本發明屬于抗癌藥物設計、合成領域，具體涉及香豆素衍生物及其制備方法和應用。
背景技術：
隨著城市化、工業化進程的加速，環境污染和食品安全問題日益突出，加之人們不良生活方式和行為習慣的影響，癌癥已成為嚴重影響人類健康、威脅人類生命的重大疾病之一，是人類在二十一世紀期待攻克的主要難題之一。癌癥不僅給病人造成身體和精神上的折磨，還給患者家庭帶來巨大的經濟和精神壓力，同時造成勞動力的巨大損失和社會資源的驚人消耗，因此如何治愈這一嚴重威脅人類生命的疾病，減少病人的痛苦，已成為全世界各國的首要任務。
化學治療(chemotherapy)，簡稱化療，是目前使用最廣泛的一類治療癌癥以及非癌癥疾病的方法，主要是利用化學合成類藥物來實現對疾病的治療。常用的抗腫瘤化療藥有阿霉素、柔紅霉素、絲裂霉素、氟脲嘧啶脫氧核、順鉑等。這些小分子化合物除了可以通過被動運輸或者借助于載體的方式進入細胞內以外，還可以通過與一些親和試劑如DNA當中的嘌呤結合進入細胞內部，抑制腫瘤細胞的DNA復制和轉錄，最終導致細胞周期停滯或引發細胞凋亡，達到化療的目的，化療在臨床腫瘤治療方面已經取得了顯著的效果。
香豆素是一類重要的天然香料，大量存在于自然界的一些植物如黑香豆、胡蘿卜、芹菜、香菜以及柑橘類當中，對人類的健康有很大的幫助。由于香豆素具有成本低且副作用小的特點而被用作補充和替代藥物，被用于抗菌、抗病毒、抗癌、抗炎、抗氧化和抗凝等方面。經過對腎癌細胞的體外活性研究表明，7-羥基香豆素不僅具有非常好的細胞毒性而且也是有效的細胞生長抑制劑，這種香豆素對幾種人癌細胞系(如胃癌、結腸癌、肝癌細胞系以及淋巴癌細胞系)和異種移植模型都有非常好的體外活性。低聚乙二醇單甲醚是一種兩親性分子，在香豆素衍生物上引入低聚乙二醇單甲醚可以改善香豆素衍生物的兩親性，提高香豆素衍生物的生物相容性。本發明致力于合成一系列香豆素衍生物，并研究了它們的離體抗腫瘤活性。
技術實現要素：
本發明的目的在于提供一類香豆素衍生物及其制備方法和應用，通過小分子哌嗪和低聚乙二醇單甲醚鏈的引入，使得所制得的香豆素衍生物具有良好的兩親性，這有利于藥物在生物體內的代謝和細胞對藥物的攝取；從而得到了一種具有較高生物相容性，毒副作用小，抗癌活性高的新藥；本發明合成的化合物結構單一，產品容易提純；合成方法比較簡單，副反應少，產率較高，原料易得，成本低，有利于工業化生產。
為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：
一、一種香豆素衍生物，具有通式Ⅰ的結構：
，n=1～3
制備方法包括以下步驟：
（1）以化合物、炔丙醇為起始原料，合成化合物1，其結構式為：
（2）接著以化合物，n=1～3和化合物1為起始原料，合成化合物Ⅰ。
具體制備方法為：
步驟（1）具體制備方法為：將化合物、炔丙醇、三苯基磷和DEAD按摩爾比為1:2:2:5加入到50 mL圓底燒瓶中，以無水四氫呋喃作溶劑，冰浴下反應1小時，然后轉到室溫反應過夜；反應完全后，減壓蒸餾除去溶劑，所得粗產物以二氯甲烷-甲醇為洗脫劑經硅膠柱色譜純化分離后得到化合物1，產率為50%-58%；
步驟（2）具體制備方法為：將化合物，n=1～3和化合物1按摩爾比2:1加入至7 mL DMF和水的混合液中，然后再將0.1-1當量的CuSO4·5H2O、0.2-2當量的抗壞血酸鈉加入至混合液中，室溫下劇烈攪拌24小時；反應液用CH2Cl2 和水萃取；有機層經無水Na2SO4 干燥后減壓旋干；然后以二氯甲烷-甲醇為洗脫劑，硅膠柱層析分離得到化合物Ⅰ，產率為75%-80%。所述的DMF和水的混合液中：DMF和水的體積比為6:1。
所述的香豆素衍生物Ⅰ，均可用于制備化學治療的藥物。
化學治療是目前使用最廣泛的一類治療癌癥以及非癌癥疾病的方法，主要是利用化學合成類藥物來實現對疾病的治療。常用的抗腫瘤化療藥有阿霉素、柔紅霉素、絲裂霉素、氟脲嘧啶脫氧核、順鉑等。香豆素是一類重要的天然香料，對人類的健康有很大的幫助。香豆素不僅具有非常好的細胞毒性而且也是有效的細胞生長抑制劑，這種香豆素對幾種人癌細胞系(如胃癌、結腸癌、肝癌細胞系以及淋巴癌細胞系)和異種移植模型都有非常好的體外活性。本發明合成了一系列香豆素衍生物，母體通過用哌嗪和聚乙二醇單甲醚修飾從而增加了其抗癌活性和生物相容性。
本發明具有以下突出優點：
（1）合成路線設計合理，步驟簡單，反應容易實現，副反應少，產率高，分離純化簡單；
（2）該系列香豆素衍生物具有較強的抗癌活性，有利于化學治療；
（3）兩親性基團的引入提高了抗癌藥物的生物相容性，使得其具有較好的抗腫瘤效果；
（4）產物結構單一，組分明確，所用原料低廉，易于實現工業化生產。
具體實施方式
以下具體實施例進一步詳細闡述關于本發明中相關化合物的制備過程、純化方法、理化性質表征以及離體抗腫瘤活性測試，以便全面理解本發明，但不以任何方式限制此發明，本發明并不僅局限于以下實例。
實施例1（n=1）
（1）向50 mL圓底燒瓶中加入25 mL無水四氫呋喃，然后將該反應瓶置于冰水浴中，加入三苯基磷 (2.05 g，7.82 mmol)，攪拌溶解后依次加入化合物 (1.43 g，5.21 mmol)、炔丙醇 (0.61 mL，10.43 mmol)和DEAD(4.1 mL，26.05 mmol)；所得混合物在氮氣保護下，室溫攪拌過夜；TLC檢測反應完全后，減壓蒸餾除去溶劑，所得粗產物以二氯甲烷-甲醇 (15:1，v/v)為洗脫劑經硅膠柱色譜分離純化得白色固體 (0.94 g，58％)。
結構表征：1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ7.50 (d, J = 8.8 Hz, 1 H, ArH), 6.91 (m, 2 H, ArH), 4.74 (d, J = 2.4 Hz, 2 H, CH2C≡C-), 3.17 (br s, 4 H, NCH2), 2.62 (br s, 4 H, NCH2), 2.55 (t, J = 2.4 Hz, 1 H, CH≡C-), 2.46 (s, 3 H, CH3), 2.42 (s, 3 H, CH3)；高分辨質譜[HRMS (ESI)]：C18H20N2O3理論計算值 (m/z[M+H+])為313.1552，實際測試值為313.1545。
（2）向10 mL的圓底燒瓶中加入1 mL水，再加入抗壞血酸鈉 (30 mg，0.15 mmol) 和五水硫酸銅 (15 mg，0.06 mmol)，所得混合物在氮氣保護下攪拌5分鐘，再往上述溶液中加入用6 mL DMF溶解的化合物 (0.09 g，0.62 mmol)和 (0.10 g，0.31 mmol)，氮氣保護下室溫反應24 h；TLC檢測反應完全后，將DMF旋干，并用二氯甲烷和少量甲醇溶解，將溶液轉移到分液漏斗中，加水，用30 mL二氯甲烷萃取3次，合并有機相并用無水硫酸鈉干燥。過濾掉無水硫酸鈉，減壓旋蒸除去溶劑，粗產物用二氯甲烷-甲醇(10:1, v/v)為洗脫機經硅膠柱色譜純化后，得淺黃色固體 (0.11 mg，78﹪)。
結構表征：1H NMR (400 MHz, CDCl3)：δ8.05 (s, 1 H, triazole-H), 7.72 (d, J = 8.8 Hz, 1 H, ArH), 7.38 (m, 2 H, ArH), 5.66 (s, 2 H, OCH2) 4.82 (t, J = 4.8 Hz, 2 H, CH2), 4.05 (t, J = 4.8 Hz, 2 H, CH2), 3.68-3.70 (m, 2 H, CH2), 3.43-3.46 (m, 2 H, CH2), 3.26 (s, 3 H, CH3), 3.17 (br s, 4 H, NCH2), 2.84 (br s, 4 H, NCH2), 2.48 (s, 3 H, CH3), 2.29 (s, 3 H, CH3); 高分辨質譜[HRMS (ESI)]：C18H20N2O3理論計算值 (m/z[M+H+])為457.2325，實際測試值為457.2316。
實施例2（n=2）
（1）向10 mL的圓底燒瓶中加入1 mL水，再加入抗壞血酸鈉 (30 mg，0.15 mmol)和五水硫酸銅 (15 mg，0.06 mmol)，所得混合物在氮氣保護下攪拌5分鐘，再往上述溶液中加入用6 mL DMF溶解的化合物 (0.13 g，0.70 mmol)和 (0.11g，0.35 mmol)，氮氣保護下室溫反應24 h。TLC檢測反應完全后，將DMF旋干，并用二氯甲烷和少量甲醇溶解，將溶液轉移到分液漏斗中，加水，用30 mL二氯甲烷萃取3次，合并有機相并用無水硫酸鈉干燥。過濾掉無水硫酸鈉，減壓旋蒸除去溶劑，粗產物用二氯甲烷-甲醇(10:1，v/v)為洗脫機經硅膠柱色譜純化后，得淺黃色固體 (0.13 mg，70﹪)。
結構表征：1H NMR (400 MHz, CDCl3)：δ7.72 (s, 1 H, triazole-H), 7.62 (d, J = 8.8 Hz, 1 H, ArH), 7.05 (m, 2 H, ArH), 5.86 (s, 2 H, OCH2), 4.42 (t, J = 4.8 Hz, 2 H, CH2), 3.95 (t, J = 4.8 Hz, 2 H, CH2), 3.78-3.80 (m, 2 H, CH2), 3.68-3.74 (m, 4 H, CH2), 3.52-3.56 (m, 2 H, CH2), 3.45 (s, 3 H, CH3), 3.18 (br s, 4 H, NCH2), 2.74 (br s, 4 H, NCH2), 2.54 (s, 3 H, CH3), 2.48 (s, 3 H, CH3); 高分辨質譜[HRMS (ESI)]：C18H20N2O3理論計算值 (m/z[M+H+])為501.2587，實際測試值為501.2577。
實施例3（n=3）
（1）向10 mL的圓底燒瓶中加入1 mL水，再加入抗壞血酸鈉 (30 mg，0.15 mmol)和五水硫酸銅 (15 mg，0.06 mmol)，所得混合物在氮氣保護下攪拌數分鐘，再往上述溶液中加入用6 mL DMF溶解的化合物 (0.2 g，0.86 mmol)和 (0.13 g，0.43 mmol)，氮氣保護下室溫反應24 h；TLC檢測反應完全后，將DMF旋干，并用二氯甲烷和少量甲醇溶解，將溶液轉移到分液漏斗中，加水，用30 mL二氯甲烷萃取3次，合并有機相并用無水硫酸鈉干燥。過濾掉無水硫酸鈉，減壓旋蒸除去溶劑，粗產物用二氯甲烷-甲醇(10:1，v/v)為洗脫機經硅膠柱色譜純化后，得淺黃色固體 (0.17 mg，72﹪)。
結構表征：1H NMR (400 MHz, CDCl3)：δ7.68 (s, 1 H, triazole-H), 7.53 (d, J = 8.8 Hz, 1 H, ArH), 6.93 (m, 2 H, ArH), 5.36 (s, 2 H, OCH2) 4.22 (t, J = 4.8 Hz, 2 H, CH2), 3.89 (t, J = 4.8 Hz, 2 H, CH2), 3.74-3.76 (m, 2 H, CH2), 3.64-3.70 (m, 4 H, CH2), 3.60-3.61 (m, 4 H, CH2), 3.54-3.56 (m, 2 H, CH2), 3.38 (s, 3 H, CH3), 3.20 (br s, 4 H, NCH2), 2.65 (br s, 4 H, NCH2), 2.49 (s, 3 H, CH3), 2.44 (s, 3 H, CH3); 高分辨質譜[HRMS (ESI)]：C18H20N2O3理論計算值 (m/z[M+H+])為545.2849，實際測試值為545.2835。
應用實例 1
對本發明實施例1-3所制得的化合物的離體光動力抗腫瘤活性進行了初步探究，為今后在體實驗研究提供重要的參考，具有重要的研究價值；化合物的離體光動力抗腫瘤活性是通過細胞毒性實驗來完成的，所用方法是MTT法；MTT法的原理是活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT（3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽）還原為不溶于水的藍紫色結晶甲瓚（Formazan）并沉積在細胞中，而死細胞中因無琥珀酸脫氫酶而不產生甲瓚。用二甲基亞砜（DMSO）溶解活細胞產生的甲瓚，用多功能酶標儀測定其在570 nm波長處的吸收值（OD值），可間接反映活細胞數量。在一定細胞數范圍內，MTT甲瓚形成的量與活細胞數成正比。對本發明所涉及到的化合物的細胞毒性進行了研究，并獲得了各個化合物對人胃癌細胞BGC-823的半數抑制濃度即IC50值，由此可以初步判斷藥物的抗腫瘤活性。
MTT實驗具體過程包括：取處于對數期且生長狀態良好的人胃癌細胞BGC-823，用0.25%胰蛋白酶消化傳代，吹打均勻后用DMEM培養基（含10%小牛血清）配制成3×103cells/ mL細胞懸浮液，每孔加100 μL細胞懸浮液（約含3000個腫瘤細胞）接種于96孔培養板內，于37℃，5% CO2培養箱內培養過夜。實驗設陽性對照組即空白對照組和陰性對照組即溶劑對照組。先將實施例1-3制得的香豆素衍生物配制成DMSO儲備液，使用前用DMEM將藥物稀釋為7個不同濃度，終溶液中 DMSO的含量為1%。每個濃度設定6個平行孔，每孔加入200 μL不同濃度的藥物后置于培養箱內孵育。細胞毒性實驗：加藥孵育24小時后，棄去上層培養基，加入100 μL不含藥的新鮮培養基，置于培養箱內繼續培養。24 h后，每孔加入MTT的PBS溶液（5 mg·mL-1）10 μL，37℃孵育4小時，小心棄去上層溶液，向每孔中加入100 μL DMSO溶解甲瓚，于搖床中震蕩15分鐘使甲瓚完全溶解后，用多功能酶標儀測定570 nm波長處OD值。
通過MTT法探索了實施例1-3制得的化合物對人胃癌細胞BGC-823的殺傷效果。所得數據經三次平行實驗后由GraphPad Prism 5.0統計分析軟件處理得到，結果以Mean±SD來表示。由實驗結果可知，3種化合物都對人胃癌細胞BGC-823表現出強的殺傷作用，其半數抑制濃度見表1。比較研究發現，鏈的長短對化合物的活性沒有明顯的影響。研究表明，所述的系列香豆素衍生物都具有較強的抗癌活性。
表1 實施例1-3制得的香豆素衍生物對人胃癌細胞BGC-823的IC50值
以上所述僅為本發明的較佳實施例，凡依本發明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發明的涵蓋范圍。