本發(fā)明屬于特色民族藥用植物中的有效成分提取分離以及活性篩選的技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種香豆素類化合物及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

當(dāng)歸為傘形科植物當(dāng)歸angelicasinensis(oliv.)diels的干燥根。其性溫，味甘、辛，具有補(bǔ)血活血、調(diào)經(jīng)止血、潤腸滑腸之功效，是常用中藥材，醫(yī)家素有“十方九歸”之稱，除中醫(yī)處方配方用藥外，含當(dāng)歸的中成藥就多達(dá)80余種。研究表明，當(dāng)歸屬植物主要含有多糖、有機(jī)酸、黃酮、藁苯內(nèi)酯和香豆素等多種類型的化合物。大量的現(xiàn)代藥理研究報(bào)道表明，當(dāng)歸及其主要化學(xué)成分表現(xiàn)出廣泛的生物活性，對造血系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等均有藥理作用。研究還表明，從當(dāng)歸的丙酮提取物以及從中得到的一些重要活性成分，其體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)研究均顯示一定的抗腫瘤活性。就是這樣的一類化合物,是廣泛存在于大戟科植物的一種重要的天然活性成分,其結(jié)構(gòu)如下：

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技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一目的是提供一種香豆素類化合物；第二目的在于提供所述香豆素類化合物的制備方法；第三目的在于提供所述香豆素類化合物在制備抗癌中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第一目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，所述的香豆素類化合物是以傘形科植物當(dāng)歸angelicasinensis(oliv.)diels的干燥根為原料，經(jīng)有機(jī)溶劑提取、萃取、硅膠柱層析、高壓液相色譜分離步驟而得到的，其結(jié)構(gòu)式為：

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所述的香豆素1化合物，其特征是：分子式為c16h12o4，該化合物命名6-羥基-3-（4-羥基苯）-7-甲基-香豆素(1)，英文名為6-hydroxy-3-(4-hydroxyphenyl)-7-methyl-coumarin(1)。

本發(fā)明的第二目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，所述的香豆素類化合物是以傘形科植物當(dāng)歸angelicasinensis(oliv.)diels的干燥根為原料，經(jīng)有機(jī)溶劑提取、萃取、硅膠柱層析、高壓液相色譜分離步驟而得到的，具體為：

一種權(quán)利要求1所述的香豆素類化合物的制備方法，其特征在于以傘形科植物當(dāng)歸angelicasinensis(oliv.)diels的干燥根為原料，經(jīng)有機(jī)溶劑提取、萃取、硅膠柱層析、高壓液相色譜分離步驟而得到的，具體為：

a、樣品浸膏有機(jī)溶劑提取過程：將藥用植物傘形科植物當(dāng)歸angelicasinensis(oliv.)diels的干燥根用有機(jī)溶劑超聲提取3~5次，每次30~60分鐘，提取液過濾，減壓濃縮提取液，靜置，濾除沉淀物，濃縮成浸膏a；

b、有機(jī)溶劑萃取：a步驟所得的浸膏a中加入重量比1~2倍量的有機(jī)溶劑萃取3~5次，合并有機(jī)溶劑萃取相，減壓濃縮成浸膏b；

c、硅膠柱層析：將b步驟所得的浸膏b用重量比1~2倍量的甲醇或者丙酮溶解，用浸膏重0.8~1.2倍的80~100目硅膠拌樣，然后上硅膠柱層析（裝柱硅膠為100~200目），用量為浸膏b重量7~10倍量；用體積比為1:0~0:1的混合有機(jī)溶劑梯度洗脫，收集梯度洗脫液、濃縮，經(jīng)tlc監(jiān)測，合并相同的部分；

d、將8:2洗脫部分再次用體積比為8:2~4:6混合有機(jī)溶劑洗脫；

e、高效液相色譜分離：將體積比6:4氯仿-丙酮溶液洗脫得到的洗脫液經(jīng)高效液相色譜分離純化，即得所述的香豆素類化合物香豆素1；該步驟所述的高效液相色譜分離純化是以60-80%的甲醇或者45~75%的乙腈為流動(dòng)相，流速8~12ml/min，21.2×250mm，5μm的zorbaxprephtgf反相制備柱為固定相，紫外檢測器檢測波長為202~280nm，每次進(jìn)樣10~100μl，收集10~40min的色譜峰，多次累加后蒸干。即得所述香豆素類化合物香豆素1；

其中a步驟所述的有機(jī)溶劑為95%的乙醇，b步驟所述的有機(jī)溶劑為乙酸乙酯，c步驟所述的混合有機(jī)溶劑氯仿和甲醇的體積配比為20:1,9:1,8:2,7:3,6:4和1:1，d步驟所述的混合有機(jī)溶劑氯仿和丙酮的體積配比為8:2,7:3,6:4,5:5,和4:6。

本發(fā)明香豆素1結(jié)構(gòu)是通過核磁共振和質(zhì)譜測定方法確定為香豆素類化合物，并表征其具體結(jié)構(gòu)為：

化合物香豆素1能通過本發(fā)明的方法分離出來。

本發(fā)明的第三目的是這樣實(shí)現(xiàn)的：以香豆素1為原料，經(jīng)對白血病急性早幼粒nb4細(xì)胞、肺腺癌a549細(xì)胞、人骨髓神經(jīng)母細(xì)胞瘤shsy5y細(xì)胞、人前列腺癌pc3細(xì)胞、人乳腺癌mcf7細(xì)胞的細(xì)胞毒活性測試，其ic50值均小于10μm/l。其中對a549和mcf7細(xì)胞具有較高的細(xì)胞毒活性，其ic50值分別為3.2和2.8μm/l。

本發(fā)明化合物結(jié)構(gòu)簡單活性好，可作為抗癌的先導(dǎo)性化合物，在藥物發(fā)現(xiàn)方面有良好的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為化合物香豆素1的核磁共振碳譜（¹³cnmr）。

圖2為化合物香豆素1的核磁共振氫譜（¹hnmr）。

圖3化合物的¹h和¹³cnmr數(shù)據(jù)（溶劑為c5d5n）(100and400mhz)。

圖4化合物香豆素1的細(xì)胞毒活性。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但不以任何方式對本發(fā)明加以限制，基于本發(fā)明教導(dǎo)所作的任何變換或改進(jìn)，均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明所述的香豆素類化合物是以藥用植物傘形科植物當(dāng)歸angelicasinensis(oliv.)diels的干燥根為原料，經(jīng)有機(jī)溶劑提取、萃取、硅膠柱層析、高壓液相色譜分離步驟而得到的，其結(jié)構(gòu)式為：

所述的香豆素1化合物，其特征是：分子式為c16h12o4，該化合物命名6-羥基-3-（4-羥基苯）-7-甲基-香豆素(1)，英文名為6-hydroxy-3-(4-hydroxyphenyl)-7-methyl-coumarin(1)。

本發(fā)明的第二目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，所述的香豆素類化合物是以藥用植物傘形科植物當(dāng)歸angelicasinensis(oliv.)diels的干燥根為原料，經(jīng)有機(jī)溶劑提取、萃取、硅膠柱層析、高壓液相色譜分離步驟而得到的，具體為：

一種權(quán)利要求1所述的香豆素類化合物的制備方法，其特征在于以藥用植物傘形科植物當(dāng)歸angelicasinensis(oliv.)diels的干燥根為原料，經(jīng)有機(jī)溶劑提取、萃取、硅膠柱層析、高壓液相色譜分離步驟而得到的，具體為：

a、樣品浸膏有機(jī)溶劑提取過程：將藥用植物傘形科植物當(dāng)歸angelicasinensis(oliv.)diels的干燥根用有機(jī)溶劑超聲提取3~5次，每次30~60分鐘，提取液過濾，減壓濃縮提取液，靜置，濾除沉淀物，濃縮成浸膏a；

b、有機(jī)溶劑萃取：a步驟所得的浸膏a中加入重量比1~2倍量的有機(jī)溶劑萃取3~5次，合并有機(jī)溶劑萃取相，減壓濃縮成浸膏b；

c、硅膠柱層析：將b步驟所得的浸膏b用重量比1~2倍量的甲醇或者丙酮溶解，用浸膏重0.8~1.2倍的80~100目硅膠拌樣，然后上硅膠柱層析（裝柱硅膠為100~200目），用量為浸膏b重量7~10倍量；用體積比為1:0~0:1的混合有機(jī)溶劑梯度洗脫，收集梯度洗脫液、濃縮，經(jīng)tlc監(jiān)測，合并相同的部分；

d、將8:2洗脫部分再次用體積比為8:2~4:6混合有機(jī)溶劑洗脫；

e、高效液相色譜分離：將體積比6:4氯仿-丙酮溶液洗脫得到的洗脫液經(jīng)高效液相色譜分離純化，即得所述的香豆素類化合物香豆素1；該步驟所述的高效液相色譜分離純化是以60-80%的甲醇或者45~75%的乙腈為流動(dòng)相，流速8~12ml/min，21.2×250mm，5μm的zorbaxprephtgf反相制備柱為固定相，紫外檢測器檢測波長為202~280nm，每次進(jìn)樣10~100μl，收集10~40min的色譜峰，多次累加后蒸干。即得所述香豆素類化合物香豆素1；

其中a步驟所述的有機(jī)溶劑為95%的乙醇，其中b步驟所述的有機(jī)溶劑為乙酸乙酯，其中c步驟所述的混合有機(jī)溶劑氯仿和甲醇的體積配比為20:1,9:1,8:2,7:3,6:4和1:1，d步驟所述的混合有機(jī)溶劑氯仿和丙酮的體積配比為8:2,7:3,6:4,5:5,和4:6。

本發(fā)明所述的香豆素類化合物在制備抗癌藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明所述的傘形科當(dāng)歸植物不受地區(qū)和品種限制，均可以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。

實(shí)施例1

取藥用植物傘形科植物當(dāng)歸angelicasinensis(oliv.)diels的干燥根1.6kg，粗粉碎至40目，用95%的乙醇超聲提取4次，每次30分鐘，提取液合并；提取液過濾，減壓濃縮至體積的1/4；靜置，濾除沉淀物，濃縮成85.3g的浸膏a；在浸膏a中加入130g乙醇，用與乙醇等體積的乙酸乙酯萃取5次，合并萃取相，減壓濃縮成43g浸膏b；浸膏b在浸膏b中加入70g的丙酮溶解，然后加入100目硅膠43g拌樣，拌樣后，用200目硅膠200g裝柱；用體積比分別為20:1,9:1,8:2,7:3,6:4和1:1的氯仿-甲醇混合有機(jī)溶劑梯度洗脫，收集梯度洗脫液、濃縮，經(jīng)tlc監(jiān)測，合并相同的部分，得到6個(gè)部分a-f，其中，對收集到的樣品4部分4.42g，再重復(fù)硅膠柱層析，用體積比分別為8:2,7:3,6:4,5:5,4:6和純丙酮的氯仿-丙酮混合有機(jī)溶劑梯度洗脫，收集梯度洗脫液、濃縮，經(jīng)tlc監(jiān)測，合并相同的部分，得到6個(gè)部分b1-b6，其中第b3部分，即6:4部分約250mg,再以38%的甲醇為流動(dòng)相，流速10ml/min，21.2×250mm，5μm的zorbaxprephtgf反相制備柱為固定相，紫外檢測器檢測波長為254nm，每次進(jìn)樣50μl，收集25min的色譜峰，多次累加后蒸干，即得所述的香豆素類化合物香豆素1。

實(shí)施例2

取藥用植物傘形科植物當(dāng)歸angelicasinensis(oliv.)diels的干燥根10.0kg，粗粉碎至40目，用95%的乙醇冷浸提取4次，每次3天，提取液合并；提取液過濾，減壓濃縮至體積的1/4；靜置，濾除沉淀物，濃縮成360g浸膏a；在浸膏a中加入400g乙醇，用與乙醇等體積的石油醚萃取5次，合并萃取相，減壓濃縮成158g浸膏b；浸膏b中加入300g的丙酮溶解，然后加入100目硅膠158g拌樣，用200目硅膠1.1kg裝柱，拌樣后上柱；用體積比分別為20:1,9:1,8:2,7:3,6:4和1:1的石油醚-乙酸乙酯混合有機(jī)溶劑梯度洗脫，收集梯度洗脫液、濃縮，經(jīng)tlc監(jiān)測，合并相同的部分，得到6個(gè)部分a-f，其中，對收集到的樣品b部分36g，再重復(fù)硅膠柱層析，用體積比9:1-1:2的石油醚-丙酮混合有機(jī)溶劑梯度洗脫，收集梯度洗脫液、濃縮，經(jīng)tlc監(jiān)測，合并相同的部分，得到6個(gè)部分b1-b6，其中第b3部分，即7:3部分約3.8g,再以43%的乙腈為流動(dòng)相，流速10ml/min，21.2×250mm，μm的zorbaxprephtgf反相制備柱為固定相，紫外檢測器檢測波長為254nm，每次進(jìn)樣80μl，收集15min的色譜峰，多次累加后蒸干，即得所述的香豆素類化合物香豆素1。

實(shí)施例3

取實(shí)施例1制備的化合物香豆素1，為橙黃色膠狀物；測定方法為：用核磁共振，結(jié)合其它波譜技術(shù)鑒定結(jié)構(gòu)。

（1）紫外光譜（溶劑為甲醇），λmax(logε):282(3.78),231(4.13),210(4.28)nm；

（2）紅外光譜（溴化鉀壓片）νmax：νmax3448,1715,1600,1543,1482,1421,1356,1269,1164,1048,893,762cm^-1；

（3）hresims顯示本發(fā)明化合物準(zhǔn)分子離子峰m/z267.0663[m-h]^-（計(jì)算值為267.0657），結(jié)合¹³c和¹hnmr譜（圖1和圖2，碳譜氫譜數(shù)據(jù)歸屬見圖3）給出其分子式為c16h12o4，其不飽和度為8，¹hnmr（c5d5n，400mhz）和¹³cnmr（c5d5n，100mhz）數(shù)據(jù)，見圖3。

實(shí)施例4

取實(shí)施例2制備的化合物香豆素1分別按實(shí)施例3中的方法進(jìn)行結(jié)構(gòu)測定，結(jié)果為：其結(jié)構(gòu)同實(shí)施例3，分子式為c16h12o4。

實(shí)施例5

取實(shí)施例1和2所制備的任一香豆素類化合物進(jìn)行細(xì)胞毒活性檢測試驗(yàn)，試驗(yàn)情況如下：

細(xì)胞株：白血病細(xì)胞(nb4)、肺癌細(xì)胞(a549)、人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(shsy5y)、前列腺癌細(xì)胞(pc3)、乳腺癌細(xì)胞(mcf7)均由中國科學(xué)院上海藥物研究所提供；

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：以上細(xì)胞與不同濃度化合物溫育72小時(shí),每株細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)均重復(fù)一次,用兩次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,采用改良mtt法及srb法評價(jià)化合物對細(xì)胞增殖的抑制程度,計(jì)算抑制率,根據(jù)抑制率采用logit方法計(jì)算ic50,比較化合物的體外抗腫瘤活性：

細(xì)胞的增殖抑制率=(空白對照od值-加藥孔的od值)/空白對照od值×100%。

(a)改良mtt法

取處于對數(shù)生長期的懸浮細(xì)胞,將細(xì)胞濃度調(diào)整為4×10⁴/ml,加入96孔培養(yǎng)板,90μl/孔。陽性對照為順鉑,用生理鹽水溶解。每孔分別加入10μl不同濃度的樣品(1號試液-5號試液)。加樣組及對照組均設(shè)4個(gè)復(fù)孔,加樣組、陽性對照組的高濃度組還設(shè)培養(yǎng)基的加藥平行孔,每塊板均設(shè)有4個(gè)空白對照孔(僅加培養(yǎng)基)。樣品的終濃度分別為10^-2、10^-1、1、10及10²μg/ml,相應(yīng)dmso的終濃度分別為0.1%、0.01%、0.001%、0.0001%、0.00001%。樣品在終濃度10²μg/ml時(shí),用0.1%dmso作為溶劑對照,其余濃度均用生理鹽水作陰性對照。陽性對照藥順鉑的終濃度為10^-1、1、10μg/ml。細(xì)胞在37℃,5%co2培養(yǎng)箱中分別孵育48h后,加入mtt(5mg/ml,sigma),10μl/孔。繼續(xù)培養(yǎng)4h后,加入三聯(lián)液[10%sds–5%異丁醇–0.012mol/lhcl(w/v/v)],100μl/孔,放置過夜后用酶標(biāo)儀在570nm、630nm雙波長下測定各孔的od值。

(b)srb法

取處于對數(shù)生長期的貼壁細(xì)胞株,用25%胰酶常規(guī)消化后,再用15%小牛血清完全rpmi-1640培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度調(diào)整為5×10⁴/ml,加入96孔培養(yǎng)板,90μl/孔。細(xì)胞在37℃,5%co2培養(yǎng)箱中分別孵育24h后加入陽性對照、陰性對照以及受試樣品(各受試濃度同上mtt法，10μl/孔)，樣品的終濃度分別為10^-2、10^-1、1、10、10²μg/ml,相應(yīng)dmso的終濃度分別為0.1%、0.01%、0.001%、0.0001%、0.00001%。樣品在終濃度10²μg/ml時(shí)用0.1%dmso作為溶劑對照,其余濃度均用生理鹽水作陰性對照。陽性對照藥的終濃度為10^-1、1、10μg/ml,陰性對照為等體積的生理鹽水。加樣組及對照組均設(shè)4復(fù)孔,加樣組、陽性對照組的高濃度組還設(shè)培養(yǎng)基的加藥平行孔,每塊板均設(shè)有4個(gè)空白對照孔(僅加培養(yǎng)基)。將96孔培養(yǎng)板置于37℃,5%co2培養(yǎng)箱中孵育(細(xì)胞與樣品作用)48h后,加入4℃、50%的tca(三氯乙酸)50μl/孔。加完tca后,將96孔培養(yǎng)板置于4℃孵育1小時(shí),取出培養(yǎng)板,輕輕傾去板內(nèi)液體。用自來水輕輕沖洗5遍(將自來水由燒杯中輕輕倒入板中,輕晃后再將水倒去),置于空氣中風(fēng)干至不見水痕。然后加入配制好的0.4%srb(用1%乙酸稀釋),50μl/孔,于室溫下靜置染色30分鐘后傾去srb溶液,用1%乙酸沖洗4遍,以除去未與蛋白質(zhì)結(jié)合的染料。置于空氣中風(fēng)干至無水痕后,加入10mm未緩沖tris(緩血氨酸)溶液150μl/孔(ph10,用三蒸水配制),將染料溶解后,于振蕩器上振蕩5分鐘,用酶標(biāo)儀在570nm波長下讀取各孔o(hù)d值。

(c)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：經(jīng)對白血病急性早幼粒nb4細(xì)胞、肺腺癌a549細(xì)胞、人骨髓神經(jīng)母細(xì)胞瘤shsy5y細(xì)胞、人前列腺癌pc3細(xì)胞、人乳腺癌mcf7細(xì)胞的細(xì)胞毒活性實(shí)驗(yàn)，香豆素1對a549和mcf7細(xì)胞株具有較好的細(xì)胞毒活性，ic50值分別達(dá)3.2和2.8μm。