本發(fā)明涉及一種維生素b12衍生物，特別是涉及一種新型的熒光標(biāo)記的維生素b12衍生物，簡(jiǎn)稱(chēng)為vb12-fitc，以及該衍生物的合成方法以及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

維生素b12，又稱(chēng)甲鈷胺，是一種人體必需的水溶性維生素，無(wú)法在體內(nèi)自身合成，僅能通過(guò)食物攝入,并儲(chǔ)存于肝臟中。在人體缺乏持續(xù)補(bǔ)充外源性維生素b12的情況下，肝臟中儲(chǔ)存的維生素b12總量在3-6個(gè)月內(nèi)即被消耗殆盡。在人體細(xì)胞代謝的甲基化、維護(hù)神經(jīng)髓鞘的代謝與功能、促進(jìn)紅細(xì)胞的發(fā)育與成熟、參與脫氧核酸(dna)的合成、脂肪及碳水化合物的代謝、核酸與蛋白質(zhì)的合成等多個(gè)重要環(huán)節(jié)，均離不開(kāi)維生素b12的參與。隨著維生素b12的缺乏，最終導(dǎo)致惡性貧血、不可逆性神經(jīng)病變等并發(fā)癥。

維生素作為參與一碳基團(tuán)代謝的輔酶，與核酸和蛋白質(zhì)的合成密切相關(guān)。細(xì)胞的增殖和發(fā)育過(guò)程中，核酸和蛋白質(zhì)的合成顯著加快，因而在快速增殖組織——腫瘤病灶中，針對(duì)維生素b12受體數(shù)目顯著上調(diào)，表現(xiàn)出對(duì)維生素?cái)z取的顯著增加，因而腫瘤對(duì)vb12有高攝取現(xiàn)象。這一特性使維生素b12本身具有一定的腫瘤靶向性，在腫瘤吸收代謝途徑、腫瘤顯像治療等方面的研究，維生素b12一定意義。

維生素b12的正常吸收代謝、腫瘤代謝特點(diǎn)日益得到關(guān)注，其吸收代謝途徑、及該途徑下新型靶向給藥，是近年關(guān)注研究熱點(diǎn)，所以維生素b12的顯像、可視化顯得尤為重要。目前vb12的顯像標(biāo)記，主要通過(guò)放射性核素co+、111in、10b、99mtc或正電子cu+標(biāo)記等途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)，該類(lèi)方法需要特殊顯像設(shè)備、成本高、操作難度大，另外放射性核素、正電子對(duì)人體均有放射性的損害。熒光顯像是目前相對(duì)安全、成本低廉、無(wú)需借助超大型儀器、操作簡(jiǎn)便的顯像方法，在維生素b12吸收研究中若能通過(guò)熒光標(biāo)識(shí)，可極大降低操作的難度及成本。

然而，維生素b12結(jié)構(gòu)上可反應(yīng)基團(tuán)少，難以直接與熒光劑直接反應(yīng)結(jié)合，必須先在本結(jié)構(gòu)上增加一個(gè)“橋梁”，可同時(shí)與vb12、熒光劑結(jié)合，進(jìn)而完成維生素b12的熒光標(biāo)記。但維生素b12本身結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，見(jiàn)光、遇熱易分解，在劇烈反應(yīng)條件下則有降解的可能，因此維生素b12熒光標(biāo)記有很大難度。本發(fā)明通過(guò)偶聯(lián)二氨基化合物，將維生素b12結(jié)構(gòu)上的-oh轉(zhuǎn)化成反應(yīng)活性更高的氨基，在室溫下再與fitc的異硫氰酸根反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)在溫和條件下制備fitc熒光標(biāo)記vb12。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種fitc標(biāo)記的維生素b12衍生物，所構(gòu)建的熒光標(biāo)記的vb12在維持vb12原有結(jié)構(gòu)的前提下，常溫下活化其低反應(yīng)活性基團(tuán)，從而解決了目前核素、正電子標(biāo)記的維生素b12顯像存在成本高、操作難度大等難題。

本發(fā)明所述的fitc標(biāo)記的維生素b12衍生物(vb12-fitc)，具有如下的分子結(jié)構(gòu)式：

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供所述的fitc標(biāo)記的維生素b12衍生物的制備方法。

本發(fā)明所述的vb12-fitc的制備方法包括：在vb12結(jié)構(gòu)的低反應(yīng)活性-oh基團(tuán)上，偶聯(lián)雙氨基，進(jìn)而與fitc的異硫氰酸根反應(yīng)，合成vb12-fitc衍生物。

在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明所述的vb12-fitc的制備方法包括以下步驟：

(a)維生素b12的氨基化：在惰性氣體氣保護(hù)下，將維生素b12溶解于經(jīng)除水處理的二甲基亞砜(dmso)中，按照1:1-1:2比例加入活化劑n,n'-羰基二咪唑(cdi)，20-25℃下避光活化6-12小時(shí)，按照1:2-1:5比例加入二氨基化合物，繼續(xù)在20-25℃下反應(yīng)3-12小時(shí)；沉淀并分離反應(yīng)產(chǎn)物，20-25℃下干燥得到氨基化的維生素b12；

(b)fitc與氨基化維生素b12的偶聯(lián)：將步驟a中反應(yīng)得到的氨基化維生素b12溶解于經(jīng)除水處理的二甲基亞砜(dmso)，按照1:1-1:2比例加入催化劑三乙胺，按照1:1.5比例加入異硫氰酸熒光素(fitc)，20-25℃下避光反應(yīng)4-12小時(shí)，沉淀并分離反應(yīng)產(chǎn)物，20-25℃下干燥得到fitc標(biāo)記的維生素b12。

根據(jù)本發(fā)明所述的vb12-fitc的制備方法的進(jìn)一步特征，所述步驟a中選用的二氨基化合物為1,8-二氨基-3,6-二氧雜辛烷。

根據(jù)本發(fā)明所述的vb12-fitc的制備方法的進(jìn)一步特征，所述步驟a和b中，在沉淀時(shí)加入丙酮作為沉淀劑。

根據(jù)本發(fā)明所述的vb12-fitc的制備方法的進(jìn)一步特征，所述步驟a和b中，在分離反應(yīng)產(chǎn)物時(shí)，采用離心機(jī)在10000r/min條件下離心10min，除去未反應(yīng)的化合物。

根據(jù)本發(fā)明所述的vb12-fitc的制備方法的進(jìn)一步特征，所述步驟a和b中，所述干燥是真空干燥。

本發(fā)明第三個(gè)目的在于提供所述的vb12-fitc的應(yīng)用，也就是所述的vb12-fitc在制備診斷和監(jiān)測(cè)vb12吸收代謝途徑以及腫瘤中的顯像治療劑中的應(yīng)用。

基于本發(fā)明所述的vb12-fitc所制備的顯像治療劑在評(píng)估vb12-fitc衍生物在診斷和監(jiān)測(cè)vb12吸收代謝新途徑以及腫瘤中具有良好的應(yīng)用前景。

本發(fā)明具有如下有益效果：

(1)本發(fā)明所提供的fitc標(biāo)記的維生素b12的制備條件溫和(可在常溫下進(jìn)行)，原料低毒，操作方法簡(jiǎn)便，合成效率高，反應(yīng)產(chǎn)物性質(zhì)穩(wěn)定，具有良好的熒光顯像效果；

(2)本發(fā)明所提供的fitc標(biāo)記的維生素b12具有腫瘤攝取靶向性，在vb12吸收代謝途徑、腫瘤顯像治療等方面的研究具有良好的應(yīng)用前景。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明所述的fitc標(biāo)記維生素b12的¹hmr質(zhì)譜圖。

圖2是本發(fā)明所述的fitc標(biāo)記維生素b12的hplc圖。

圖3是本發(fā)明所述的fitc標(biāo)記維生素b12的流式分析結(jié)果圖。

圖4是本發(fā)明所述的fitc標(biāo)記維生素b12的共聚焦顯微鏡結(jié)果圖。

圖5是本發(fā)明所述的fitc標(biāo)記維生素b12的在體成像圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。

實(shí)施例1：本發(fā)明所述的vb12-fitc的制備

(a)氮?dú)獗Ｗo(hù)下將200mg的維生素b12溶解于4ml經(jīng)除水處理的二甲基亞砜(dmso)，加入200mg的活化劑n,n'-羰基二咪唑(cdi)，20℃下避光活化12小時(shí)，加入400mg二1,8-氨基-3,6-二氧雜辛烷，繼續(xù)在20℃下反應(yīng)6小時(shí)。用500ml丙酮沉淀反應(yīng)產(chǎn)物，并在10000r/min條件下離心10min分離反應(yīng)產(chǎn)物，20℃下真空干燥得到氨基化的維生素b12。

(b)將步驟a得到的氨基化維生素b12，稱(chēng)取150ng溶解于4ml經(jīng)除水處理的二甲基亞砜(dmso)，加入0.1ml的催化劑三乙胺，按照1：1比例加入fitc，20℃下避光反應(yīng)6小時(shí)，沉淀并分離反應(yīng)產(chǎn)物，20℃下真空干燥得到fitc標(biāo)記的維生素b12。

實(shí)施例2：本發(fā)明所述的vb12-fitc的制備

(a)氮?dú)獗Ｗo(hù)下將200mg的維生素b12溶解于4ml經(jīng)除水處理的二甲基亞砜(dmso)，加入300mg的活化劑n,n'-羰基二咪唑(cdi)，22℃下避光活化12小時(shí)，加入600mg的1,8-二氨基-3,6-二氧雜辛烷，繼續(xù)在22℃下反應(yīng)6小時(shí)。用500ml丙酮沉淀反應(yīng)產(chǎn)物，并在10000r/min條件下離心10min分離反應(yīng)產(chǎn)物，22℃下真空干燥得到氨基化的維生素b12。

(b)將步驟a得到的氨基化維生素b12，稱(chēng)取150ng溶解于4ml經(jīng)除水處理的二甲基亞砜(dmso)，加入0.1ml的催化劑三乙胺，按照1：1.25比例加入fitc，22℃下避光反應(yīng)6小時(shí)，沉淀并分離反應(yīng)產(chǎn)物，22℃下真空干燥得到fitc標(biāo)記的維生素b12。

實(shí)施例3：本發(fā)明所述的vb12-fitc的制備

(a)氮?dú)獗Ｗo(hù)下將200mg的維生素b12溶解于4ml經(jīng)除水處理的二甲基亞砜(dmso)，加入400mg的活化劑n,n'-羰基二咪唑(cdi)，25℃下避光活化12小時(shí)，加入800mg二1,8-氨基-3,6-二氧雜辛烷，繼續(xù)在25℃下反應(yīng)6小時(shí)。用500ml丙酮沉淀反應(yīng)產(chǎn)物，并在10000r/min條件下離心10min分離反應(yīng)產(chǎn)物，20℃下真空干燥得到氨基化的維生素b12。

(b)將步驟a得到的氨基化維生素b12，稱(chēng)取150ng溶解于4ml經(jīng)除水處理的二甲基亞砜(dmso)，加入0.1ml的催化劑三乙胺，按照1：1.5比例加入fitc，25℃下避光反應(yīng)6小時(shí)，沉淀并分離反應(yīng)產(chǎn)物，20℃下真空干燥得到fitc標(biāo)記的維生素b12。

實(shí)施例4：本發(fā)明所述的vb12-fitc的分析

(1)vb12-fitc的合成驗(yàn)證：利用高效液相色譜儀(hplc)、質(zhì)譜分析儀，分別檢測(cè)vb12、fitc各自的波譜、分子量，驗(yàn)證vb2-fitc的偶聯(lián)。

(2)vb12-fitc的腫瘤吸收流式分析：培養(yǎng)胃癌細(xì)胞(ags)至70-80％的密度，加入vb12-fitc，共孵育4h后，pbs重懸兩次后，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞對(duì)熒光標(biāo)記維生素b12的吸收率。

(3)vb12-fitc的腫瘤吸收顯像：在共聚焦皿中培養(yǎng)胃癌細(xì)胞(ags)至70-80％的密度，加入vb12-fitc，在不同時(shí)間段固定細(xì)胞，用dapi染細(xì)胞核，并用激光共聚焦觀(guān)察vb12-fitc的吸收部位及吸收量。

(4)vb12-fitc的在體腫瘤顯像：利用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)，在胃癌細(xì)胞(ags)中穩(wěn)定轉(zhuǎn)入表達(dá)紅光載體片段，進(jìn)而擴(kuò)大培養(yǎng)細(xì)胞。取1×10⁷細(xì)胞，注射入裸鼠皮下，構(gòu)建胃癌裸鼠模型。在尾靜脈注射vb12-fitc前后，分別用活體成像儀觀(guān)察vb12的腫瘤靶向性。

質(zhì)譜分析結(jié)果如圖1所示：fitc標(biāo)記的維生素b12，經(jīng)過(guò)離子化后帶上二價(jià)電荷，出現(xiàn)不同質(zhì)荷比的離子碎片(1007.41、1020.92，1034.42豐度最高)是因?yàn)閒itc標(biāo)記的維生素b12分子結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，離子化過(guò)程帶上不同數(shù)量的正離子(na⁺、k⁺或h⁺)，如1034的離子碎片帶上了兩個(gè)鉀離子、三個(gè)鉀離子和3個(gè)氫離子：1034×2-1918(fitc-vb12)＝39(k⁺)×2+23(na⁺)×3+3×1(h⁺)。

高效液相色譜法分析如圖2所示：用熒光檢測(cè)器fld，采用fitc的激發(fā)波長(zhǎng)490nm，發(fā)射波長(zhǎng)為520nm，從高效液相的流出曲線(xiàn)看，fitc修飾vb12后，分子極性發(fā)生變化，相比f(wàn)itc，更快流出柱子，fitc-vb12的流出時(shí)間為15.1min，fitc的流出時(shí)間為16.8min。從fitc-vb12的流出曲線(xiàn)看，沒(méi)反應(yīng)的fitc的殘留非常少，說(shuō)明標(biāo)記效率較高。

流式分析結(jié)果如圖3所示：ags在fitc通道有90.9％的陽(yáng)性率，這提示ags胃癌細(xì)胞對(duì)vb12-fitc有高度攝取能力。

共聚焦顯微鏡結(jié)果如圖4所示：隨著時(shí)間增加，fitc標(biāo)記維生素b12的胃癌細(xì)胞的吸收量逐漸增加。

活體成像結(jié)果如圖5所示：在胃癌裸鼠模型中，fitc標(biāo)記維生素b12在腫瘤部位高度聚集。