萄糖10g，磷酸二氫鉀1g，硫酸鎂0.4g。

發酵培養基每L含有：甘草酸5g，硝酸鈉3g，磷酸二氫鉀2g，硫酸鎂1g，硫酸亞鐵0.01g。

將籃狀真菌(Talaromyces sp)接種至種子培養基中，于25～40℃培養36-48h。按體積以5～10％的接種量轉接至以硝酸鈉為氮源的發酵培養基中，控制初始pH 4.5～6.5，于25～37℃發酵120-144h，發酵過程中控制終濃度5g/L甘草酸作為碳源和誘導劑。

檢測發酵結束后發酵液中目的產物的產量、純度、轉化率，結果如圖1所示，保留時間為16.91的產物GAMG產量達到4.05g/L,產率為88.00％，且無保留時間為24.40的甘草次酸的這一副產物生成，經大孔樹脂純化后，其純度達到80％以上。

對照例1

實施方式同實施例1，區別在于，發酵過程中不添加甘草酸誘導。對發酵結果進行測定，結果顯示，GAMG產量接近于0。

對照例2

實施方式同實施例1，區別在于，發酵培養基中只含有5g/L的甘草酸，不加入其他營養物質。對發酵結果進行測定，結果顯示，未檢測到GAMG，該菌株幾乎沒有利用甘草酸。

對照例3

實施方式同實施例1，區別在于,發酵培養基中分別含有5g/L的葡萄糖和甘草酸、或分別含有5g/L的蔗糖和甘草酸，其產率基本上接近于0。

對照例4

實施方式同實施例1，區別在于，甘草酸濃度為1g/L，其GAMG的產率為42.55％(圖2所示)。

對照例5

實施方式同實施例1，區別在于，分別將氮源替換為3g/L的牛肉膏、尿素、酵母粉，對發酵結果進行測定，結果顯示，GAMG產率分別為25.87％、24.60％、40.28％。

對照例6

實施方式同實施例1，區別在于，初始pH分別3.5和4.0，對發酵結果進行測定，結果顯示，GAMG產率分別為23.20％、34.70％。

對照例7

實施方式同實施例1，區別在于，溫度分別為20℃、24℃時，對發酵結果進行測定，結果顯示，GAMG產率分別為11.50％、14.86％。

對照例8

實施方式同實施例1，區別在于，將籃狀真菌替換為黑曲霉，對發酵結果進行測定，結果顯示，GAMG產率為51％。

雖然本發明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發明的精神和范圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發明的保護范圍應該以權利要求書所界定的為準。