本發(fā)明涉及牛白血病病毒檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一組用于檢測(cè)牛白血病病毒的引物及試劑盒。

背景技術(shù)：

牛白血病是由牛白血病病毒引起的牛的一種慢性腫瘤性疾病。病的特征為淋巴樣細(xì)胞惡性增生、進(jìn)行性惡病質(zhì)和全身淋巴結(jié)腫大，病死率高。目前用于牛白血病病毒檢測(cè)的技術(shù)有電鏡檢測(cè)、血清學(xué)檢測(cè)、分子生物學(xué)檢測(cè)等。

但電鏡檢測(cè)操作繁瑣，需要固定、脫干、墊入、分割和染色等一系列步驟，耗時(shí)相對(duì)較長(zhǎng)。同時(shí)由于微生物種類繁多，有一定的主觀性，對(duì)于操作人員要求較高，并且需要特殊儀器，不易在基層和大規(guī)模的檢測(cè)。

血清學(xué)檢測(cè)方法抗原上必須存在與所用抗體結(jié)合的抗原決定簇，使抗原抗體能夠產(chǎn)生特異性的結(jié)合反應(yīng)。基因突變，核苷酸相位改變等因素會(huì)導(dǎo)致某些位點(diǎn)的不表達(dá)或者結(jié)合位點(diǎn)的阻斷，影響抗體與抗原的結(jié)合，造成假陰性結(jié)果。抗原抗體結(jié)合遵循一定的量比關(guān)系，只有當(dāng)二者濃度比例適當(dāng)時(shí)才出現(xiàn)可見反應(yīng)，并且會(huì)受外界因素影響。操作過程中對(duì)樣品要求較高，需要及時(shí)分離血清，溶血也會(huì)對(duì)結(jié)果造成不利影響。血清學(xué)實(shí)驗(yàn)的假陽(yáng)性和假陰性是不能完全避免的，靈敏度并不高并且檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)、操作復(fù)雜。

PCR是目前在病原檢測(cè)中最常用的方法。但普通PCR和巢式PCR都需要結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳試驗(yàn)進(jìn)行結(jié)果的判定，操作較為繁瑣且耗時(shí)較長(zhǎng)，無(wú)法達(dá)到快速檢測(cè)的效果。實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)儀器要求較高，無(wú)法大規(guī)模的推廣。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一組用于檢測(cè)牛白血病病毒的引物及試劑盒。本發(fā)明提供的檢測(cè)牛白血病病毒的引物及試劑盒能夠?qū)崿F(xiàn)牛白血病病毒的高特異性、高靈敏度檢測(cè)，操作簡(jiǎn)單、結(jié)果肉眼可測(cè)。

本發(fā)明提供了一組用于檢測(cè)牛白血病病毒的引物，包括外引物對(duì)、內(nèi)引物對(duì)和環(huán)引物對(duì)；所述外引物對(duì)的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；所述內(nèi)引物對(duì)的序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；所述環(huán)引物對(duì)的序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

本發(fā)明還提供了一種基于上述技術(shù)方案所述引物的試劑盒，包括：8000U/mLBst 2.0DNA聚合酶；5×Buffer；10mM dNTPs；上述技術(shù)方案所述引物；鈣黃綠素?zé)晒怙@色劑；牛白血病病毒陽(yáng)性DNA模板；

所述5×Buffer包括：100mM且pH值為8.8的Tris-HCl、250mM的氯化鉀、50mM的硫酸銨、40mM的硫酸鎂和體積百分濃度為0.1％的吐溫-20；

所述鈣黃綠素?zé)晒怙@色劑包括鈣黃綠素和錳離子。

優(yōu)選的是，100次規(guī)格的試劑盒包括2mL 5×Buffer，1.2mL上述技術(shù)方案所述引物；0.4mLBst 2.0DNA聚合酶，1.4mL 10mM dNTPs，0.4mL鈣黃綠素?zé)晒怙@色劑、0.4mL牛白血病病毒陽(yáng)性DNA模板。

本發(fā)明提供了一組用于檢測(cè)牛白血病病毒的引物。本發(fā)明提供的檢測(cè)牛白血病病毒的引物能與牛白血病病毒保守區(qū)域的不同部位結(jié)合，特異性高，單個(gè)反應(yīng)可擴(kuò)增10個(gè)拷貝的牛白血病病毒。本發(fā)明的引物結(jié)合試劑盒應(yīng)用在環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)中能夠?qū)崿F(xiàn)牛白血病病毒的高特異性、高靈敏度檢測(cè)，操作簡(jiǎn)單、結(jié)果肉眼可測(cè)。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1提供的LAMP方法特異性檢測(cè)結(jié)果圖；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例1提供的LAMP方法靈敏度驗(yàn)證電泳結(jié)果圖；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例1提供的顯色反應(yīng)檢測(cè)結(jié)果圖；

圖4為本發(fā)明對(duì)照例1提供的LAMP方法與常規(guī)實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法敏感性對(duì)比結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供了一組用于檢測(cè)牛白血病病毒的引物，包括外引物對(duì)、內(nèi)引物對(duì)和環(huán)引物對(duì)；所述外引物對(duì)的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；所述內(nèi)引物對(duì)的序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；所述環(huán)引物對(duì)的序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

在本發(fā)明中，所述外引物對(duì)(F3和B3)、內(nèi)引物對(duì)(FIP和BIP)和環(huán)引物對(duì)(LF和LB)的組合能夠縮短環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增(LAMP,Loop-mediated isothermal amplification)反應(yīng)時(shí)間，提高擴(kuò)增效率。在具體應(yīng)用中，所述外引物、內(nèi)引物和環(huán)引物的反應(yīng)終濃度優(yōu)選分別為0.2μM、1.6μM和0.8μM。本發(fā)明對(duì)所述引物的制備方法沒有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的生物公司對(duì)引物進(jìn)行人工合成即可。

本發(fā)明還提供了一種基于上述技術(shù)方案所述引物的試劑盒，包括：8000U/mLBst 2.0DNA聚合酶；5×Buffer；10mM dNTPs；上述技術(shù)方案所述引物；鈣黃綠素?zé)晒怙@色劑；牛白血病病毒陽(yáng)性DNA模板；

所述5×Buffer包括：100mM且pH值為8.8的Tris-HCl、250mM的氯化鉀、50mM的硫酸銨、40mM的硫酸鎂和體積百分濃度為0.1％的吐溫-20。

本發(fā)明對(duì)所述Bst 2.0DNA聚合酶、dNTPs、鈣黃綠素?zé)晒怙@色劑的來(lái)源沒有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的Bst 2.0DNA聚合酶、dNTPs和鈣黃綠素?zé)晒怙@色劑常規(guī)市售產(chǎn)品即可。在本發(fā)明中，所述鈣黃綠素?zé)晒怙@色劑包括鈣黃綠素和錳離子；本發(fā)明對(duì)鈣黃綠素和錳離子的摩爾比沒有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的鈣黃綠素和錳離子的摩爾比即可，如1：(10～12)。本發(fā)明對(duì)所述牛白血病病毒陽(yáng)性DNA模板的來(lái)源沒有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的牛白血病陽(yáng)性病毒市售產(chǎn)品即可。在本發(fā)明中，所述牛白血病病毒陽(yáng)性DNA模板優(yōu)選采用全核酸提取試劑盒從牛白血病陽(yáng)性病毒中提取，所述全核酸提取試劑盒優(yōu)選采用美國(guó)Roche公司的High-Pure PCRTemplate PreparationKit。

在本發(fā)明中，所述5×Buffer包括：100mM且pH值為8.8的Tris-HCl、250mM的氯化鉀、50mM的硫酸銨、40mM的硫酸鎂和體積百分濃度為0.1％的吐溫-20。本發(fā)明對(duì)所述Tris、氯化鉀、硫酸銨、硫酸鎂和吐溫-20的來(lái)源沒有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的Tris、氯化鉀、硫酸銨、硫酸鎂和吐溫-20的市售產(chǎn)品即可。在本發(fā)明中，用于溶液配制的水均選用無(wú)菌雙蒸水。

本發(fā)明對(duì)所述試劑盒的規(guī)格沒有特殊的限定，所述試劑盒的使用次數(shù)包括10次、50次、100次或200次。100次規(guī)格的試劑盒包括2mL 5×Buffer，1.2mL上述技術(shù)方案所述引物；0.4mL Bst 2.0DNA聚合酶，1.4mL 10mM dNTPs，0.4mL鈣黃綠素?zé)晒怙@色劑、4mL牛白血病病毒陽(yáng)性DNA模板。

在本發(fā)明中，所述試劑盒的使用方法為采用環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)；所述使用方法為：將上述技術(shù)方案所述試劑盒中的組分按比例混勻，加入待檢樣品DNA，在65℃反應(yīng)45min，將反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，出現(xiàn)特異梯狀條帶則為陽(yáng)性，沒有條帶出現(xiàn)則為陰性。在本發(fā)明中，所述環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系優(yōu)選為：每25μl反應(yīng)體系包括5μL 5×Buffer，3μL上述技術(shù)方案所述引物；1μLBst 2.0DNA聚合酶，3.5μL 10mM dNTPs，1μL鈣黃綠素?zé)晒怙@色劑，10μL待檢樣品DNA，1.5μL滅菌雙蒸水。陽(yáng)性對(duì)照將待檢樣品DNA替換為牛白血病病毒陽(yáng)性DNA模板，陰性對(duì)照將待檢樣品DNA替換為滅菌雙蒸水；所述外引物、內(nèi)引物和環(huán)引物反應(yīng)的終濃度優(yōu)選分別為0.2μM、1.6μM和0.8μM。

在本發(fā)明中，所述瓊脂糖凝膠中瓊脂糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2％。

在本發(fā)明中，所述待檢樣品DNA優(yōu)選采用全核酸提取試劑盒對(duì)牛血樣樣品進(jìn)行提取。本發(fā)明對(duì)所述全核酸提取試劑盒的來(lái)源沒有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的全核酸提取試劑盒的市售產(chǎn)品即可，如美國(guó)Roche公司的High-Pure PCRTemplate PreparationKit。

環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增方法(LAMP,Loop-mediated isothermal amplification)通常是針對(duì)待檢測(cè)基因的6個(gè)特異性區(qū)域設(shè)計(jì)4條擴(kuò)增引物，由一對(duì)外引物(F3、B3)和一對(duì)內(nèi)引物(FIP、BIP)所組成，在本發(fā)明中，為了縮短反應(yīng)時(shí)間，提高擴(kuò)增效率，在此基礎(chǔ)上還增加一對(duì)環(huán)引物(LF、LB)。在本發(fā)明中，通過利用鏈置換型DNA聚合酶(Bst2.0DNA聚合酶)，在恒溫環(huán)境65℃下，45分鐘以內(nèi)高效擴(kuò)增出靶序列。雙鏈DNA在65℃時(shí)會(huì)處于動(dòng)態(tài)平衡的狀態(tài)。任何引物與雙鏈DNA互補(bǔ)部分進(jìn)行堿基配對(duì)延伸時(shí)，另一條鏈會(huì)脫落成為單鏈。內(nèi)引物FIP與單鏈的模板DNA上互補(bǔ)區(qū)段接合，與模板DNA鏈互補(bǔ)。外引物F3通過置換型DNA聚合酶的作用，一邊將剛才由FIP引物合成的DNA鏈剝離，一邊合成新的DNA鏈。剝離的DNA單鏈由于在5’末端含有互補(bǔ)的區(qū)段，通過自我堿基配對(duì)形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。內(nèi)引物BIP和外引物B3同上述原理類似，此時(shí)剝離的單鏈DNA在3’與5’末端均有互補(bǔ)區(qū)段，整條鏈形成如同啞鈴狀的結(jié)構(gòu)，作為擴(kuò)增的起始結(jié)構(gòu)。啞鈴狀結(jié)構(gòu)的DNA鏈，以自身為模板進(jìn)行DNA合成延伸，一邊不斷形成這種啞鈴狀結(jié)構(gòu)的DNA鏈，一邊周而復(fù)始地?cái)U(kuò)增，形成大量反向重復(fù)的環(huán)狀結(jié)構(gòu)和啞鈴狀結(jié)構(gòu)化的靶基因DNA片段所組成的混合物。在此基礎(chǔ)上，在環(huán)狀結(jié)構(gòu)的5’末端的環(huán)狀單鏈部分導(dǎo)入具有互補(bǔ)序列的環(huán)引物L(fēng)B和LF，增加DNA合成的起點(diǎn)。

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的一組用于檢測(cè)牛白血病病毒的引物及試劑盒做進(jìn)一步詳細(xì)的介紹，本發(fā)明的技術(shù)方案包括但不限于以下實(shí)施例。

實(shí)施例1

1、準(zhǔn)備反應(yīng)引物2×oligo：

在340μL雙蒸水中加入外引物上下游(F3/B3)各10μL，內(nèi)引物上下游(FIP/BIP)各80μL和環(huán)引物上下游(LF/LB)各40μL。所述引物序列如表1所示：

表1引物序列

2、LAMP反應(yīng)體系組分配制

(1)5×Buffer：包含100mM Tris-HCl(pH 8.8，25℃)、250mM氯化鉀、50mM硫酸銨、40mM硫酸鎂、體積百分濃度為0.1％的吐溫-20。

(2)8000U/mLBst2.0DNA聚合酶；

(3)10mM dNTPs；

(4)LAMP引物組(所述步驟1的外引物、內(nèi)引物和環(huán)引物)，各組引物加入后的終濃度分別為：外引物濃度為0.2μM，內(nèi)引物濃度為1.6μM，環(huán)引物濃度為0.8μM；

(5)反應(yīng)指示劑：鈣黃綠素?zé)晒怙@色劑；

(6)滅菌雙蒸水；

(7)陽(yáng)性對(duì)照：牛白血病病毒陽(yáng)性的DNA模板。

(8)陰性對(duì)照：滅菌雙蒸水。

3、LAMP檢測(cè)反應(yīng)體系如表2所示。

表2 LAMP反應(yīng)體系

將反應(yīng)體系配制于PCR管中，同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照；

LAMP反應(yīng)條件：將含反應(yīng)體系的PCR管混勻后離心，置于恒溫環(huán)境65℃反應(yīng)45min，取出。

特異性試驗(yàn)

選取本實(shí)驗(yàn)室研究所確定的牛白血病病毒陽(yáng)性樣品B1195、B1256、B1384、B1412、B1413和已確定的陰性樣品B762、B1402、B1408、B1432、B1440進(jìn)行LAMP檢測(cè)方法的特異性試驗(yàn)，以驗(yàn)證本研究檢測(cè)方法的特異性。使用2％濃度瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，陽(yáng)性則可呈現(xiàn)典型的特異梯狀條帶，陰性則無(wú)此現(xiàn)象。LAMP方法特異性檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。其中，泳道M為DL-100DNA Marker；泳道1-5為PCR鑒定牛白血病病毒陽(yáng)性樣品分別為B1195、B1256、B1384、B1412、B1413；泳道6-10為PCR鑒定牛白血病病毒陰性樣品B762、B1402、B1408、B1432、B1440；泳道11為陰性對(duì)照。通過圖1的結(jié)果可知，標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板呈陽(yáng)性，陰性對(duì)照呈陰性，空白孔呈陰性，本方法可以特異性的檢測(cè)出牛白血病病毒DNA。

將樣品B1360進(jìn)行PCR擴(kuò)增并進(jìn)行切膠回收，經(jīng)核酸濃度測(cè)算，含量約2×10¹⁰拷貝/μL的模板DNA進(jìn)行10倍梯度稀釋，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線。將樣品B1349進(jìn)行熒光定量PCR進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)算出核酸濃度，為80拷貝/μL，將此模板進(jìn)行稀釋，分別稀釋為10拷貝/μL，1拷貝/μL，0.1拷貝/μL。每個(gè)稀釋度的基因組DNA作為模板，分別進(jìn)行LAMP檢測(cè)反應(yīng)的敏感性試驗(yàn)，同時(shí)，將其用本實(shí)驗(yàn)室所建立的實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，作為敏感性對(duì)照試驗(yàn)。本發(fā)明渾濁度檢測(cè)結(jié)果如表3所示：

表3渾濁度檢測(cè)結(jié)果

LAMP方法靈敏度驗(yàn)證電泳結(jié)果圖如圖2所示，其中，泳道M為DL-100DNAMarker；泳道1-4的樣品濃度分別為80拷貝數(shù)/μL、10拷貝數(shù)/μL、1拷貝數(shù)/μL、0.1拷貝數(shù)/μL；泳道5為陰性對(duì)照。由圖2可知，80拷貝數(shù)/μL、10拷貝數(shù)/μL、1拷貝數(shù)/μL三個(gè)稀釋梯度的陽(yáng)性模板能被檢出，最低檢測(cè)限為1拷貝數(shù)/μL。

顯色試驗(yàn)

LAMP反應(yīng)后，可用肉眼觀察，如液體變混濁，說明待檢樣品中為牛白血病病毒陽(yáng)性。或觀察顏色變化，顏色變?yōu)榫G色，則說明樣品中含有牛白血病病毒基因；顏色仍為橙色，說明樣品為陰性。顯色反應(yīng)檢測(cè)結(jié)果如圖3所示，圖中反應(yīng)孔1、2、3、4、5分別80拷貝數(shù)/μL、10拷貝數(shù)/μL、1拷貝數(shù)/μL、0.1拷貝數(shù)/μL濃度模板以及陰性對(duì)照。如圖所示，反應(yīng)孔1、2、3顏色變?yōu)榫G色，則為陽(yáng)性，說明中80拷貝數(shù)/μL、10拷貝數(shù)/μL、1拷貝數(shù)/μL濃度模板中含有牛白血病病毒基因；反應(yīng)孔4顏色為橙色，說明0.1拷貝數(shù)/μL濃度模板無(wú)法檢測(cè)出牛白血病病毒基因；反應(yīng)孔5顏色為橙色，則為陰性，說明陰性對(duì)照無(wú)牛白血病病毒基因。

對(duì)照例1

采用實(shí)施例1LAMP方法與常規(guī)實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法進(jìn)行敏感性對(duì)比實(shí)驗(yàn)。敏感性對(duì)比結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，在LAMP試驗(yàn)中，1拷貝/μL即10拷貝/反應(yīng)可以確保檢測(cè)出。0.1拷貝/μL即單拷貝/反應(yīng)有一定概率出現(xiàn)。而實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果同LAMP相同，1拷貝/μL即10拷貝/反應(yīng)可以確保檢測(cè)出。0.1拷貝/μL即單拷貝/反應(yīng)有一定概率出現(xiàn)，有時(shí)曲線會(huì)跳孔。結(jié)果表明，本研究LAMP方法檢測(cè)靈敏度跟實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法要在同一個(gè)數(shù)量級(jí)。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 鎮(zhèn)江威特藥業(yè)有限責(zé)任公司

<120> 一組用于檢測(cè)牛白血病病毒的引物及試劑盒

<130> 2017

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

accttcccat gactcaggc 19

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ctcccgaggc ttcgacta 18

<210> 3

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tggtgtagct cccatctggt ctctttctcg agccctctgg a 41

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ttcagagggc ggagaaacac ccaccgacga ttgttttgcc 40

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggtaggaggt taatctgatt gtgag 25

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

caagggctct gataaactct ttttg 25